郭威濤周俊國(guó)吳長(zhǎng)柳柴阿麗李寶聚*

（1河南科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

加工番茄是普通番茄中的一種栽培類型，其番茄紅素、可溶性固形物、胡蘿卜素含量高，可深加工為番茄醬、番茄干、番茄粉等制品。目前加工番茄主要生產(chǎn)國(guó)為美國(guó)、法國(guó)、希臘、意大利等，美國(guó)是主要消費(fèi)國(guó)家，年人均消費(fèi)量為33 kg（李君明 等，2001）。近年來我國(guó)對(duì)番茄制品的需求日益增大，2014年全國(guó)加工番茄種植面積達(dá)7萬hm2。隨著加工番茄種植面積的擴(kuò)大、栽培管理措施及環(huán)境條件等影響，加工番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)?。≒seudomonas syringaepv. tomato）發(fā)生日趨嚴(yán)重，產(chǎn)量和品質(zhì)受到了影響。該病害自1933年首次報(bào)道以來，在全球各地均有發(fā)生，是一種嚴(yán)重危害全世界番茄生產(chǎn)的重要病害之一，可造成5%～75%的產(chǎn)量損失（Yunis et al.，1980）。近年在我國(guó)內(nèi)蒙古、甘肅、新疆等地發(fā)生，主要為害葉片、果實(shí)和莖稈（王曉輝 等，2006；李志棟，2010；柴阿麗 等，2014）。

選育抗病品種是一種高效且環(huán)保的防治番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的方法，篩選適宜的番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病人工接種鑒定方法是抗病品種選育的基礎(chǔ)（趙廷昌等，2000；張國(guó)麗 等，2011）。本試驗(yàn)采用噴霧法、涂抹法、灌根法、葉腋針刺法和莖上針刺法等5種接種方法對(duì)209份醋栗番茄品種進(jìn)行番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的抗性評(píng)價(jià)，以期建立加工番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)，并在此基礎(chǔ)上篩選出抗細(xì)菌性斑點(diǎn)病的醋栗番茄品種資源。

近年來，番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的防治主要以化學(xué)藥劑防治為主，由于菜農(nóng)長(zhǎng)期單一使用同一種藥劑，病菌易出現(xiàn)抗藥性，防治效果下降，菜農(nóng)在生產(chǎn)中超濃度、超劑量濫用農(nóng)藥的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，造成藥害和蔬菜、土壤農(nóng)藥殘留超標(biāo)，并對(duì)環(huán)境造成污染，導(dǎo)致蔬菜質(zhì)量和安全性的下降。隨著可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略的實(shí)施，使用微生物菌劑及其復(fù)配制劑防治細(xì)菌性斑點(diǎn)病是今后的主要發(fā)展方向（楊春泉，2008；范廣華 等，2011）。本試驗(yàn)選用23種微生物菌劑進(jìn)行室內(nèi)盆栽藥效試驗(yàn)，篩選出對(duì)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病有效的微生物菌劑，以期為微生物菌劑對(duì)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的預(yù)防、治療和推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：加工番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌丁香假單孢番茄致病變種（Pseudomonas syringaepv.tomato）具有強(qiáng)致病性的菌株，編號(hào)FQ13080301，保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所蔬菜綜合防治課題組。

供試培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar，NA）：蛋白胨10.0 g，牛肉粉3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15～25 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.0；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（nutrient broth，NB）：蛋白胨10.0 g，牛肉粉 3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH=7.0。NA固體培養(yǎng)基用于病原細(xì)菌單菌落劃線，獲得菌株純培養(yǎng)；NB液體培養(yǎng)基用于病原細(xì)菌擴(kuò)繁，制備接種菌懸液。

供試番茄品種為209份醋栗番茄（Solanum pimpinellifolium）種質(zhì)資源材料，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所加工番茄課題組提供。

供試藥劑為23種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）微生物菌劑，含活芽孢200億個(gè)·g-1，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所篩選制備。60%溴硝醇可濕性粉劑購(gòu)自遼寧省丹東市農(nóng)藥總廠，20%葉枯唑可濕性粉劑購(gòu)自山東利邦農(nóng)化有限公司，30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑購(gòu)自陜西美邦農(nóng)藥有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接種體制備 將保存的番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌菌株從4 ℃冰箱試管內(nèi)取出，使用已滅菌的接種環(huán)挑取單菌落，于NA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，然后置于細(xì)菌培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h，當(dāng)培養(yǎng)基上出現(xiàn)單菌落時(shí)挑取單菌落，轉(zhuǎn)移到NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃下260 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，用無菌水配制成濃度為1×108cfu·mL-1的菌懸液，備用。

1.2.2 不同接種方法比較 待醋栗番茄幼苗長(zhǎng)至3～4片真葉，使用上述制備好的濃度為1×108cfu·mL-1的菌懸液，分別采用噴霧、涂抹、葉腋針刺、莖上針刺、灌根等5種方法進(jìn)行接種。具體接種方法如下。

噴霧接種法：即用小型噴霧器將接種菌懸液均勻地噴霧到每片葉片的正反面，以不形成水滴流淌為度，以噴霧清水接種為對(duì)照（趙廷昌 等，2001）。

涂抹接種法：用毛筆蘸取菌懸液涂抹于葉片正反面，每株苗涂抹4片真葉并做好標(biāo)記，套袋保濕24 h（李志棟，2010），以涂抹清水接種為對(duì)照。

葉腋針刺接種法：用注射器吸取菌懸液針刺接種到植株葉腋處，每株苗注射3個(gè)葉腋處（劉秋 等，2002），以注射清水接種為對(duì)照。

莖上針刺接種法：用注射器吸取菌懸液針刺接種到主莖上，從下至上每隔1 cm進(jìn)行針刺，共針刺3處，以針刺清水接種為對(duì)照。

灌根接種法：在每株幼苗根部灌入50 mL菌懸液，以灌入清水接種為對(duì)照。

每種接種方法3次重復(fù)，每次重復(fù)20株。接種后將植株置于鑒定室內(nèi)保濕（RH為90%～100%）48 h，以后每天白天光照12～14 h，晚上繼續(xù)保濕（RH為80%～90%）。接種期內(nèi)溫度控制在白天26～28 ℃，晚上20～22 ℃，土壤濕度85%～90%。接種7 d后進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查。

1.2.3 醋栗番茄品種對(duì)細(xì)菌性斑點(diǎn)病的抗性鑒定

醋栗番茄幼苗長(zhǎng)至3～4片真葉期采用噴霧法接種209份醋栗番茄品種，以感病品種石番15號(hào)為對(duì)照。待對(duì)照發(fā)病后進(jìn)行病情分級(jí)調(diào)查。

1.2.4 醋栗番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病病情分級(jí)及抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 噴霧法和涂抹法接種，病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，葉片上無病斑；1級(jí)，0＜病斑面積≤5%；3級(jí)，5%＜病斑面積≤10%；5級(jí)，10%＜病斑面積≤25%；7級(jí)，25%＜病斑面積≤50%；9級(jí)，50%＜病斑面積≤100%（楊春泉，2008；韓盛 等，2010）。

噴霧法和涂抹法接種病情指數(shù)計(jì)算：

葉腋針刺法和莖上針刺法接種，病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無病斑；1級(jí)，植株輕度萎蔫，病斑≤0.5 cm；2級(jí)，植株50%葉片萎蔫，0.5 cm＜病斑≤1 cm；3級(jí)，除新葉外的其余葉片萎蔫，1 cm＜病斑≤2 cm；4級(jí)，葉片嚴(yán)重萎蔫，植株腐爛死亡。

灌根法接種，病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，未出現(xiàn)葉片萎蔫或莖壞死；1級(jí)，葉片輕度變黃或萎蔫；2級(jí)，葉片中度萎蔫或莖輕度壞死；3級(jí)，葉片嚴(yán)重萎蔫或莖嚴(yán)重壞死；4級(jí)，植株死亡。

葉腋針刺法、莖上針刺法和灌根法接種病情指數(shù)計(jì)算：

抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：免疫（I），病情指數(shù)為0；抗?。≧），0＜病情指數(shù)≤20；中抗（MR），20＜病情指數(shù)≤40；感?。⊿），40＜病情指數(shù)≤60；高感（HS），病情指數(shù)＞60。

1.2.5 微生物菌劑對(duì)醋栗番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的預(yù)防和治療效果評(píng)價(jià) 預(yù)防效果評(píng)價(jià)：于醋栗番茄幼苗3～4片真葉期，先噴霧微生物菌劑（含活芽孢0.2億個(gè)·g-1），對(duì)照藥劑為20%葉枯唑可濕性粉劑500倍液、60%溴硝醇可濕性粉劑800倍液、30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑（1 080 g·hm-2）。間隔24 h后采用噴霧法接種細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌。接種后放置于保濕柜里25～28 ℃下進(jìn)行常規(guī)管理，待清水對(duì)照發(fā)病后調(diào)查病情指數(shù)，并計(jì)算防效。

治療效果評(píng)價(jià)：于醋栗番茄幼苗3～4片真葉期，先采用噴霧法接種細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌，置于保濕柜中保濕處理。接種24 h后，噴霧微生物菌劑（含活芽孢0.2億個(gè)·g-1），對(duì)照藥劑為20%葉枯唑可濕性粉劑500倍液、60%溴硝醇可濕性粉劑800倍液、30%琥膠肥酸銅可濕性粉劑（1 080 g·hm-2）。待清水對(duì)照發(fā)病后調(diào)查病情指數(shù)，并計(jì)算防效。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft 2010軟件和SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病不同接種方法比較

由表1和圖1可以看出，采用噴霧法和涂抹法進(jìn)行接種，番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病發(fā)病率高達(dá)100.00%，接種3 d后表現(xiàn)癥狀；灌根法、莖上針刺法和葉腋針刺法接種的發(fā)病率分別為73.33%、86.67%和76.67%，潛育期為4～5 d。5種接種方法中，采用噴霧法、莖上針刺法接種的平均病情指數(shù)都高于65，顯著高于葉腋針刺法，且二者的植株發(fā)病率均高于80%，但莖上針刺法的植株發(fā)病率低于噴霧法，且操作較復(fù)雜。綜合盆栽試驗(yàn)結(jié)果，噴霧法是加工番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定技術(shù)的最佳接種方法，簡(jiǎn)單有效，適用于種質(zhì)資源材料的抗性鑒定。

表1 番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病不同接種方法比較

圖1 番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病不同接種方法的發(fā)病情況

表2 209份醋栗番茄品種細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性鑒定結(jié)果

表3 23種新型生物殺細(xì)菌劑對(duì)加工番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的防治效果

2.2 醋栗番茄品種對(duì)細(xì)菌性斑點(diǎn)病的抗性鑒定

采用噴霧法接種209份醋栗番茄品種，接種3 d后葉片上產(chǎn)生深褐色至黑色不規(guī)則斑點(diǎn)，斑點(diǎn)周圍有時(shí)會(huì)出現(xiàn)黃色暈圈。接種7 d后調(diào)查番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病發(fā)病情況，209份醋栗番茄品種均發(fā)病，但發(fā)病程度有差異（表2），其中中抗品種22份，感病品種57份，高感品種130份，未發(fā)現(xiàn)免疫和抗病品種，對(duì)照石番15號(hào)的病情指數(shù)＞90，屬高感品種。

2.3 微生物菌劑對(duì)細(xì)菌性斑點(diǎn)病的防治效果

從表3可以看出，在對(duì)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的預(yù)防效果上，3種微生物菌劑芽孢IVF 018號(hào)、芽孢IVF 002號(hào)和芽孢IVF 021號(hào)防效最佳，防效分別為100.00%、97.50%和82.50%；芽孢IVF 004號(hào)和芽孢IVF 020號(hào)的防效也達(dá)到或超過60%。在治療效果上，微生物菌劑IVF 018號(hào)和IVF 021號(hào)的防效最佳，防效分別為71.25%和61.67%；芽孢IVF 035號(hào)和芽孢IVF 024號(hào)的防效也達(dá)到或超過50%。

試驗(yàn)結(jié)果表明，芽孢IVF 018號(hào)菌劑和IVF 021號(hào)菌劑的預(yù)防和治療效果較好，且預(yù)防效果明顯高于治療效果，可作為防治番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的備選藥劑。

3 結(jié)論與討論

番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病由丁香假單胞番茄致病變種侵染引起，在番茄幼苗期至收獲期都可以發(fā)生，為害番茄的葉、莖、花、葉柄和果實(shí)（趙廷昌 等，2001），該病害一旦發(fā)生，傳播速度很快，嚴(yán)重影響加工番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)，給生產(chǎn)帶來一定的經(jīng)濟(jì)損失。

番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌可以侵染番茄葉片、葉柄和莖稈，病原菌可以在土壤中存活至少7個(gè)月（Blancard，2012），成為翌年初侵染源，根據(jù)病害癥狀和初侵染源，筆者選擇了噴霧法、涂抹法、葉腋針刺法、莖上針刺法和灌根法進(jìn)行接種。其中，噴霧法、涂抹法和葉腋針刺法的操作方法和發(fā)病癥狀與已報(bào)道方法相同（趙廷昌 等，2000；楊春泉，2008；李志棟，2010）。而灌根法和莖上針刺接種法尚未見報(bào)道，筆者采用這兩種方法接種后，發(fā)病植株分別表現(xiàn)為莖段和莖基部變黑褐色，與田間自然發(fā)病癥狀相同。本試驗(yàn)采用5種方法接種后，加工番茄植株都表現(xiàn)出相應(yīng)癥狀，發(fā)病率均在70%以上，后續(xù)應(yīng)用中可以根據(jù)不同的需求選擇不同的接種方法。在品種抗病性評(píng)價(jià)和生物菌劑篩選中，選擇應(yīng)用噴霧法，接種后發(fā)病率為100%，平均病情指數(shù)66.56，且操作簡(jiǎn)單，發(fā)病均勻。

醋栗番茄是番茄的野生種，與其他野生種相比，醋栗番茄與栽培番茄（S. lycopersicum）的親緣關(guān)系最近（Grandillo et al.，2011），可與栽培種直接雜交，而且具有抗生物脅迫和非生物脅迫的特性。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從醋栗番茄品種中鑒定出多個(gè)抗真菌和細(xì)菌病害的基因，其中抗真菌病害的基因包括高抗枯萎病的I基因和I2基因（Stall & Walter，1965）， 抗 灰 葉 斑 病 的Sm基 因（Bashi et al.，1973），抗晚疫病的Ph-1、Ph-2、Ph-3和Ph-5基因（Chunwongse et al.，2002；Merk et al.，2012）；抗細(xì)菌病害的基因包括抗細(xì)菌性斑點(diǎn)病的pto、pti和prf基 因（Pitblado et al.，1984；Stockinger &Walling，1994），抗細(xì)菌性瘡痂病的Rx-4基因（Robbins et al.，2009）等。鑒于醋栗番茄抗性資源易于轉(zhuǎn)育和利用，筆者對(duì)209份醋栗番茄品種進(jìn)行細(xì)菌性斑點(diǎn)病抗性評(píng)價(jià)篩選，鑒定出中抗品種22份，占鑒定總數(shù)的10.52%，感病品種57份，占鑒定總數(shù)的27.27%，高感品種130份，占鑒定總數(shù)的62.20%。雖然本試驗(yàn)沒有獲得抗性種質(zhì)資源，但是積累的方法可以為以后抗性資源鑒定提供技術(shù)支持。

加工番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病傳播侵染速度快，一旦發(fā)生很難防治。目前以使用化學(xué)農(nóng)藥防治為主，生產(chǎn)中常用的藥劑有氫氧化銅、噻菌靈、噻唑鋅、中生菌素等（趙廷昌 等，2004；李寶聚 等，2008）。由于防治藥劑單一，種植戶缺乏用藥安全意識(shí)，存在過量濫用農(nóng)藥的現(xiàn)象，導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，造成對(duì)環(huán)境的極大破壞。隨著人們環(huán)境保護(hù)意識(shí)的提高，使用新型微生物菌劑為主的防治措施研究應(yīng)用漸多（王文橋 等，2011；路粉和王文橋，2017）。芽孢桿菌（Bacillussp.）是目前生防細(xì)菌中研究較多的一類，因其能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機(jī)溶劑的內(nèi)生孢子，是理想的生防菌篩選對(duì)象（Emmert & Handelsman，1999；Ye et al.，2013）。本試驗(yàn)從23種微生物菌劑中篩選出對(duì)加工番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病預(yù)防和治療效果最佳的芽孢IVF 018號(hào)、芽孢IVF 021號(hào)菌劑，預(yù)防和治療效果分別達(dá)到100.00%、82.50%和71.25%、61.67%，預(yù)防效果高于治療效果，說明田間防治應(yīng)以預(yù)防為主。微生物菌劑防治番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病具有環(huán)保、安全、成本低、控制效果顯著、持效期長(zhǎng)等特點(diǎn)，既能有效控制該病害的發(fā)生及為害，又能避免化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境和蔬菜產(chǎn)品的污染（魏春妹和張春明，1994；董艷 等，2015）。本試驗(yàn)篩選出的微生物菌劑芽孢IVF 018號(hào)和芽孢IVF 021號(hào)，有望成為加工番茄細(xì)菌性病害防治的高效菌劑。

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