劉婷 楊建云 肖炳坤 楊懷霞 黃榮清

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

AOH是一種雄甾酮衍生物，具有抗糖皮質(zhì)激素活性的作用[1]。AOH能夠刺激機(jī)體細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)輻射誘導(dǎo)造血損傷恢復(fù)，可以明顯提高全身輻射小鼠和獼猴的存活率，增強(qiáng)機(jī)體輻射后抗感染能力，有很好的抗輻射效果[2-7]。此外，組織病理學(xué)檢查和臨床試驗(yàn)結(jié)果表明AOH的毒性較低[8]。AOH具有較強(qiáng)的抗輻射作用和較低的毒性，使其成為一個(gè)引人關(guān)注的候選抗輻射藥物，對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定可以為藥物的有效性提供質(zhì)量控制辦法。AOH不溶于水而溶于有機(jī)溶劑，將AOH做成凍干粉針注射劑，可降低給藥劑量，提高生物利用度[9]。AOH凍干粉針劑是一種注射給藥新劑型，本文建立了一種簡便、準(zhǔn)確、可行、高效 的HPLC 分析方法，用于測(cè)定凍干粉針中AOH含量，為其質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

儀器 ：Waters 2795 高效液相色譜儀（美國Waters 公司） ；2996 二極管陣列檢測(cè)器 ；Empower 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) ；BP211D型十萬分之一天平（德國塞多利斯集團(tuán)） ；KQ3200 型超聲儀（寧波新芝生物科技股份有限公司），UV-2501PC 紫外分光光度儀（日本島津公司）。色譜柱 Dikma, Diamonsil C18柱 (250mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇和乙腈均為色譜純，甘露醇、吐溫80、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉均為分析純（AR），PH6.0 PBS緩沖液為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉的混合液，氫氧化鈉（純度≥96%)，鹽酸（純度為36%～38%），30%過氧化氫。AOH 對(duì)照品（含量：100.02%，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所自制）；AOH凍干粉針（含主藥100 mg/瓶）及空白輔料（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所自制 )。

2 凍干粉針制備

稱取AOH對(duì)照品13.0g，1.5g吐溫80，3.0g甘露醇。將吐溫80加入研缽，倒入甘露醇，研勻后采用少量遞加法加入已研細(xì) AOH 粉末，研磨均勻，加入 PBS 緩沖液，少量多次將上述藥物輔料混合物從研缽轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入剩余PBS溶液，簡單攪拌后，水浴超聲處理15min，轉(zhuǎn)入膠體磨研磨40min，中間停機(jī)10min散熱，之后由膠體磨倒出，超聲處理15 min后，用注射器吸取1.8mL混懸液置安瓿管內(nèi)，凍干得疏松狀固體后，封口即可。

3 溶液的制備

3.1 對(duì)照品溶液制備

取 AOH對(duì)照品約 25 mg，精密稱定，置 50 mL量瓶中，加適量甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

3.2 供試品溶液制備

稱取供試品約 25mg，精密稱定，置 50 mL 量瓶中，加適量甲醇超聲 15 min，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

3.3 空白溶液制備

稱取處方量的空白輔料適量，置100mL量瓶中，用甲醇適量，超聲處理15min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液。

4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

采用 Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱 ；流動(dòng)相 ： 乙腈 - 水（45：55）；檢測(cè)波長 206nm ；流速 1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL ；柱溫：室溫。理論塔板數(shù)以 AOH計(jì)算不低于 5000。

按上述色譜條件，將對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白輔料溶液分別進(jìn)樣，AOH 凍干粉針保留時(shí)間為 13.389 min，空白輔料在此處無色譜峰出現(xiàn)，說明輔料對(duì) AOH檢測(cè)無影響。色譜圖見圖 1。

圖1 空白輔料

5 方法學(xué)驗(yàn)證[10]

5.1 檢測(cè)限、定量限

取AOH約10mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，再用乙腈逐級(jí)稀釋成一系列濃度，精密量取20μL，10μL，5μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。在信噪比（S/N）為3：1時(shí)測(cè)得的檢測(cè)限為50ng，在信噪比（S/N）為10：1時(shí)測(cè)得的定量限為200ng。

5.2 線性關(guān)系考察

取對(duì)照品約50mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別量取2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL溶液于10mL量瓶中，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，取20ul進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以峰面積 A 對(duì)濃度 C(mg·mL-1)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程是A=1E+07C-60480(n=7)（r=0.9994）。結(jié)果表明,AOH凍干粉針在0.2～0.8mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

5.3 儀器精密度試驗(yàn)

取濃度約為0.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20μL，以峰面積計(jì)算所得RSD為0.93%，表明儀器有良好的精密度。

5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取一系列濃度為0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的供試品溶液，分別于0h、2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h各取20μL進(jìn)樣，照“4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果 24h 內(nèi) 3 種濃度峰面積 RSD 分別為 0.63%、0.38%、0.68%，72h 內(nèi)3 種濃度峰面積 RSD 分別為 1.47%、0.95%、1.47%，表明樣品溶液在3天內(nèi)比較穩(wěn)定。

5.5 重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密稱取樣品9份，配制成濃度為0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的供試品溶液，每個(gè)濃度制備3份，照“4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算得平均標(biāo)示量為0.67mg/mg。RSD為1.57%，表明方法有良好的重復(fù)性。

5.6 加樣回收測(cè)定

取AOH凍干粉5瓶，將傾出內(nèi)容物混勻后，精密稱取供試品適量，9 份分別精密加入對(duì)照品適量，配制成低、中、高3種濃度，搖勻，過濾后進(jìn)樣 20 μL，測(cè)定回收率，結(jié)果（見表 1）AOH 凍干粉針平均回收率為 101.72%，RSD=1.21%。說明用本法測(cè)定 AOH 凍干粉針含量準(zhǔn)確度良好。

表 1 AOH凍干粉針加樣回收（n=9) 測(cè)定結(jié)果

5.7 專屬性考察

為進(jìn)一步考察色譜系統(tǒng)的分離效果，對(duì)樣品分別進(jìn)行了過氧化氫氧化破壞、堿破壞、酸破壞與加熱破壞試驗(yàn)。

取AOH凍干粉適量，精密稱定，置25mL量瓶中，照下述方法進(jìn)行操作：酸破壞：用5mol·L-1的氫氧化鈉10mL，90℃水浴中加熱8h，再加5mol·L-1的鹽酸，調(diào)節(jié)pH至中性，過濾，濾渣晾干；②堿破壞：用5mol·L-1的氫氧化鈉10mL，90℃水浴中加熱8h，再加5mol·L-1的鹽酸，調(diào)節(jié)pH至中性，過濾，濾渣晾干；③氧化破壞：加30%過氧化氫10mL，放置3天后于90℃水浴中加熱8h，過濾，濾渣晾干；④高溫破壞：置120℃下放置10h。取上述濾渣加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，分別進(jìn)樣 20μL，照“4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

6 樣品分析

取3批供試品，稱取供試品約 25mg，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加適量甲醇超聲 15 min，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，取 AOH對(duì)照品同法操作，得對(duì)照品溶液。取上述溶液 20 μL 注入液相色譜儀，按照“4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。批號(hào)20170301、20170302、20170303含量為0.68 mg/mg、0.69 mg/mg、0.71 mg/mg。

7 討論

7.1 波長的選擇

配制一定濃度的對(duì)照品溶液，在 190～800 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描（見圖 3），可以看出本品為末端吸收，與AOH結(jié)構(gòu)式中只有一個(gè)雙鍵的特征相符合，選擇 206 nm 作為檢測(cè)波長，既保證主藥能有相應(yīng)吸光值，有關(guān)物質(zhì)也在此波長處有較強(qiáng)吸收；流動(dòng)相在該波長處無吸收，不會(huì)干擾被測(cè)組分。

圖2 AOH凍干粉針專屬性 HPLC 分析結(jié)果

7.2 AOH凍干粉針破壞實(shí)驗(yàn)

從破壞試驗(yàn)中可知，本品在高溫、氧化、堿性和酸性條件下穩(wěn)定。用檢查有關(guān)物質(zhì)的色譜條件，可以檢查到過氧化氫氧化破壞、堿破壞、酸破壞、加熱破壞后的降解產(chǎn)物。本品與降解產(chǎn)物能很好分離，色譜圖見圖2。說明所建立的HPLC方法專屬性好，該色譜條件可用于AOH凍干粉的含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)的檢查。

7.3 輔料的影響

凍干粉針中主藥 AOH 不溶于水，可溶于有機(jī)溶劑，但輔料為水溶性，采用純有機(jī)溶劑提取，這就大大減少了輔料對(duì)其干擾，由液相色譜圖也可以進(jìn)一步驗(yàn)證，空白輔料對(duì)測(cè)定無干擾。

8 結(jié)論

凍干粉針劑相對(duì)于水針劑質(zhì)量更穩(wěn)定，也更適合于給藥劑量較小藥物。作為一種新的輻射防護(hù)藥物，AOH給藥劑量小，對(duì)輻射有較好治療作用，制成凍干粉針劑，不僅可以提高生物利用度，也可以相對(duì)降低潛在毒副作用，進(jìn)一步增加了藥物給藥方式選擇途徑。本實(shí)驗(yàn)通過HPLC對(duì)凍干粉中AOH定量研究，經(jīng)方法學(xué)研究結(jié)果表明，該方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)，可為AOH凍干粉針劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供可靠的依據(jù)。

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