，，，， *，(. ， 0008；.烏審旗獸醫(yī)局， 07300；3. ， 0008)

狂蠅科屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)，昆蟲綱(Insecta)，雙翅目(Diptera)，短角亞目(Brachycera)，從古北區(qū)到亞熱帶，分布于世界各地范圍內，幼蟲引發(fā)感染。由于狂蠅科不同的種屬，寄主與寄生部位也不同，如動物呼吸道、腸道及皮下組織等能引起人類和動物的強制性蠅蛆病。蠅蛆病對動物福利和動物生產力具有嚴重影響，是造成畜牧業(yè)重大經濟損失的一大因素。另外，有些狂蠅科幼蟲引起的蠅蛆病能夠在動物表皮和內部感染，導致動物健康受到危害甚至造成死亡。

狂蠅科根據現(xiàn)有常規(guī)分類法分為四個亞科，即狂蠅亞科、皮蠅亞科、胃蠅亞科及蛆蠅亞科，其中含有一百多個已被鑒定的種屬[1]。盡管形態(tài)學分類在昆蟲分類系統(tǒng)中一直占主導地位, 但由于受個體發(fā)育階段的形態(tài)特征、環(huán)境條件及標本材料等因素的限制, 一些昆蟲種類的地位分類和進化關系不易確定。分子信息作為形態(tài)分類的必要補充可提供具有連續(xù)性、可度量性、相對恒定性的分類和進化依據，且分子進化速率可反映物種進化變異的積累和進化距離。

細胞色素C氧化酶亞基I(COⅠ)位于線粒體基因上，是分子系統(tǒng)遺傳標記基因，其分子量最大、基因成穩(wěn)定狀、基因排列及功能結構相對保守，普遍為母系遺傳，極少發(fā)生重組等，因而被廣泛用于進化、系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳結構、基因漂流、雜交和生物地理學等方面的研究[2]。COⅠ基因包含電子傳遞和跨膜反應兩種，其范圍包括配體位點、質子通道的合成、螺旋結構及散布的親水性環(huán)狀鏈等不同形式和功能區(qū)域。COⅠ 基因不但保證一定程度的變異而且又很容易被通用引物擴增，其基因序列本身很少存在插入和缺失[3]。在DNA序列上比其他蛋白編碼基因變異慢，包含的系統(tǒng)發(fā)育信號多，所以相比之下更適合用來分析親緣關系密切的分類種群間的遺傳關系。同時,COⅠ基因同其他蛋白編碼基因共有某些特征，如密碼子第3位堿基不受自然選擇壓力的影響，可以自由突變[4]。因此，在實踐中絕大多數昆蟲類相互區(qū)分的遺傳標記選作線粒體基因組COⅠ基因5'端的區(qū)域，其長度在400到700堿基對，相鄰的保守序列使得這個區(qū)域易于擴增及分析[5]。本文針對狂蠅科線粒體COⅠ基因分子信息學研究概況、研究進展等進行總結概括，為今后更多狂蠅科昆蟲研究及蠅蛆病的研究提供參考。

1 狂蠅科昆蟲線粒體基因組及COⅠ基因的特點

1.1 線粒體基因組

線粒體廣泛存在于昆蟲體內，在控制昆蟲新陳代謝、生命周期、凋亡和病害等方面起著積極作用。細胞中線粒體的位置常臨近于需要ATP的結構或者處于細胞進行氧化作用需要的燃料附近，如昆蟲的飛行肌中和卵內。同其他雙翅目昆蟲一樣，狂蠅科昆蟲線粒體基因具有閉合雙鏈DNA結構，大小一般在14～20 kb之間, 線粒體基因組上的多數基因在J鏈上編碼 ( majority strand) ，少數基因在N鏈上編碼 ( minority strand)[6]。其中穩(wěn)定的包含有13個編碼蛋白基因分別為細胞色素C氧化酶亞基I、II、III(即CO I、CO II、CO III)，細胞色素b脫輔基酶(cytb)，ATP合成酶亞基6和8(atp 6和atp 8),NADH脫氫酶亞基1-6(nad1-6)和4L(nad4l)； 22 個tRNA 基因，包含18 個( trnA、trnR、trnN、trnD、trnC、trnQ、trnE、trnG、trnH、trnI、trnK、trnM、trnF、trnP、trnT、trnW、trnY 和trnV) 分別對應18 種不同的氨基酸，特殊的是絲氨酸( Ser)和亮氨酸( Leu) 的tRNA 對應2個，分別是trnL1( CUN)、trnL2( UUR)及trnS1( UCN )、trnS2( AGN)；2個 rRNA 基因rrnL 和rrnS分別編碼大亞基16S ( 16S rRNA) 和小亞基12S( 12S rRNA)[3]。

1.2 線粒體COⅠ基因結構與基因排列

COI氨基酸序列由五個結構二十五個區(qū)域組成，12個跨膜螺旋區(qū)(M1-M12)、6個外環(huán)區(qū)(E1-E6)、5個內環(huán)區(qū)(I1-I5)、羧基(COOH)及氨基終端(NH2)(見圖1)[7]。圖中方形區(qū)域具有特殊實用性作用，跨膜螺旋區(qū)M2、M6、M7和M10在COⅠ基因主要反應中提供配位金屬離子，即血紅素與銅原子之間互相作用反應。M8也是高度保守區(qū)域之一，與色素氧化酶質子傳遞途徑有關聯(lián)。此區(qū)域包含三個極性氨基酸殘基(thr-352、thr-359和lys-362)，這三個氨基酸殘基在生物體內呈完全保守狀態(tài),且在傳遞活動中起著必不可少的作用[8]。

圖1 昆蟲COⅠ基因的二維模型圖[7]填充的小圈為變異率高區(qū) Fig.1 A two-dimensional model of the insect COⅠ gene Filled circles represent residues observed to be variable between insect species

2 狂蠅科昆蟲線粒體COⅠ基因組的堿基組成及變異相關系數

特異性靶基因區(qū)域COⅠ基因作為區(qū)分狂蠅科的有力工具，不單單為種屬的鑒定而提供資料，還為昆蟲界的系統(tǒng)發(fā)育研究有所貢獻。結合Clary、Crozier、Howland 等的研究顯示，狂蠅科昆蟲與其他昆蟲線粒體基因(mtDNA)一樣，由于第三密碼子穩(wěn)定的偏向性支持腺嘌呤和胸腺嘧啶，因而核苷酸成分顯示A+T含量顯著高，占60%以上[9]。Otranto等[10]早在2003對狂蠅科昆蟲mtDNA基因COⅠ 序列688位點作出系統(tǒng)分析，其中含有385保守性位點和303可變位點，在可變位點中有48單獨位點和255簡約信息的變異位點。狂蠅總科內多數種屬在第三位點同義替換較多，高達86%但不會影響氨基酸成分，核苷酸變異率在整個有效區(qū)域都很高(303/688)。多數第三密碼子位點變異性最強；第一、二位點保守性強，且非同義替換大多數發(fā)生在第一位點達到28.4%(見表1)[11]。

3 狂蠅科昆蟲線粒體COⅠ基因進化速率

綜合Gennis、lunt和 Caterino的研究可推測，狂蠅科昆蟲COⅠ基因羧基區(qū)域(COOH)氨基酸變異率高于跨膜螺旋區(qū)(M)、外環(huán)區(qū)(E)、內環(huán)區(qū)(I)及氨基終端(NH2)。該區(qū)域相關的幾個重要的功能域M5-M8顯示低水平變異率。跨膜螺旋區(qū)M3、M9、M12變異率高；外環(huán)區(qū)E3、E5尤其E4為極度保守區(qū)，內環(huán)區(qū)內I1相比另四個區(qū)顯著保守(見圖2)。Lunt等[7]在昆蟲COⅠ基因研究中運用kruskal-wallis檢驗(KW test)，測得結果為拒絕零假設成立，即氨基酸平均變異率、各個位點變異率及五個結構階層之間變異率存在顯著差異。當五個結構域的每個堿基位點被計算其變異率時COOH羧端變異率比其他任何區(qū)域都高，且氨基終端、跨膜螺旋區(qū)、內環(huán)區(qū)及外環(huán)區(qū)變異率無顯著差異(見表2) 。

表1 狂蠅科線粒體COⅠ基因同義替換和非同義替換百分比，變異位點、簡約信息位點及自裔位點的位置Table 1 Percentage of synonymous and non-synonymous substitutions and variable, informative and singleton sites occurring in total sequences at different codon positions of the COI region examined

4 mtCOI基因在狂蠅科昆蟲分子系統(tǒng)學研究中的應用

相比狂蠅科昆蟲龐大的物種數，目前已完成線粒體COⅠ基因測序的狂蠅科種類還很少，因而獲得更多狂蠅科昆蟲線粒體COⅠ基因序列顯得極為迫切。隨著測序技術的發(fā)展，研究者應針對狂蠅科的更多種屬，特別是具有經濟意義的種屬，獲得其線粒體COⅠ基因序列，通過對堿基組成、進化速率、基因重排規(guī)律及其產生的原因等方面的分析，深入了解狂蠅科昆蟲線粒體COⅠ基因的進化趨勢和特征，并在此基礎上選擇更佳的分析手段進行后續(xù)的起源進化、系統(tǒng)發(fā)育、種類鑒定、種群溯源以及數據庫與網站建設等研究，為我國及全球狂蠅入侵防控提供客觀準確的依據與技術支持，應用前景廣闊。綜合研究結果，顯示COⅠ基因能夠用于研究雙翅目狂蠅科各類群昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育關系和進化模式，驗證傳統(tǒng)分類方法、建立物種的自然系統(tǒng)和進化關系，對物種的區(qū)別鑒定、發(fā)現(xiàn)物種隱存種、研究物種分岐分化及遺傳多樣性有積極作用[12]。線粒體COⅠ基因的研究是對狂蠅總科進化模式的鑒定，甚至可以在不久的將來研究宿主與環(huán)境之間的關系起著至關重要的數據依據。

圖2 昆蟲COⅠ基因各個區(qū)域平均變異率Fig. 2 The mean amino acid variability for the twenty-five structural regions of the insect COⅠ gene

4.1 mtCOⅠ基因在起源和進化研究中的應用

在狂蠅科種屬或在更高的水平中，COⅠ基因的研究更有意義。分子學數據構成一個基因數據庫對分化時間較早的屬、種及種下物種和地理種群等進行系統(tǒng)發(fā)育研究提供鑒定物種的有效依據。2003年，Otranto等[13]基于線粒體COⅠ基因建立了狂蠅科18個種屬的的系統(tǒng)發(fā)育樹，并估算狂蠅科昆蟲線粒體COⅠ核苷酸的進化速率。表明18種狂蠅科昆蟲歸類于4個亞科，本結論與形態(tài)學及生物學分類法得出結論相一致[13]；無脊椎動物每百萬年(my)±0.5 my核苷酸置換率大約為2%[14]，鑒于此資料可以推測出狂蠅科亞科間分岐時間，例如皮蠅科H.tarandi與HypodermaactaeonBrauer分歧時間為8.2±0.5 my，或者可以看出G.intestinalis和G.haemorrhoidalis、C.stimulator和C.trompe等物種分裂形成的時期。楊曉野等[15]對馴鹿狂蠅蠅蛆及其成蠅的COI 基因特異性序列進行比較分析，結果為COⅠ基因核苷酸序列在某程度上，可以反映出種屬及株間進化程度。

4.2 mtCOⅠ基因種群遺傳多樣性及作為DNA條形碼的應用

早前研究表明，Oestrus.ovis與伊伯利亞野生山羊狂蠅科昆蟲在形態(tài)學及生物學上有著極大相似性[16-17]，但要鑒定其種類此數據資料遠遠不夠。在此研究的基礎上，Moreno等[18]對伊伯利亞野生山羊狂蠅科昆蟲COⅠ 基因進行擴增，測序結果與GenBank上的其他Oestrus.ovis對比相似度在90.3%～91.5%。基于Otranto等[10]關于COⅠ基因種屬鑒定數據：COⅠ基因序列在狂蠅科種間相似值為81.9%，亞科間相似水平分別為皮蠅亞科86.8%、狂蠅亞科86.7%、胃蠅亞科90%、蛆蠅亞科 94.7%，推斷此伊伯利亞野生山羊寄生昆蟲與Oestrus.ovis屬于同一個亞科，但絕不是同一個種類。

2004年，Otranto和Traversa[19]用分子鑒定法得出三個Przhevalskiana種的COⅠ基因序列的種間差異在0.19%～0.29%，結合前期研究得出的結論，狂蠅科種間差異高于6%且種內差異低于1%，推測Przhevalskianasilenus、Przhevalskianaaegagri和Przhevalskianacrossii屬于狂蠅科內同一個物種。

Moreno等[18]對幾個地方品種及野生綿羊、山羊寄生的狂蠅科昆蟲DNA條形碼COⅠ序列進行研究，測得狂蠅科線粒體COⅠ基因的96個新序列(登記在GenBank，KP974835-KP974930)，與數據庫的羊狂蠅有效CO I序列(GenBank AF497767)比較，顯示相似度在98.1%～99.5%之間，由此可以鑒定屬于同一個屬。

Yong等[20]利用線粒體COⅠ基因對皮蠅科昆蟲進行遺傳多樣性及群體遺傳學研究，具體對CO I序列變異度、基因多樣性、基因分化、種群結構及種群發(fā)生分岐時間做出了系統(tǒng)的結論。此研究對今后的研究給予了數據及資料參照，有利于對狂蠅科昆蟲的形態(tài)學、生物地理信息及分子系統(tǒng)發(fā)育方面做出更完整的研究。

5 展 望

新一代測序技術為開展大規(guī)模線粒體基因組的研究提供了良好的契機，能夠快速、高效地獲得大量線粒體基因組序列。此技術有助于對更多狂蠅科昆蟲進行線粒體COⅠ基因測序，但對測序物種種類以及規(guī)模的增加和基礎原數據的積累仍是目前昆蟲線粒體COⅠ基因組研究發(fā)展的首要工作。總之,對線粒體COⅠ基因組在狂蠅科昆蟲系統(tǒng)進化研究中的價值還未進行系統(tǒng)評價, 這是今后需著重努力的方向。同時, 還應將線粒體基因組數據與核基因及形態(tài)學特征等數據結合起來進行綜合分析, 共同推動狂蠅科昆蟲的系統(tǒng)進化研究。

今后在對動物疫病臨床檢疫、診斷方面，可以利用線粒體CO I技術開展流行病學調查，對病原媒介生物等進行分型鑒定、類癥鑒別，對動物蠅蛆病進行診斷、鑒定、分類等等，此研究有助于養(yǎng)殖工作人員增強對動物疾病的預防和控制。

參考文獻：

[1] 魏書軍,陳學新.昆蟲比較線粒體基因組學研究進展[J].應用昆蟲學報,2011,48(6):1 573-1 585.

[2] 郭仲龍,袁明龍.半翅目昆蟲線粒體基因組學研究進展[J].中國科學:生命科學,2016,46(2):151-166.

[3] 王鑫，黃兵．DNA條形編碼技術在動物分類中的研究進展[J]．生物技術通報，2006(4)：67-72．

[4] 馬英，魯亮．DNA條形碼技術研究新進展[J]．中國媒介生物學及控制雜志，2010，21(3)：275-280．

[5] 田應峰,王東林,苗永旺.DNA條形碼技術及其在畜牧獸醫(yī)上的應用[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2016(5):47-50.

[6]SIMON C,FRATI F,BECKENBACH A,et al.Evolution，weighting and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers[J]．Ann Entomol Soc Am，1994，87( 6) : 651-701.

[7] LUNT D H, ZHANG D-x, SZYMURA J M, et al. The insect cytochrome oxidase I gene: evolutionary patterns and conserved primers for phylogenetic studies[J]. Insect Molecular Biology, 1996, 5(3): 153-165.

[8] GENNIS R B. Site-directed mutagenesis studies on subunit I of the aa3-type cytochrome c oxidase of Rhodobacter sphaeroides: a brief review of progress to date[J]. Biochimica et Biophysica acta, 1992, 1101(2): 184-187.

[9] OTRANTO D, MILILLO P, TRAVERSA D, et al. Morphological variability and genetic identity in Rhinoestrus spp. causing horse nasal myiasis[J]. Medical & Veterinary Entomology, 2005, 19(1):96-100.

[10] OTRANTO D,MILILLO P,TRAVERSA D，et al. Morphological variability and genetic identity in Rhinoestrus spp.Causing horse nasal myiasis[J].Medical & Veterinarg Entomology,2005,19(1):96-100.

[11] HOWLAND D E, HEWITT G M. Phylogeny of the coleoptera based on mitochondrial cytochrome oxidase I sequence data[J]. Insect Molecular Biology, 1995, 4(3): 203-215.

[12] 池宇,王詩迪,張春田. 基于線粒體COⅠ基因的雙翅目昆蟲研究進展[J]. 昆蟲分類學報,2010,32(S):71-77.

[13] OTRABTI D, TRAVERSA D, Guida B, et al. Molecular characterization of the mitochondrial cytochrome oxidase I gene of Oestridae species causing obligate myiasis[J]. Medical & Veterinary Entomology, 2003, 17(3):307-315.

[14] POWELL J R, CACCONE A, AMATO G D, et al. Rates of nucleotide substitution in Drosophila mitochondrial DNA and nuclear DNA are similar[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1986, 83(23):9 090-9 093.

[15] 楊曉野，李云章，包巴音倉，等. 馴鹿狂蠅(Cephenemyiatrompe)線粒體COⅠ基因序列研究[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2006，28(5):514-517.

[16] GUITTON C, PEREZ J M, DORCHIES P. Scanning electron microscopy of larval instars and imago of Oestrus caucasicus (Grunin, 1948) (Diptera: Oestridae)[J]. Parasite-journal De La Societe Francaise De Parasitologie, 2001, 8(2):155-160.

[17] PéREZ J M, GRANADOS J E, MORENO V, et al. In vitro rearing Oestrus caucasicus third-instar larvae and pupae (Diptera: Oestridae) from naturally-infested Iberian ibex, Capra Pyrenaica (Artiodactyla: Bovidae)[J]. Parasite-journal De La Societe Francaise De Parasitologie, 2006, 13(4):305.

[18] MORENO V, ROMEROFERNNDEZ I, MARCHAL J A, et al. Molecular characterization of bot flies, Oestrus spp. (Diptera, Oestridae), from domestic and wild Bovidae hosts[J]. Veterinary Parasitology, 2015, 212(3-4):473-477.

[19] OTRANTO D,TRAVERSA D. Molecular Przhevalskiana silensus, Przhevalskiana Przhevalskiana acrossii (Diptera, Oestridae) are one species[J]. Acta Parasitologia，2004,49:173-176.

[20] YONG F, WEI L, HONG D, et al. Genetic diversity and population genetics of the warble flies Hypoderma bovis and H. sinense in Qinghai Province, China[J]. Parasites & Vectors, 2016, 9(1):1-9.