葉尤松，王陳蕓，李哲麗，馬開利，唐東紅

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨強度下降、骨折風(fēng)險性增加為特征的骨骼系統(tǒng)的疾病[1]，它已成為最常見的老年病之一，嚴重危害老年人的健康和生活質(zhì)量。目前全世界患OP總?cè)藬?shù)超過2億，是位居第6位的常見病、多發(fā)病[2]，世界衛(wèi)生組織(WHO)將其列為三大老年病之一[3]。骨密度測定是早期診斷骨質(zhì)疏松、預(yù)測骨質(zhì)疏松性骨折的可靠方法。世界衛(wèi)生組織對骨質(zhì)疏松診斷標準的制訂也是基于骨密度的測量[4]。其中雙能X射線吸收法(dual energy X-ray absorptiometry，DXA)因其操作簡單、對患者輻射劑量低、檢查時間短、測量精確度與準確度相對較高等優(yōu)點已被公認為金標準廣泛應(yīng)用[5]。在探討發(fā)病機理及開發(fā)治療新藥的過程中，動物造模是不可缺少的手段。大鼠作為常用實驗動物，因其繁殖快，生命周期短、便于飼養(yǎng)、費用較低，成為目前研究 OP中使用最多，最成熟的造模候選動物，且以雌性為主，對其施行卵巢切除術(shù)，模擬老年婦女骨質(zhì)疏松的動物模型已得到國際上的普遍公認[6-7]。與人類相同，大鼠BMD 的測量主要用于大鼠骨量減少的評價和骨質(zhì)疏松的診斷。然而，診斷標準中尚缺乏DXA 可以采用的計算T值的大鼠正常參考值，以至于無法客觀地評價大鼠骨質(zhì)疏松，而且檢測部位的適合性也有待探討，為此本文采用DXA法測量不同年齡段活體雌性大鼠不同骨骼區(qū)域的骨密度，觀察比較骨密度值的增齡和部位變化，以完善雌性Wistar大鼠骨密度相關(guān)的骨生物學(xué)參考數(shù)據(jù)庫。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雌性Wistar大鼠30只，體重(355±12)g，6月齡，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究所提供[SCXK(滇) K2014-0002]，實驗在本單位設(shè)施內(nèi)進行[SYXK(滇) K2014-0007]，實驗方案獲得本單位倫理委員會審查通過(No:2016-003)。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉，用時配制成3%的水溶液，每只大鼠按40 mg/kg體重劑量進行腹腔注射麻醉；雙能 X 線骨密度儀(GE Healthcare China, GE Lunar Prodigy，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 質(zhì)控模型檢測

采用雙能 X射線骨密度分析儀進行檢測。開機后對質(zhì)控模型進行測量，待模型測量值在允許變化范圍內(nèi)時，再對樣本進行測量。

1.3.2 骨密度測量

為得到準確的月齡，選取同日出生大鼠并詳細記錄出生日期，離乳起單獨分籠飼養(yǎng)。分別在6月齡、10月齡、12月齡、24月齡和30月齡時，大鼠按40 mg/kg體重腹腔注射麻醉后，將大鼠放置在骨密度儀檢查床上，選用雙能X射線骨密度分析儀系統(tǒng)默認標準測量方式對大鼠的頭部、上肢、大腿、軀干、肋骨、骨盆、脊柱、軀干和全身分別進行骨密度分析，并記錄其數(shù)據(jù)，見圖1。

圖1 系統(tǒng)默認標準方式分析圖Fig.1 Analysis graph by the system default standard mode

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 骨密度值的增齡變化

隨著動物月齡的增加，雌性大鼠頭部、上肢、大腿、軀干、肋骨、骨盆、脊柱和全身骨密度值迅速增加，至10月齡達到峰值(P< 0.01)見表1，之后除頭部骨密度值增速減緩趨于穩(wěn)定外，其它部位隨著月齡的增加而逐漸降低至24月齡，10月齡至12月齡變化明顯(P< 0.05)，12月齡至24月齡變化趨于穩(wěn)定(P> 0.05)；24月齡到30月齡全身、脊柱和骨盆部骨密度有明顯的上升趨勢(P< 0.05)，而且三根曲線從6月齡到30月齡有相同的趨勢甚至重疊；其它部位變化趨于平穩(wěn)(P> 0.05)，見圖2。2.2不同年齡段雌性Wistar大鼠各骨骼區(qū)域骨密度值的測量結(jié)果

對同月齡的雌性Wistar大鼠各骨骼區(qū)域骨密度值進行統(tǒng)計分析(表1)，結(jié)果顯示：(1)6月齡大鼠除頭部骨密度值極顯著高于全身骨密度值外(P< 0.01)，其它部位和全身骨密度值無差異(P> 0.05)，提示頭部骨骼發(fā)育先于其它區(qū)域；(2)其它月齡大鼠頭部、上肢、大腿、軀干和肋骨部骨密度值均顯著或極顯著高于同月齡全身骨密度值(P< 0.05或P< 0.01)，而骨盆和脊柱部骨密度值和同月齡全身骨密度值比較差異無顯著性(P> 0.05)，從圖2增齡趨勢圖看，三者有相同甚至重疊的趨勢。

圖2 Wistar雌性大鼠各骨骼區(qū)域骨密度增齡變化Fig.2 Changes of BMD in different skeletal regions of the Wistar female rats

區(qū)域Regions月齡Monthsofage610122430頭Skull0.216±0.015**0.386±0.005**0.384±0.009**0.384±0.007**0.381±0.006**上肢Upperlimb0.098±0.0050.126±0.007**0.106±0.020**0.110±0.017**0.117±0.021**大腿Thigh0.098±0.0040.127±0.007**0.183±0.011*0.180±0.005*0.181±0.019**軀干Trunk0.099±0.0030.189±0.009**0.181±0.011**0.178±0.010**0.174±0.019**肋骨Ribs0.100±0.0040.146±0.007**0.146±0.012**0.138±0.011**0.140±0.014**骨盆Pelvis0.107±0.0030.301±0.0090.202±0.0110.203±0.0060.221±0.014脊柱Spine0.109±0.0080.310±0.0060.190±0.0140.187±0.0150.215±0.010全身Wholebody0.112±0.0060.309±0.0040.204±0.0100.201±0.0080.225±0.006

注：同月齡與全身骨密度值比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with the whole-body BMD at the same months of age,*P< 0.05，**P< 0.01.

表2 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果Tab.2 Results of the Pearson correlation analysis

**P< 0.01。

2.3 相關(guān)性分析結(jié)果

以盆骨骨密度和脊柱骨密度為因變量，以全身骨密度為因子對所測得的骨骼區(qū)域骨密度值進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明：全身骨密度值和盆骨骨密度值以及脊柱骨密度值均呈顯著正相關(guān)(P< 0.01)，見表2。

3 討論

目前，關(guān)于Wsitar大鼠骨生物學(xué)指標早期有一些零星報道，多以造模后相同時相點模型組與空白組 BMD 值的差異是否具有顯著性為評價 OP動物模型的標準，其優(yōu)點是實驗體系相對封閉，直接進行模型組與空白組之間的比較，方便快捷；缺點是結(jié)果判斷以參照組的 BMD 值為標準而非以種群的BMD 峰值為標準，設(shè)計理念與《指南》規(guī)定的人類臨床診斷標準不盡相符，且多數(shù)在測定中未嚴格控制其影響因素，樣本量也不充足，因此參考價值亦受到影響。本文選擇30只SPF級Wistar大鼠，嚴格控制飼養(yǎng)環(huán)境，實驗操作均由同一人員完成，確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。骨密度值的增齡變化結(jié)果顯示，隨著月齡的增加雌性大鼠頭部、上肢、大腿、軀干、肋骨、盆骨、脊柱和全身骨密度值迅速增加至10月齡達到峰值，處于文獻報道骨密度峰值位于7～12月齡的范圍內(nèi)[8-9], 與宋敏等[10]報道結(jié)果一致。但較秦林林等[11]報道的8月齡大鼠骨峰值形成和Gibson等[12]報道的6月齡大鼠骨峰形成的時間延遲，可能系動物種群、微生物控制級別和飼養(yǎng)環(huán)境不同，活體測量還是離體測量，測量儀器、操作人員和測量方式不一致以及所掃描部位略有差異導(dǎo)致。

現(xiàn)廣泛使用的雙能X線骨密度儀雖有較高的測量精度，但由于大鼠個體關(guān)節(jié)小而且各骨骼區(qū)域分界不盡明顯，而且沒有統(tǒng)一的固定體模，以至于無論使用系統(tǒng)默認標準分析方式還是用自定義手動分析方式都很難精確掃描到特定部位，從而無法避免系統(tǒng)誤差的存在。本文不同年齡段各骨骼區(qū)域骨密度測量及相關(guān)性分析結(jié)果顯示：大鼠頭部、上肢、大腿、軀干和肋骨部骨密度值均顯著或極顯著高于同月齡全身骨密度值(P< 0.05或P< 0.01)，而盆骨和脊柱部骨密度值和同月齡全身骨密度值比較差異無顯著性(P> 0.05)，從圖2增齡趨勢圖看，三者有相同甚至重疊的趨勢，全身骨密度值和盆骨骨密度值以及脊柱骨密度值均呈顯著正相關(guān)(P< 0.01)，即三個區(qū)域骨密度值比較接近，表明盆骨和脊柱骨密度值可以和全身骨密度值相互替換，這就為大鼠骨密度的測量和分析提供了一種有效的途徑。

總之，實驗動物月齡、評價指標和考察部位等的選擇直接影響到骨質(zhì)疏松研究結(jié)果和實驗數(shù)據(jù)的參考價值，骨量峰值和骨量丟失月齡的確定是動物月齡選擇的關(guān)鍵, 這些目前仍無統(tǒng)一的觀點。因此，在大鼠骨生物學(xué)種群標準及必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)方面亟待解決問題仍舊很多，如需統(tǒng)一種群，統(tǒng)一微生物控制級別，明確樣品數(shù)量，統(tǒng)一固定體模，規(guī)定活體還是離體測量等方面都有待于進一步探討。

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