羅素賢，葉 昱＊，周信榮，陳燕君， 宋德平*，彭 棋，唐玉新*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西省畜禽疫病診斷與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

乳酸菌屬于益生菌，主要存在于動(dòng)物體腸道和陰道內(nèi)[1]。它能改善腸道微環(huán)境，提高飼料利用率，促進(jìn)動(dòng)物生長性能[2]，還能刺激免疫細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，使機(jī)體免疫力持續(xù)處于較高水平[3]。隨著我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)中飼料添加抗生素產(chǎn)生的副作用日益明顯，乳酸菌因其益生菌的功能而作為“綠色添加劑”獲得廣泛研究及應(yīng)用[4]。鼠李糖乳桿菌是近年來研究最熱門的乳酸菌之一，在腸道酸性環(huán)境定植，可以調(diào)節(jié)腸道菌群，預(yù)防和治療腹瀉，并且在機(jī)體排出毒素、預(yù)防齲齒和增強(qiáng)免疫等方面效果良好[5]。本試驗(yàn)以鼠李糖乳桿菌為對(duì)象，通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)和生長曲線等方面的測(cè)定，旨在確定鼠李糖乳桿菌生長最佳溫度和最佳起始pH，探究溶氧量以及不同收獲時(shí)間點(diǎn)對(duì)其生長的影響，了解鼠李糖乳桿菌體外培養(yǎng)的生長周期，為進(jìn)一步研究乳酸菌菌群和乳酸菌作為飼料添加劑應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中提供良好的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 菌種鼠李糖乳桿菌(LGG)JX-1，由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)教研室保存。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌微量生化反應(yīng)管為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；脫脂奶粉為天津伊利乳業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 MRS液體培養(yǎng)基：稱取MRS培養(yǎng)基粉末48 g，加入1 L水，充分?jǐn)嚢枞芙?。MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入質(zhì)量濃度為18 g/L的瓊脂粉。

1.1.4 儀器設(shè)備 生化培養(yǎng)箱(型號(hào)：SPX-80 BSH-Ⅱ)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司生產(chǎn)；紫外可見分光光度計(jì)(型號(hào)：UV754N)，上海佑科儀器儀表有限公司生產(chǎn)；pH計(jì)(型號(hào)：PHS-3C)，上海儀電分析儀器有限公司生產(chǎn)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察 觀察固體培養(yǎng)基中菌落的特點(diǎn)；經(jīng)革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)[6]。

1.2.2 生化試驗(yàn) 本研究使用微量生化反應(yīng)管進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)；在種子液上滴加體積分?jǐn)?shù)為3%～5%過氧化氫溶液，觀察3～5 min進(jìn)行過氧化氫試驗(yàn)[7]。

1.2.3 細(xì)菌生長最佳溫度確定 本試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)溫度變量，分別在35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃和43 ℃培養(yǎng)乳酸菌。將活化好的鼠李糖乳桿菌按2%的量接種入5個(gè)錐形瓶中，每個(gè)溫度重復(fù)3次，將錐形瓶分別標(biāo)號(hào)并各置于5個(gè)溫度條件下培養(yǎng)7 h后取出少量菌液，測(cè)定菌液OD600[8]，探索鼠李糖乳桿菌的最適體外培養(yǎng)溫度。

1.2.4 細(xì)菌生長初始pH確定 本試驗(yàn)在最適溫度條件下培養(yǎng)細(xì)菌。以初始pH為變量，設(shè)置6組pH值，分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。每個(gè)錐形瓶中加入等量MRS培養(yǎng)基，鹽酸溶液和碳酸鈉溶液標(biāo)定培養(yǎng)基至上述pH值，pH計(jì)測(cè)量并校準(zhǔn)，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后降至室溫。按2%接種量將活化好的鼠李糖乳桿菌菌種液接入MRS培養(yǎng)基，每個(gè)pH重復(fù)3次，放入生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 h后取出，測(cè)定各組OD600，確定最佳pH值。

1.2.5 溶氧量對(duì)細(xì)菌生長的影響 震蕩培養(yǎng)基溶氧量高，靜置培養(yǎng)基溶氧量低[9]。本試驗(yàn)在最適溫度和pH條件下培養(yǎng)細(xì)菌，通過震蕩培養(yǎng)(220 r/min)和靜置培養(yǎng)兩種方式改變?nèi)苎趿窟M(jìn)行研究。以2%活化的菌種液分別接入MRS培養(yǎng)基，每種方式重復(fù)3次，分別放入恒溫培養(yǎng)箱和震蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h和7 h取出測(cè)定OD600值。

1.2.6 細(xì)菌生長曲線繪制 在500 mL三角瓶中加入200 mL MRS培養(yǎng)基，2%接種量，在最適溫度和pH條件下靜置培養(yǎng)16 h，每2 h進(jìn)行OD600測(cè)定、培養(yǎng)物的pH值測(cè)量及采用梯度稀釋平板法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。使用Excel統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，計(jì)算并繪制pH、OD600變化曲線和細(xì)菌生長曲線。

2 結(jié)果分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征和染色結(jié)果

細(xì)菌JX-1株的菌落呈淡黃色(圖1)，直徑約1 mm的半圓形凸起，表面光滑、濕潤，菌落邊緣整齊，散發(fā)輕微酸味。革蘭氏染色后置于100倍油鏡下觀察結(jié)果如圖2，菌體革蘭氏染色陽性，外形呈桿狀，符合鼠李糖乳桿菌形態(tài)學(xué)特性[10]。

圖1 細(xì)菌JX-1株菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of the JX-1 strain

圖2 革蘭氏染色細(xì)菌形態(tài)(100×)Fig.2 Bacterial morphology with Gram staining(100×)

2.2 生理生化特征鑒定

過氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果顯示，無氣泡產(chǎn)生，呈陰性。經(jīng)過生理生化特征檢測(cè)(表1)，結(jié)果表明該菌能利用果糖、鼠李糖、淀粉、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、甘露糖、靛基質(zhì)、蕈糖，不能還原硝酸鹽，不液化明膠。

綜合生化鑒定、形態(tài)學(xué)分析和過氧化氫酶試驗(yàn)的結(jié)果，根據(jù)《伯杰氏鑒定細(xì)菌手冊(cè)》及《乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》判斷該菌為鼠李糖乳桿菌[11]。

表1 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

“+”為陽性；“-”為陰性

“+” means positive;“-” means negative

2.3 最適生長溫度

溫度高于或低于最適生長溫度，生長速率都會(huì)隨之下降[9]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在35～43 ℃內(nèi)，鼠李糖乳桿菌均能生長(圖3)。而且隨著溫度的升高，鼠李糖乳桿菌的生長呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，其菌體量在39 ℃達(dá)到峰值(OD值為1.158)。隨著培養(yǎng)溫度進(jìn)一步升高，鼠李糖乳桿菌菌體生長呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。以上結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌的最適培養(yǎng)溫度為39 ℃。

2.4 最佳起始pH值結(jié)果

圖4所示的起始pH結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌適合于中性偏酸性環(huán)境下生長，其中以6.0的初始pH最佳。當(dāng)初始pH高達(dá)8.0時(shí)，鼠李糖乳桿菌的繁殖受到較大影響，其菌液OD600值與pH 6.0相差0.595。

圖4 初始pH對(duì)鼠李糖乳桿菌生長影響Fig.4 Growth curve of LGG on various initial pH

2.5 溶氧量影響結(jié)果

分別測(cè)定了靜置培養(yǎng)和震蕩培養(yǎng)兩種培養(yǎng)方式對(duì)鼠李糖乳桿菌生長的影響，其4 h和7 h的菌液OD600差值分別為0.045和0.178(表2)，且4 h時(shí)靜置培養(yǎng)的菌體量顯著高于震蕩培養(yǎng)(P=0.039 4)，7 h時(shí)靜置培養(yǎng)的菌體量極顯著高于震蕩培養(yǎng)(P=0.05)。本試驗(yàn)結(jié)果說明，溶氧量較高的震蕩培養(yǎng)，不利于鼠李糖乳桿菌生長。

表2 不同培養(yǎng)方式的生長結(jié)果

*表示差異5%水平顯著性，**表示差異1%水平顯著性。

* significant at 0.05 level,** significant at 0.01 level.

2.6 生長曲線繪制結(jié)果

從圖5可知，鼠李糖乳桿菌繁殖引起培養(yǎng)基pH值降低，說明其生長代謝產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)(乳酸)。與其他很多微生物不同，除了營養(yǎng)物質(zhì)消耗等因素制約外，乳酸菌還受代謝過程產(chǎn)酸而形成對(duì)自身的酸抑制的影響。細(xì)菌代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸溶于培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)時(shí)間逐漸積累，造成菌體周圍環(huán)境pH值下降，嚴(yán)重干擾乳酸菌正常代謝，抑制其繁殖。在圖5中，OD600值曲線呈S形，說明菌體存在一個(gè)加速繁殖到平穩(wěn)生長的時(shí)期，而pH值曲線顯示在菌體加速繁殖時(shí)期乳酸也在大量產(chǎn)生。以上結(jié)果反映了菌體加速生長引起產(chǎn)生乳酸，大量乳酸積累反過來降低菌體生長速率的現(xiàn)象。

圖5 pH、OD600變化曲線 Fig.5 The curves show pH and OD changes with the culture of LGG

圖6 生長曲線Fig.6 Growth curve of LGG

如圖6所示，活菌量計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)0～2 h，鼠李糖乳桿菌接種培養(yǎng)基后適應(yīng)新環(huán)境，經(jīng)歷遲緩期；2～4 h細(xì)菌生長進(jìn)入對(duì)數(shù)期，以指數(shù)級(jí)速度增殖，菌量上升最快，4 h時(shí)菌量達(dá)到108cfu/mL。而OD600值曲線顯示6～8 h總菌數(shù)上升最快；并且在6 h時(shí)，活菌量高而OD600值較低，可能與該階段菌體較小導(dǎo)致OD600測(cè)量值偏低有關(guān)。因此，鼠李糖乳桿菌生物量的實(shí)時(shí)檢測(cè)時(shí)，活菌量的變化較OD600曲線準(zhǔn)確?；罹颗cOD600曲線測(cè)定均顯示，10 h后，隨著營養(yǎng)物質(zhì)消耗，乳酸含量升高，活菌數(shù)上升逐漸減弱，OD600值上升趨勢(shì)逐漸平緩，說明該菌群進(jìn)了穩(wěn)定期。

3 討 論

鼠李糖乳桿菌是乳酸菌群中一員，是最常用的益生菌，也是最具代表性的菌株[12]。它能抗氧化、促吸收，從而提高機(jī)體免疫力，對(duì)于生產(chǎn)生活也有十分積極的作用[13]。然而發(fā)揮益生作用不僅僅需要代謝產(chǎn)物，菌體活性也十分關(guān)鍵?；钚跃w進(jìn)入動(dòng)物胃腸道后，將部分蛋白質(zhì)、糖類和維生素等降解成小分子物質(zhì)，促進(jìn)動(dòng)物體吸收營養(yǎng)[14]。所以在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，研究鼠李糖乳桿菌生長特性與菌體活性的關(guān)系，有助于該菌的工業(yè)化生產(chǎn)與實(shí)踐應(yīng)用。本試驗(yàn)繪制生長曲線采用活菌計(jì)數(shù)、OD600值測(cè)定和pH值測(cè)定同時(shí)進(jìn)行，旨在充分展示鼠李糖乳桿菌生長過程中活菌數(shù)、總菌數(shù)和產(chǎn)酸程度之間的聯(lián)系。結(jié)果表明溫度39 ℃、pH值6.0靜置培養(yǎng)6 h，活菌數(shù)占總菌數(shù)比重最高，產(chǎn)酸速率隨培養(yǎng)時(shí)間累積逐漸加快。

在不考慮溶氧量影響的情況下，培養(yǎng)基營養(yǎng)分布越均勻，細(xì)菌的長勢(shì)越好。震蕩培養(yǎng)條件下，營養(yǎng)分布較靜置培養(yǎng)更加均勻，但試驗(yàn)結(jié)果顯示鼠李糖乳桿菌更適宜靜置培養(yǎng)，上述結(jié)論與古元懿[9]的試驗(yàn)結(jié)果相一致，說明靜置和震蕩兩種培養(yǎng)方式創(chuàng)造了相對(duì)不同的溶氧量環(huán)境，而且溶氧量環(huán)境對(duì)鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)的影響較大。

參考楊子萱等[15]研究結(jié)果，按2%接種鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)7 h，取樣測(cè)定OD600值反映菌液長勢(shì)情況。上述方法與陳佩等[10]培養(yǎng)18 h不同。因此，上述因素可能導(dǎo)致了本試驗(yàn)最佳溫度與其研究結(jié)果的不同，說明鼠李糖乳桿菌在37 ℃與39 ℃的生長曲線可能呈交叉的“S”形，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，最適溫度會(huì)有所降低，具體的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。另外，大多數(shù)家畜、家禽的體溫均高于37 ℃。本試驗(yàn)最適溫度結(jié)果能夠更好地模仿鼠李糖乳桿菌在動(dòng)物體腸道內(nèi)的溫度環(huán)境。因此，繪制39 ℃的生長曲線可能較37 ℃更具實(shí)際意義。

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