孟 瑋，宗治國，史曉宇，張 敬，趙峻峰

(1.河北北方學(xué)院附屬第一院腫瘤內(nèi)科，河北 張家口 075000； 2.河北北方學(xué)院附屬第一院骨外科，河北 張家口 075000)

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，近年來由于人們生活方式轉(zhuǎn)變、環(huán)境變化及遺傳因素的影響，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展與癌基因的激活、抑癌基因的失活密切相關(guān)[3-4]。miRNA是一類小分子的非編碼RNA，能夠結(jié)合于靶基因的mRNA 3’UTR區(qū)域，參與細(xì)胞的增殖、分化與凋亡等[5-6]。miRNA在腫瘤中被分為“原癌miRNA”或者“抑癌miRNA”，進而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3- 4]。miR-126在肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌等多種癌組織中低表達(dá)，因此被認(rèn)為是一種抑癌miRNA，但在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體機制報道較少[7-8]。同時SOX2是一種高度保守的能夠維持胚胎干細(xì)胞功能的核轉(zhuǎn)錄因子，有研究表明SOX2可能是miR-126的下游靶基因[9-10]，因此本研究將探討miR-126是否能夠通過靶向調(diào)控SOX2表達(dá)影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖與凋亡。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

結(jié)腸癌SW480細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，目錄號TCHu172。

1.2 主要試劑與儀器

miR-126 mimics和miR-126 NC均購于上海吉馬生物技術(shù)有限公司；兔抗人SOX2及GAPDH多克隆抗體均購于美國Abcam公司；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基均購于美國Hyclone公司；BCA蛋白測定試劑盒，MTT均購于南京凱基生物技術(shù)有限公司；Trizol總RNA提取試劑盒，LipofectamineTM3000脂質(zhì)體，一步法miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于大連寶生生物技術(shù)有限公司；重組質(zhì)粒pGL-3 SOX2 3’UTR-Wt及pGL-3 SOX2 3’UTR-Mut購于廣州銳博生物技術(shù)有限公司。

DYCZ-40D型轉(zhuǎn)印電泳儀均購于北京六一儀器廠；Mini-PROTEAN#1658000小型垂直電泳儀，GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)購于美國伯樂公司；MK3型酶標(biāo)儀，F(xiàn)ACSCanto II型流式細(xì)胞儀均購于美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 miRNA的轉(zhuǎn)染

當(dāng)SW480細(xì)胞密度達(dá)到50%時候，利用LipofectamineTM3000脂質(zhì)體將miR-126 mimics和miR-126 NC轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞并于6 h后換液，再繼續(xù)培養(yǎng)48 h，RT-PCR法檢測細(xì)胞中miR-126的表達(dá)。

1.3.2 RT-PCR法檢測細(xì)胞中miR-126表達(dá)

根據(jù)Trizol試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，并檢測總RNA的純度，接著根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳。反應(yīng)體系：Rnase 9.5 μL，模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，UItraSYBR Mixture 12.5 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性：95℃，5 min；變性：95℃，20 s；退火：50℃，30 s；延伸：72℃，30 s。引物序列如下：miR-126:上游引物：5′-GCUCGUACCGUGAGUA AU-3′，下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′，SOX2:上游引物：5′-GCTACAAGACAACACCCTGAT-3′，下游引物：5′-CAATCTCCTAAGCCACGAG-3′，GAPDH：上游引物 5′-TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′，下游引物：5′-GCTGGTG GTCCAGGGGTCTTACT-3′。

1.3.3 MTT法檢測細(xì)胞活力

將5×103個SW480細(xì)胞接種到96孔板并培養(yǎng)24 h，按“1.3.2”進行轉(zhuǎn)染48 h后，加入20 μL終濃度為5 mg/mL的MTT孵育4 h后，棄去上清液，繼續(xù)加入150 μL 二甲基亞砜，震蕩10 min，在酶標(biāo)儀570 nm處測吸光值。

1.3.4 Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡情況

將8×103個SW480細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，按“1.3.2”進行轉(zhuǎn)染48 h后，每組收集1×105/mL個細(xì)胞，再加入結(jié)合緩沖液吹打混勻后，依次加入5 μL的Annexin V-FITC及PI，繼續(xù)吹打混勻，并于室溫避光孵育10 min，于1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上進行細(xì)胞凋亡分析。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

將8×103個SW480細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，按“1.3.2”進行轉(zhuǎn)染48 h后，每組收集1×105/mL個細(xì)胞，加入RNase吹打混勻后于室溫下孵育1 h，再加入PI染液于室溫下孵育30 min，在流式細(xì)胞儀上進行細(xì)胞周期分析。

1.3.6 Western blot檢測細(xì)胞中SOX2表達(dá)

將8×103個SW480細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，按“1.3.2”轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞并裂解，離心得到上清液就是總蛋白，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白煮沸10 min變性后，制作濃縮膠及分離膠，室溫水封30 min。30 ng樣品上樣后進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，PVDF濕法轉(zhuǎn)膜。2%的BSA室溫下孵育1 h，一抗溶液(兔SOX2及GAPDH多克隆抗體，稀釋度為1∶100)4℃過夜孵育，第2天在室溫條件下，于二抗溶液孵育1～2 h，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.3.7 熒光素酶報告基因表達(dá)分析

將miR-126 mimics+pGL-3 SOX2 3’UTR-Wt，miR-126 NC+ pGL-3 SOX2 3’UTR-Wt，miR-126 mimics+ pGL-3 SOX2 3’UTR-Mut，miR-126 NC+ pGL-3 SOX2 3’UTR-Mut四組重組載體轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞，采用雙熒光素酶系統(tǒng)檢測酶活性。計算公式：相對熒光值=螢火蟲熒光素梅熒光值/海腎熒光素梅熒光值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

表1 miR-126 mimics對SW480細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響Tab.1 Effect of miR-126 mimics on SW480 cell apoptosis and cell cycle

注：與miR-126 NC比較，**P< 0.01。

Note.Compared with the miR-126 NC,**P< 0.01.

2 結(jié)果

2.1 miR-126 mimics轉(zhuǎn)染效果的檢測

miR-126 mimics和miR-126 NC轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞48 h后，與miR-126 NC組(0.14±0.01)比較，miR-126 mimics組(0.92±0.08)中miR-126表達(dá)量顯著上調(diào)(P< 0.01)。

圖1 miR-126 mimics轉(zhuǎn)染效果的檢測Fig.1 Transfection effects of miR-126 mimics

2.2 miR-126 mimics對SW480細(xì)胞活力的影響

miR-126 mimics和miR-126 NC轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞24、48、72 h后，與miR-126 NC組比較，miR-126 mimics組細(xì)胞活力逐漸降低(P< 0.01)。

注：與miR-126 NC比較，**P< 0.01。圖2 miR-126 mimics對SW480細(xì)胞活力的影響Note.Compared with miR-126 NC, **P< 0.01.Fig.2 Effect of miR-126 mimics on SW480 cell viability

2.3 miR-126 mimics對SW480細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響

如圖3，圖4及表1所示，miR-126 mimics和miR-126 NC轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞48 h后，與miR-126 NC組比較，miR-126 mimics組細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率均顯著提高(P< 0.01)，且細(xì)胞周期阻滯于G1期(P< 0.01)。

圖3 miR-126 mimics對SW480細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of miR-126 mimics on SW480 cell apoptosis

圖4 miR-126 mimics對SW480細(xì)胞周期的影響Fig.4 Effect of miR-126 mimics on SW480 cell cycle

2.4 報告基因分析

將miR-126 mimics+pGL-3 SOX2 3’UTR-Wt，miR-126 NC+ pGL-3 SOX2 3’UTR-Wt，miR-126 mimics+ pGL-3 SOX2 3’UTR-Mut，miR-126 NC+ pGL-3 SOX2 3’UTR-Mut四組重組載體轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-126 mimics+pGL-3 SOX2 3’UTR-Wt組熒光強度最低(P< 0.01)，其它幾組熒光強度差異無顯著性(P> 0.05)。

注：與miR-126 NC比較，**P< 0.01。圖6 miR-126 mimics對SW480細(xì)胞中SOX2表達(dá)的影響Note.Compared with the miR-126 NC, **P< 0.01.Fig.6 Effect of miR-126 mimics on the expression of SOX2 in SW480 cells

注：與miR-126 NC比較，**P< 0.01。圖5 報告基因分析Note.Compared with the miR-126 NC, **P< 0.01.Fig.5 Reporter gene analysis

2.5 miR-126 mimics對SW480細(xì)胞中SOX2蛋白及mRNA表達(dá)量的影響

如圖6所示，miR-126 mimics和miR-126 NC轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞48 h后，與miR-126 NC組比較，miR-126 mimics組SOX2蛋白及mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)(P< 0.01)。

3 討論

miRNA是一類高度保守的能夠與靶基因3’UTR區(qū)域結(jié)合的非編碼RNA分子，進而負(fù)性調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞的增值、分化與凋亡。研究發(fā)現(xiàn)miRNA基因組主要位于腫瘤基因的脆性區(qū)，因此常作為癌基因或者抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-4]。2003年Michael等[6]學(xué)者首次報道了結(jié)腸癌中存在差異性表達(dá)的miRNA(miR-143及miR-145)，其表達(dá)量顯著下調(diào)，且發(fā)現(xiàn)G蛋白γ7和HGK等是其靶基因。后續(xù)研究人員通過微陣列芯片分析法及RT-PCR技術(shù)不斷在腸癌組織中發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的miRNA[5-6]。至此miRNA作為腸癌的潛在診斷標(biāo)志物，受到了研究人員的極大關(guān)注，并成為近幾年的研究熱點[5-6]。miR-126是最早在人乳腺癌中被發(fā)現(xiàn)的且基因組位于人類染色體9q34.3上的一種抑癌miRNA，在血管豐富的組織中高表達(dá)，如肺、心等[7-8]。研究表明 miR-126在多數(shù)腫瘤組織中低表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-8]。如Dfaz等[11]首次發(fā)現(xiàn)miR-126在結(jié)腸癌中低表達(dá)，并與病理分級有關(guān)。后續(xù)研究者進一步證實了miR-126在結(jié)腸癌組織中的低表達(dá)，但具體的作用機制尚未明確，因此本研究將對此展開探討[8, 12]。本研究首先利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-126 mimics和miR-126 NC，RT-PCR結(jié)果證實轉(zhuǎn)染成功。接著采用MTT及annexin V-FITC/PI流式雙染技術(shù)檢測miR-126 mimics對SW480細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡的的影響，結(jié)果表明miR-126 mimics能顯著降低SW480細(xì)胞活力，并提高細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率，此結(jié)論與以往觀點一致[13]，說明miR-126 mimics能顯著的抑制SW480細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞的無限增殖與凋亡受限制源自于細(xì)胞周期的不可控制，特別是細(xì)胞周期調(diào)控點的紊亂，如G1、G2及S期，此細(xì)胞周期調(diào)控點也是眾多抗腫瘤藥物的作用靶點[14-15]。因此本研究繼續(xù)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-126 mimics對SW480細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明miR-126 mimics能使細(xì)胞周期阻滯于G1期。從而說明miR-126 mimics能顯著的抑制SW480細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

miR-126同眾多miRNA一樣，基本都是通過靶向調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄進而參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及細(xì)胞周期等生物學(xué)行為。有研究顯示SOX2是miR-126的下游靶基因之一[9]，但在結(jié)腸癌進展過程中尚未得到驗證，因此本研究將探討miR-126 是否能夠靶向調(diào)控SOX2的表達(dá)。SOX基因家族最早發(fā)現(xiàn)于Y染色體缺失的小鼠上，該家族成員廣泛分布于鳥類、魚類、果蠅、哺乳動物中，迄今為止已發(fā)現(xiàn)超過30種。SOX-2是SOX基因家族的一員，是與哺乳動物性別決定基因相關(guān)的一種核轉(zhuǎn)錄因子，對胚胎形成、發(fā)育，神經(jīng)發(fā)育，性別決定起著重要作用，特別對于維持胚胎干細(xì)胞的全能性起著關(guān)鍵性作用。近些年來研究也發(fā)現(xiàn)SOX2對腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程起著重要作用，在結(jié)腸癌、肺癌、肝癌中高表達(dá)[10]。本研究首先探討miR-126 mimics對SW480細(xì)胞中SOX2表達(dá)的影響，western blot及RT-PCR結(jié)果顯示miR-126 mimics組SOX-2蛋白及mRNA表達(dá)量均較miR-126 NC組顯著下調(diào)，說明miR-126 mimics能夠負(fù)性調(diào)控SOX2表達(dá)。接著熒光素酶報告基因表達(dá)也證實了miR-126 mimics能靶向結(jié)合于SOX2的3’UTR區(qū)域，進一步說明miR-126 mimics 在SW480細(xì)胞中對SOX-2的負(fù)性調(diào)控，繼而發(fā)揮其對SW480細(xì)胞的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用。

綜上所述，miR-126 mimics能顯著降低SW480細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G1期，是通過負(fù)性調(diào)控SOX2表達(dá)實現(xiàn)的。

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