陳文錦 羅亮 張麗 殷勤偉 徐如祥

神經(jīng)前體細(xì)胞（neural progenitor cells，NPCs）具有在特定微環(huán)境下分化為多種成熟神經(jīng)細(xì)胞的干細(xì)胞特點(diǎn)，是細(xì)胞移植治療神經(jīng)退行性疾病的一種理想細(xì)胞系。由于通過人腦組織內(nèi)直接獲取NPCs進(jìn)行原代培養(yǎng)受器官捐獻(xiàn)及倫理學(xué)限制而難以實(shí)施，因此，通過人間充質(zhì)干細(xì)胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）便成為一種理想的替代方式。MSCs是細(xì)胞移植治療神經(jīng)退行性病變等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想細(xì)胞來源[1-3]。然而，這類MSCs在體內(nèi)或體外特定環(huán)境下誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化為類神經(jīng)干細(xì)胞 （neural stem-like cells，uNSCLs）的分子機(jī)制尚不明確[4]。表觀遺傳學(xué)的調(diào)控是MSCs誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化為uNSCLs的關(guān)鍵，如DNA甲基化、基因組印記、母體效應(yīng)以及基因沉默等[5-7]。表觀遺傳學(xué)將基因型與表現(xiàn)型相互聯(lián)系，對(duì)干細(xì)胞命運(yùn)決定、生長(zhǎng)分化都起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用[8]。MSCs轉(zhuǎn)分化過程中，組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶P300和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶 3A （DNA methyltransferase，DNMT3A）分別對(duì)組蛋白修飾和DNA甲基化起到關(guān)鍵性的調(diào)控[9]。

E1A樣轉(zhuǎn)分化抑制蛋白3（E1A-like inhibitor of differentiation 3，EID3）能夠綁定P300/CBP并通過直接結(jié)合細(xì)胞核受體小異二聚體伴侶分子（small heterodimer partner，SHP）及 SRC1 來抑制 P300/CBP依賴性基因轉(zhuǎn)錄過程從而調(diào)控細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)和凋亡。DNA甲基化中，DNMT3A參與DNA的從頭甲基化，DNMT3A的功能缺失通常導(dǎo)致小鼠胚胎期死亡，而DNMT3A基因敲除的小鼠則表現(xiàn)為發(fā)育缺陷，在發(fā)育成熟前死亡[13]。同時(shí)DNMT3A作為甲基化轉(zhuǎn)移酶，具有甲基化與去甲基化的雙重作用[14]。研究表明，DNMT3A參與了NPC分化和胚胎期中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程，DNMT3A能夠精確地控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)NPCs的分裂、分化以及細(xì)胞的增殖過程[15-17]。然而，對(duì)DNMT3A的調(diào)控干細(xì)胞分裂分化等生理過程的詳細(xì)機(jī)制尚未明確，同時(shí)其與EID3之間可能存在的相互關(guān)系也尚未有研究，本研究目的是研究EID3在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為uNSCLs過程關(guān)系發(fā)揮的作用以及過程中EID3和DNMT3A之間的。

材料與方法

一、UMSCs的獲取和培養(yǎng)

該研究中人臍帶來源于產(chǎn)婦捐贈(zèng)，臍帶的使用和實(shí)驗(yàn)?zāi)康漠a(chǎn)婦均知情理解，簽字同意。產(chǎn)婦分娩后捐贈(zèng)的新鮮臍帶用75%的乙醇消毒30 s，放入Hanks平衡鹽溶液中浸泡1 ～6 h。將臍帶動(dòng)靜脈去除，然后轉(zhuǎn)入裝有DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用無菌眼科剪將臍帶剪成2 ～4 mm3的小塊，加入組織消化液（含0.5 mg/mL膠原酶、0.5%胰蛋白酶和0.5 mg/mL透明質(zhì)酸酶），37℃培養(yǎng)箱中消化45 ～60 min。消化完畢后，用5 mL槍頭緩和吹打30 s，在用45 μm的濾網(wǎng)過濾消化后的組織，去除消化不完全的大塊組織。濾液經(jīng)離心機(jī)250×g離心5 min，用新鮮的DMEM/F12培養(yǎng)基 [含10%胎牛血清 （fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、1%雙抗 （100 U/mL 青霉素、0.1 mg/mL 鏈霉素）]重懸細(xì)胞。

二、抗體

實(shí)驗(yàn)所用抗體：（1）一抗：DNMT3A 抗體（Cell Signaling Technology，Beverly，美國(guó)），beta-Actin 抗體（Abcam Inc，Cambridge，MA，美國(guó)），EID3 抗體（Abcam Inc，Cambridge，MA，美國(guó)），CBP/P300 抗體（Cell Signaling Technology，MA，美國(guó)），甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗 體 （Abcam Inc，Cambridge，MA，美 國(guó) ），F(xiàn)ITC-CD34 抗體、FITC-CD29 抗體、FITC-CD106、PECD45、PE-CD44、PE-CD90 抗 體 （BD Biosciences，Piscataway，NJ，美國(guó)），根據(jù)廠家推薦濃度稀釋使用；（2）二抗：驢抗兔免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）Alexa Fluor 488、驢抗鼠 lgG Alexa Fluor 568（Thermo Life，Pittsburg，PA，美國(guó)）。

三、細(xì)胞的培養(yǎng)

UMSCs用含10%FBS、4.5 g/L葡萄糖的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代（0.25%trypsin-EDTA消化細(xì)胞，含血清的培養(yǎng)基終止消化），UMSCs在下一步實(shí)驗(yàn)前先傳代2 ～4次。

HEK293用含10%FBS、2 mmol/L谷氨酰胺和1%雙抗 （100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素）的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

NSCs（SCC007，Millipore，美國(guó)）的培養(yǎng)和擴(kuò)增根據(jù)生產(chǎn)商提供的方案進(jìn)行。細(xì)胞培養(yǎng)皿用層粘連蛋白和多聚賴氨酸包被，用含20 ng/mL堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）（PeproTech，美國(guó)）、20 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子 （epidermal growth factor，EGF）（PeproTech，美國(guó)）的 ReNCell培養(yǎng)基培養(yǎng)。NSCs種板密度為5×105/mL，實(shí)驗(yàn)中所使用的NSCs均在3 ～10代內(nèi)。

四、UMSCs轉(zhuǎn)分化為uNSCL

UMSCs經(jīng)過0.05%的胰酶消化后，以（1.5 ～2.0）×105/cm2密度種植于低粘附培養(yǎng)瓶 （Corning Inc，Lowell，MA，美國(guó)），用含 1×N2B27、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF的NSC細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)3 ～4 d時(shí)，離心收集細(xì)胞，用細(xì)胞消化液Accutase（Sigma，美國(guó)）消化細(xì)胞，然后再以（1.5 ～2.0）×105/cm2密度種植于低粘附培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)7 ～10 d呈神經(jīng)球樣生長(zhǎng)的細(xì)胞便可用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)使用。

五、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

UMSC細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶-EDTA處理后，用含1%新生胎牛血清和0.02%疊氮鈉的磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶液清洗 2 遍。樣品采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀和相應(yīng)軟件（Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，美國(guó)）進(jìn)行分析，每個(gè)樣品納入分析數(shù)目不少于20 000個(gè)細(xì)胞。

六、質(zhì)粒

含質(zhì)粒 EID3（pcDNA3.1-Flag-EID3）和DNMT3A（pcEGFP-C1-DNMT3A）大腸桿菌菌液（Ampicillin 耐藥）購置于北京和元生物科技公司。菌液復(fù)蘇后，搖菌24 h，質(zhì)粒大提試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）提取質(zhì)粒（實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)廠家說明）。

七、Western blot

總蛋白的提取使用含蛋白酶抑制劑成分RIPA細(xì)胞裂解液（Thermo Fisher，Pittsburg，PA，美國(guó)），蛋白濃度的測(cè)定使用BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。等量蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳分離后，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（Milipore，美國(guó)）。5%牛血清白蛋白溶液（bovine serum albumin，BSA）抗原封閉，一抗（EID3、DNMT3A、GAPDH、Flag、EGFP）孵育 4℃過夜，二抗孵育室溫?fù)u床反應(yīng)1 h，PBS吐溫洗膜液洗膜。條帶使用ECL檢測(cè)試劑盒顯影 （GE Healthcare Life Science，Pittsburgh，PA，美國(guó)），暗室曝光分析結(jié)果。

八、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)

研究uNSCLs細(xì)胞內(nèi)源性EID3和DNMT3A是否能夠免疫共沉淀時(shí)，收集uNSCLs細(xì)胞總蛋白后，分2組，各500 μg，對(duì)照組加入免疫球蛋白G磁珠（Milipore，美國(guó)），實(shí)驗(yàn)組中加入 1.5 μL EID3 抗體，混勻4°C冰箱搖過夜，各加入20 μL A/G蛋白磁珠（Santa Cruz，CA，美國(guó)）混勻，4℃搖 4 h。 取出后離心小心吸出全部上清，PBS充分洗滌珠子，2×上樣緩沖液 （上海碧云天生物技術(shù)有限公司）混勻珠子后95℃煮樣10 min，冷卻后各吸取15 μL進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)DNMT3A。相同方法加入DNMT3A抗體檢測(cè)EID3是否被共沉淀。

研究外源性EID3和DNMT3A在HEK293細(xì)胞中能夠發(fā)生免疫共沉淀時(shí)，向HEK293中轉(zhuǎn)染pcDNA-EID3（帶Flag標(biāo)簽）和pcEGFP-DNMT3A（EGFP標(biāo)簽）質(zhì)粒，加入Flag抗體后檢測(cè)DNMT3A，同理加入EGFP抗體檢測(cè)Flag。其他方法步驟同內(nèi)源性檢測(cè)。

九、免疫細(xì)胞化學(xué)染色和激光共聚焦

細(xì)胞以1.5×104/cm2的密度種在已放入經(jīng)多聚賴氨酸包被細(xì)胞爬片的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞染色前，以4%多聚甲醛細(xì)胞固定液（1×PBS配置）進(jìn)行細(xì)胞固定處理10 min。PBS浸潤(rùn)洗滌3次，0.25%Triton-X100（5%BSA配置）細(xì)胞破膜處理5 min，室溫下5%BSA溶液抗原封閉處理1 h后去除封閉液，加入適量現(xiàn)配工作濃度一抗（EID3、DNMT3A），4℃過夜，一抗洗滌后進(jìn)行二抗染色，室溫下避光孵育2 h。二抗洗滌，封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察染色結(jié)果和分析亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)染色情況。

十、RNA提取及RT-PCR和qRT-PCR分析

RNA 的提取利用 TRIzol（Invitrogen，美國(guó)），實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)廠家說明。提取UMSCs、NSCs和uNSCLs細(xì)胞中的總RNA后，再用無RNA酶的DNA酶試劑處理，操作步驟根據(jù)廠家說明。為了評(píng)價(jià)mRNA的表達(dá)水平，總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄處理，逆轉(zhuǎn)錄操作試劑盒使用 PrimeScript RT Reagent Kit（TaKaRa，Otsu，日本）。500 ng總RNA用于合成第一條cDNA。逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)為Applied Biosystems ViiATM7 System，后續(xù)擴(kuò)增使用SYBR Green PCR Master mix（TaKaRa，Otsu，日本）。

十一、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化后的uNSCLs表現(xiàn)出NSC的細(xì)胞特點(diǎn)

UMSC經(jīng)過4 ～6代后，通過特定培養(yǎng)條件下（見實(shí)驗(yàn)方法），細(xì)胞逐漸表現(xiàn)出NSCs的成球成長(zhǎng)特征，體外培養(yǎng)的uNSCLs細(xì)胞倍增時(shí)間約為2.6 d，連續(xù)體外培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)至少能維持8周時(shí)間 （圖1A ～B）。同時(shí)，相比較UMSCs，uNSCLs高表達(dá)NSCs的 相 關(guān) mRNA： 在 NESTIN、PAX6、VIMENTIN、GFAP、MUSASHI1和NEUROD1基因mRNA的水平上增加了3 ～13.2倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.925、14.089、4.303、8.994、10.122、22.327、1.876；P=0.018、0.0005、0.026、0.0003、0.017、0.002、0.258，圖 1C）。

圖1 UMSCs和由UMSCs轉(zhuǎn)分化而來的uNSCLs細(xì)胞形態(tài)及免疫學(xué)特征

二 、EID3 和 DNMT3A 在 uNSCL、UMSCs 和NSCs細(xì)胞中的表達(dá)變化

為了研究uNSCLs細(xì)胞中甲基化和乙?；钢g的關(guān)系，通過qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)表觀遺傳學(xué)基因的表達(dá)情況， 包括 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、HDAC1、P300、EID1和 EID3。結(jié)果顯示 DNMT3A 在uNSCLs和NSC中的表達(dá)量明顯高于UMSCs，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （tuNSCLs=7.453，PuNSCLs=0.006；tNSCs=12.924，PNSCs=0.001）（圖 2A）。 隨后，檢測(cè) UMSC、uNSCLs和NSC細(xì)胞中DNMT3A和EID3的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，DNMT3A和EID3在上述細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，在UMSC中，EID3高表達(dá)而DNMT3A低表達(dá)；經(jīng)過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的uNSCLs與UMSC比較，EID3表達(dá)量降低而DNMT3A的表達(dá)量升高；NSCs與uNSCLs比較，EID3的表達(dá)量進(jìn)一步降低，并且DNMT3A的表達(dá)量進(jìn)一步升高（圖2B ～C）。

圖2 UMSCs、uNSCLs、NSCs中表觀遺傳基因mRNA水平比較及EID3和DNMT3A蛋白水平比較

圖3 EID3和DNMT3A在UMSCs、uNSCLs、NSCs中免疫熒光情況

亞細(xì)胞水平表達(dá)定位研究發(fā)現(xiàn)，EID3和DNMT3A都優(yōu)先在細(xì)胞核中富集，而后，EID3在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中均有表達(dá)，而DNMT3A則大部分表達(dá)在細(xì)胞核中，與EID3存在共定位表達(dá)現(xiàn)象（圖3）。

三、EID3直接結(jié)合DNMT3A

通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)EID3和DNMT3A之間確切關(guān)系，EID3抗體能夠?qū)NSCLs細(xì)胞總蛋白中DNMT3A蛋白沉淀下來，并且DNMT3A抗體也能夠?qū)NSCLs細(xì)胞總蛋白中EID3蛋白沉淀下來 （圖4A）。這部分實(shí)驗(yàn)證明，在uNSCLs細(xì)胞中，EID3和DNMT3A之間存在直接結(jié)合作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)EID3與DNMT3A蛋白之間能夠直接結(jié)合，本研究在HEK293細(xì)胞系中共轉(zhuǎn)染表達(dá)EID3（Flag標(biāo)簽）和DNMT3A（EGFP標(biāo)簽）的外源性質(zhì)粒，外源性轉(zhuǎn)染基因表達(dá)蛋白的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源性Flag-EID3與pEGFPDNMT3A之間同樣能夠相互沉淀下來。這就說明，外源性EID3和DNMT3A蛋白同樣存在直接結(jié)合的現(xiàn)象（圖 4B）。

討 論

圖4 EID3和DNMT3A免疫共沉淀

成熟神經(jīng)細(xì)胞因其有限的自我更新能力，移植NSCs成為神經(jīng)退行性病變的一種理想可行的治療方案。目前，NSCs移植治療在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)嶋H應(yīng)用尚存在許多未能解決的難題，其中最大難題在于如何快速獲取大量的NSCs[18]。直接提取uNSCLs進(jìn)行原代培養(yǎng)擴(kuò)增因存在諸多限制，實(shí)際操作無法實(shí)現(xiàn)。幸運(yùn)的是，人類干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化領(lǐng)域大量研究成果表明，MSCs為NSCs的大量獲取提供了可能。MSCs來源豐富，容易分離培養(yǎng)，細(xì)胞增殖速度快，并且研究已經(jīng)表明MSCs能夠在較短的時(shí)間內(nèi)通過人工誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化，從而獲取大量具有NSCs功能特性的一種uNSCLs樣細(xì)胞[19,20]。然而，關(guān)于MSCs是否能夠在不引入外源性轉(zhuǎn)錄因子而自然的轉(zhuǎn)分化為uNSCLs的問題，仍然存在許多爭(zhēng)論。

在本研究中，由UMSCs轉(zhuǎn)分化而來的uNSCLs，能夠6次以上進(jìn)行傳代而保持自身細(xì)胞特征的穩(wěn)定性。筆者認(rèn)為，uNSCLs體現(xiàn)的是MSCs轉(zhuǎn)分化為NSCs的一種中間狀態(tài)，理由如下：（1）在無血清培養(yǎng)基中，UMSCs傾向聚集成球生長(zhǎng)，但是這并不等同于NSC/NPC神經(jīng)球，因?yàn)楹笳叱汕蛏L(zhǎng)的原因是因其自身的細(xì)胞增殖所致；（2）盡管uNSCLs細(xì)胞表達(dá)許多NSCs的細(xì)胞表面蛋白和轉(zhuǎn)錄因子標(biāo)記物，但是一些重要的NSCs標(biāo)記物并沒有顯著表達(dá)，如SOX2。雖然存在以上的問題，uNSCLs仍然表現(xiàn)出了類似NSCs的諸多特性，uNSCLs細(xì)胞能夠成球狀增殖，并且表達(dá)NSCs相關(guān)標(biāo)記蛋白，同時(shí)能夠進(jìn)一步分化為不同類型的神經(jīng)細(xì)胞。因此，筆者認(rèn)為uNSCLs細(xì)胞作為MSCs轉(zhuǎn)分化為NSCs研究的細(xì)胞模型具有重大的價(jià)值。

在體細(xì)胞的重編碼的過程中，DNA甲基化和去甲基化平衡能夠維持DNA的甲基化譜，但其中去甲基化的機(jī)制尚不明確。相關(guān)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，DNMT3A作為一個(gè)從頭甲基化酶，卻能表現(xiàn)出脫羥基甲基化酶活性[21,22]。然而，在細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程中，DNMT3A是如何協(xié)調(diào)自身甲基化和去甲基化雙重作用尚不得知。筆者檢測(cè)EID3和DNMT3A分別在uNSCLs、UMSCs和NSCs中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EID3和DNMT3A之間的表達(dá)水平存在相關(guān)關(guān)系，在UMSCs轉(zhuǎn)分化為uNSCLs之前，細(xì)胞高表達(dá)EID3而低表達(dá)DNMT3A；UMSCs轉(zhuǎn)分化為uNSCLs之后，細(xì)胞低表達(dá)EID3而高表達(dá)DNMT3A。隨后，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了EID3在UMSCs轉(zhuǎn)分化的過程中直接結(jié)合了DNMT3A。因此，EID3很可能參與調(diào)控了DNMT3A所表現(xiàn)出的甲基化和去甲基化雙重功能的轉(zhuǎn)變過程，調(diào)控了UMSCs轉(zhuǎn)分化為uNSCLs過程中DNA重編碼中的甲基化和去甲基化平衡。

EID3作為組蛋白乙?；窹300抑制蛋白，能夠直接結(jié)合甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3A，并調(diào)控DNMT3A的功能狀態(tài)，反映了MSCs轉(zhuǎn)分化過程中存在復(fù)雜的外源性調(diào)控，且需要更加全面地進(jìn)行多種因素研究來進(jìn)一步探索干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化機(jī)制。

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