韓 彤，楊彩霞，付晶晶，廖一鳴，呂雙玉，賈 苒，石長玉

(沈陽大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院/遼寧省城市有害生物治理與生態(tài)安全重點試驗室，遼寧 沈陽 110044)

豆科(Leguminosae)菜豆屬(PhaseolusL.)植物均為重要的食用作物，在我國廣為栽植。但是，菜豆屬植物栽培常受到植物病毒的干擾，其中最具破壞性的是菜豆普通花葉病毒(Beancommonmosaicvirus,BCMV)[1]。BCMV是一種世界性分布的馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)病毒[2]。該病毒最早由美國Stewart和Reddick在菜豆上分離到[3]，后由Pierce將其命名為BCMV[4]。BCMV的基因組是一條全長約9.6～10 kb的正義單鏈RNA，結(jié)構(gòu)特征與典型的Potyvirus成員相同，其5′端具共價結(jié)合金屬蛋白(virus genome-linked protein,VPg)，3′端具有Poly(A)尾巴[5]，中間序列編碼一個長的多聚蛋白，隨后切割產(chǎn)生8～10個產(chǎn)物參與病毒的復(fù)制、運(yùn)動和包裝。BCMV傳播方式多樣，主要經(jīng)蚜蟲非持久性傳播[6-7]，還可通過機(jī)械接種、種子和花粉傳毒。自然條件下可侵染多種菜豆屬植物，試驗條件下還能侵染藜科、茄科、莧科、豆科、番杏科等9個科、44個屬的約100多種植物[8-14]。受侵染植物的病害癥狀主要受病毒株系、環(huán)境條件和寄主植物3個方面的影響，通常表現(xiàn)性狀為花葉皺縮、葉片變窄或卷曲，豆莢斑駁或畸形[15]。2016年，在遼寧蓋州地區(qū)發(fā)現(xiàn)疑似病毒侵染的菜豆樣品，通過RT-PCR試驗，明確了侵染菜豆的病毒為BCMV。本文首次報道了遼寧BCMV分離物的分子特征。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2015年8月，于遼寧省采集表現(xiàn)黃化癥狀的菜豆植物樣品，保存于-80 ℃超低溫冰箱備用(圖1)。

1.2 試驗方法

圖1 表現(xiàn)黃化癥狀的菜豆Fig.1 The yellow symptoms showing on thePhaseolus vulgaris L. plants

1.2.1 植物總 RNA 提取 取黃化的菜豆葉片100 mg，在研缽中加入液氮后迅速研磨至粉末狀，使用RNASimple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取菜豆葉片的總RNA。

1.2.2 病毒的RT-PCR檢測 對菜豆病葉的總RNA進(jìn)行提取后，用TIAN Script RT Kit(天根生化科技(北京)有限公司)進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成。以cDNA為模板，先后參照Potyvirus屬通用引物L(fēng)egpoty-F/Legpoty-R[16]和BCMV特異性引物BCMV-CP-F/BCMV-CP-R[17]對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成)。PCR反應(yīng)體系為25 μL，設(shè)定PCR程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，試驗進(jìn)行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用10 g/L瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，將目的條帶用TIANgel Midi Purification Kit(天根生化科技(北京)有限公司)回收試劑盒回收和純化。回收產(chǎn)物與pMD-18T(寶生物工程(大連)有限公司)克隆載體在16 ℃下進(jìn)行連接3 h后，轉(zhuǎn)入DH5α菌株的感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h后，均勻的涂在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行過夜培養(yǎng)16 h。挑取單菌落，至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，280 r/min，37 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)7 h。培養(yǎng)結(jié)束后取2 μL菌液進(jìn)行PCR鑒定。將陽性樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序。

1.2.3 序列分析 測序結(jié)果及數(shù)據(jù)處理等借助DNAStar(DNASTAR Inc.，Madison，USA)和DNAMAN Version 6.0(LynnonBiosoft，Quebe Canada)軟件完成。利用NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國國立生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫的BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源序列搜索。采用DNAStar的Clustal V程序進(jìn)行同源性分析。利用Clustal_X version 1.83[18]進(jìn)行完全比對后再用軟件MEGA version 5.13[19]的最大似然法繪制親緣關(guān)系樹，設(shè)置種子重復(fù)數(shù)是1 000。分支節(jié)點上的數(shù)值為后驗概率，高于50%顯示。用于序列比較和關(guān)系樹構(gòu)建的病毒序列信息見表1。

表1 BCMV 3個遼寧分離物與其它報道BCMV分離物的cp基因的氨基酸序列同源性

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測結(jié)果

M：Marker DL2000；1-5：Legpoty-F/Legpoty-R引物擴(kuò)增結(jié)果；6-10：BCMV-CP-F/BCMV-CP-R引物擴(kuò)增結(jié)果；4和9是健康植物樣品；5和10是水為對照M：Marker DL2000；lanes 1-5 are results amplified with Legpoty-F/Legpoty-R；lanes 6-10 are results amplified with BCMV-CP-F/BCMV-CP-R;4 and 9 are healthy plants control;5 and 10 are water control圖2 菜豆病葉的BCMV病毒RT-PCR檢測結(jié)果Fig.2 Detection of BCMV virus in Phaseolus vulgaris L.diseased leaves by RT-PCR

利用Legpoty-F/Legpoty-R引物[16]對菜豆病葉的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增得到約725 bp的目的片段，而健康菜豆中沒有檢測到該片段。Blast檢測顯示該片段與BCMV高度同源。于是，利用已報道的BCMV特異性引物BCMV-CP-F/BCMV-CP-R引物[17]繼續(xù)擴(kuò)增，獲得長約1.2 kb的片段，包含了完整的外殼蛋白基因(coat protein,cp)(圖2)。

2.2 序列分析

蓋州的3個菜豆樣品上BCMV分離物CP基因均為861 bp(GenBank登錄號是MF361092-MF361094)，編碼287個氨基酸，氨基酸同源性為100%。3個分離物與已經(jīng)報道的BCMV的同源性分析顯示，它們均與BCMV的美國艾奧瓦州菜豆分離物BCMV-[USA:Iowa:Phaseolus vulgaris](KM023744)同源性最高，為97.9%，其次是與印度菜豆分離物BCMV-[India:Phaseolus vulgaris](KF114860)同源性為97.6%，與英國菜豆分離物BCMV-[EN:Phaseolus vulgaris](AY112735)同源性為96.9%，與澳大利亞分離物BCMV-[AUS:Macroptiliumatropurpureum](EU761198)同源性為96.5%。與中國分離物同源性在91.3%～95.8%，其中最高的是BCMV-[CN:soybean](KC832501)95.8%，其次是BCMV-[CN:ZJ:cowpea](NC_003397)、BCMV-[CN:mung bean](KC832502)和BCMV-[CN:ZJ:cowpea](AJ312437)，均為94.8%(表1)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，BCMV沒有明顯的聚類限制，它們主要聚類在兩個分支上，蓋州3個分離物與BCMV-[CN:mung bean](KC832502)、BCMV-[AUS:Macroptiliumatropurpureum](EU761198)、BCMV-[India:Phaseolus vulgaris] 和BCMV-[USA:Iowa:Phaseolus vulgaris](KM023744)聚集在一個分支上，而其他中國分離物與韓國分離物聚集在另一個分支上。

圖3 基于已報道的BCMV cp基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹Fig.3 Phylogenetic trees based on cp sequences of the previously reported BCMV

3 結(jié)論與討論

本研究在遼寧蓋州地區(qū)的菜豆上分離鑒定到BCMV病毒，通過RT-PCR檢測、克隆和測序，獲得完整的cp基因?；赾p基因的同源性比較，發(fā)現(xiàn)3個分離物與BCMV的美國艾奧瓦州菜豆分離物BCMV-[USA:Iowa:Phaseolusvulgaris](KM023744)同源性最高，為97.9%。根據(jù)國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)第9次報告中的馬鈴薯Y病毒的分類標(biāo)準(zhǔn)，cp基因氨基酸序列相似性小于80%，或者核苷酸序列相似性小于76%，可認(rèn)為是不同病毒種[5]。因此，侵染菜豆病毒是BCMV的遼寧分離物，這是遼寧首次報道菜豆上自然存在BCMV病毒。

BCMV是眾多能自然侵染豆科植物病毒中危害性最強(qiáng)的，BCMV具有寄主范圍廣泛、傳毒效率較高、傳播方式多樣等特點，極易造成豆科植物特別是菜豆的減產(chǎn)甚至絕收，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的危害。近年來，BCMV先后從中國的浙江、臺灣、山東、南京、湖北的豇豆、綠豆、黑眼豇豆、扁豆、花生和芝麻[20-24]上分離出來，但在遼寧未見BCMV相關(guān)報道。菜豆等豆科作物在遼寧普遍種植，這些作物是否也受到BCMV的侵染和危害? 本研究經(jīng)過試驗確定遼寧菜豆黃化病害相關(guān)病毒是BCMV。后續(xù)將加大對遼寧地區(qū)BCMV病害調(diào)查范圍，提供更多BCMV遼寧分離物序列信息，為BCMV的防治提供重要的理論依據(jù)。

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