方慧 劉琪

[摘要] 近年研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激的直接和間接參與也是導(dǎo)致牙周組織破壞的關(guān)鍵因素?；钚匝酰≧OS）是機(jī)體氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，它已成為近年牙周炎發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。生理水平的ROS能作為第二信使參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡等生理活動，而過量ROS則發(fā)揮細(xì)胞毒性，對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA造成氧化損傷，干擾細(xì)胞生長和細(xì)胞周期進(jìn)程，并誘導(dǎo)牙齦成纖維細(xì)胞凋亡。ROS的這些作用共同對牙周組織造成了不可逆轉(zhuǎn)的直接損傷。此外，ROS還能通過激活炎性因子、核因子κB（NF-κB）、c-Jun氨基末端激酶（JNKs）及自噬改變牙周微環(huán)境而對牙周組織造成間接的嚴(yán)重破壞。本文概述了目前ROS的過量生成及其所激活的相關(guān)信號通路與牙周炎的關(guān)系，為進(jìn)一步探索ROS與牙周炎發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 牙周炎；活性氧；炎性因子；核因子κB；c-Jun氨基末端激酶；自噬

[中圖分類號] R781.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）02（b）-0022-05

[Abstract] Recent studies suggest that the direct and indirect participation of oxidative stress is also a key factor in the destruction of periodontal tissue. Reactive oxygen species （ROS） is a product of oxidative stress in the body. It has become a hot research topic in the pathogenesis of periodontitis in recent years. Physiological levels of ROS can participate in physiological activities such as homeostasis， signal transduction and apoptosis in cells as second messengers. Excessive ROS play a cytotoxic role， causing oxidative damage to proteins ， lipids and DNA， interfering with cell growth and cell cycle progression ， and induce gingival fibroblast apoptosis. These effects of ROS together cause irreversible and direct damage to the periodontal tissue. In addition， ROS can also indirectly cause serious damage to periodontal tissues by activating inflammatory factors， nuclear factor κB （NF-κB）， c-Jun N-terminal kinases and autophagy. This article summarizes the relationship between the excessive production of ROS and its activated signal transduction pathway and periodontitis， so as to provide evidence for further exploration of the correlation between ROS and periodontitis.

[Key words] Periodontitis； Reactive oxygen species； Inflammatory factors； Nuclear factor-κB； C-Jun N-terminal kinases； Autophagy

牙周炎是一種常見的慢性感染性疾病，其特征是通過牙周病原菌的相互作用和宿主免疫反應(yīng)導(dǎo)致牙周支持組織完整性遭到不可逆性破壞的炎性疾病。過去關(guān)于牙周炎的研究側(cè)重于具有高蛋白酶和免疫抑制特征的宿主細(xì)菌的重要性，如牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g），而近年研究認(rèn)為，僅牙周病原菌對牙周的致病性是不夠的，還涉及其他各類復(fù)雜的生物因子、信號分子和通路。大多數(shù)牙周組織的損傷是白細(xì)胞、補(bǔ)體和ROS參與的宿主固有免疫反應(yīng)的聯(lián)合效應(yīng)。一般而言，生理水平的ROS具有抗菌、宿主防御和免疫調(diào)節(jié)作用，但過量的ROS則具細(xì)胞毒性，能對細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA造成氧化損傷[1]，干擾人牙齦成纖維細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的進(jìn)展[2]，誘導(dǎo)牙齦成纖維細(xì)胞凋亡等[3]，直接或間接誘導(dǎo)牙周組織損傷。本文概述了目前ROS的過量生成及其所激活的相關(guān)信號通路與牙周炎的關(guān)系，為進(jìn)一步探索ROS與牙周炎發(fā)病及其進(jìn)展的相關(guān)性提供依據(jù)。

1 ROS的來源及其與牙周炎的關(guān)系

1.1 ROS的來源

機(jī)體的大部分組織能連續(xù)產(chǎn)生ROS以參與細(xì)胞的正常生理代謝。ROS是氧自由基和參與氧自由基生成的其他非自由基氧衍生物的統(tǒng)稱，它們都是壽命短而活性高的氧化產(chǎn)物。狹義的ROS主要包括過氧化物（O2—·）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）和單線態(tài)氧（1O2），廣義上還包括活性氮（RNS），即一氧化氮（NO）、二氧化氮（NO2）和過氧亞硝基自由基（ONOO·）等。這些物質(zhì)都是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER），線粒體電子傳遞鏈（Mito-ETC），過氧化物酶，如NADPH氧化酶（NOX）、黃嘌呤氧化酶（XO）、環(huán)氧合酶（COX）、脂氧合酶（LOX）等酶內(nèi)源性生成的，而Mito-ETC通常被認(rèn)為是ROS生成的主要途徑[4]。在此過程中，電子給體（如NADH）通過氧化還原反應(yīng)將電子傳遞給電子受體（如O2）合成三磷酸腺苷（ATP）。此期間電子可能泄漏至O2而生成ETC的副產(chǎn)品O2—·，隨后通過超氧化物歧化酶1（SOD1/CuZn-SOD）在線粒體膜間隙或超氧化物歧化酶2（SOD2/MnSOD）在基質(zhì)中歧化O2—·生成H2O2，而谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）或過氧化氫酶（CAT）能將H2O2還原成H2O，但在芬頓（Fenton）和Haber-Weiss反應(yīng)中H2O2可部分降解為·OH[5]。

雖然機(jī)體為了維護(hù)氧化還原平衡也會形成大量抗氧化劑，如SOD、CAT、GPX、谷胱甘肽（GSH）、谷氧還蛋白和硫氧還蛋白體系等[6]，但ROS過量產(chǎn)生、抗氧化劑水平降低或抗氧化酶受抑制所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，能誘發(fā)一系列炎癥疾病，如癌癥、心血管疾病、糖尿病以及近年來證據(jù)日漸增多的牙周炎[7]。

1.2 ROS與牙周炎的關(guān)系

研究認(rèn)為，過量生成的ROS及機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)失衡是導(dǎo)致細(xì)胞毒作用和加劇牙周組織破壞的原罪[8]。臨床研究顯示，牙周炎患者的血漿和血清總抗氧化劑（TAOC）及特異性抗氧化劑如SOD、CAT和GPX水平均較對照組顯著降低[9]。與對照組相比，慢性牙周炎患者齦溝液中抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）的濃度較低，在潔治和根面平整術(shù)后其水平顯著升高[10]。唾液是公認(rèn)的牙周炎標(biāo)志物池[11]，其中的氧化劑和抗氧化劑水平能在一定程度上反應(yīng)牙周局部的氧化應(yīng)激狀態(tài)。臨床研究顯示，與對照組相比，牙周炎患者唾液中TAOC水平顯著降低，氧化損傷標(biāo)志物水平明顯高于對照組，并與社區(qū)牙周治療需要指數(shù)（CPITN）呈負(fù)相關(guān)，但唾液總抗氧化能力（TAC）與牙周炎狀態(tài)呈正相關(guān)[12]。此外，牙周炎患者的血清、唾液和齦溝液（GCF）中均發(fā)現(xiàn)較對照組更高的ROS代謝物和總氧化劑（TOS），且唾液和血清氧化應(yīng)激水平、丙二醛（MDA）水平也顯著升高，TAC卻降低[13]。這預(yù)示著牙周炎患者并發(fā)全身和局部炎性疾病的風(fēng)險急劇增加。ROS濃度較低時，能刺激體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞（HPDLFs）增殖和分化；當(dāng)其濃度較高時，則兼具殺傷病原體和對周圍組織的細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致牙周組織破壞加劇[14]。Cavalla等[15]的研究顯示，ROS能增加明膠溶解性基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性，刺激人牙周膜成纖維細(xì)胞（HPDLFs）分泌細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6等），從而加劇牙周組織破壞。此外，ROS能下調(diào)成骨細(xì)胞分化和刺激破骨細(xì)胞發(fā)生，促進(jìn)骨丟失[16]。

2 過量ROS促進(jìn)牙周炎發(fā)生發(fā)展的機(jī)制

2.1 活化炎性介質(zhì)

炎性小體（inflammasomes）是位于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的多蛋白復(fù)合物，作為對細(xì)胞感染、應(yīng)激或組織損傷的應(yīng)答，炎性小體被組裝為炎性復(fù)合體（inflammasome complex）而被激活，促進(jìn)炎性反應(yīng)并參與宿主防御和疾病的病理過程，它能感知表示細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)喪失的產(chǎn)物和內(nèi)源性信號，在牙周炎和幾種全身性疾病中都很活躍[17]。細(xì)胞因子IL-1家族的加工是由細(xì)胞內(nèi)固有免疫應(yīng)答系統(tǒng)調(diào)節(jié)，稱為域蛋白（NLRP3/NALP3）炎性復(fù)合體，它是一種代謝危險傳感器，是目前最完整的炎性復(fù)合體，由NLRP3支架、銜接蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)狀蛋白（ASC）和半胱天冬酶（caspase）-1組成[18]。在靜息細(xì)胞中，硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）與硫氧還蛋白（TRX）相結(jié)合，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS增加即可氧化TRX，促使TXNIP從TRX釋放而與NLRP3炎性體結(jié)合并將其激活，抑制ROS的活性則可抑制這種結(jié)合，從而使NLRP3炎性體失活[19]。這說明ROS的生成是NLRP3炎性體激活的必需上游事件，它能“點(diǎn)燃”激活NLRP3炎癥體及導(dǎo)致相應(yīng)病理過程的效應(yīng)分子。隨后，現(xiàn)有和/或新合成的NLRP3炎性體激活caspase，主要是caspase-1，后者通過特異性切割無活性的pro-IL-1β和pro-IL-18，將二者轉(zhuǎn)化為具有生物活性的IL-1β和IL-18，并介導(dǎo)它們的成熟和釋放，從而啟動宿主固有免疫應(yīng)答[20]。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，牙周炎患者牙齦組織中的NLRP3水平顯著升高，IL-1β水平也相應(yīng)增加；而使用ROS清除劑抑制ROS活性后，即可阻止NLRP3炎性體活化和降低IL-1β水平[19]。在牙周炎患者的齦溝液和牙齦組織中，NLRP3炎性體的含量和活性均增加，從而導(dǎo)致caspase-1的活化及IL-1β的分泌增加[21]。牙齦上皮細(xì)胞（gingival epithelial cells）中ROS的過量產(chǎn)生激活了NLRP3炎癥體和caspase-1，從而促進(jìn)IL-1β的分泌[21]。牙周組織受感染、應(yīng)激或損傷的細(xì)胞不斷生成ROS，通過激活NLRP3炎性體而導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6等的持續(xù)分泌和積累，從而引起炎癥性噴發(fā)，加劇牙周組織的破壞[19]。綜上所述，NLRP3炎性體可作為炎癥信號的平臺，通過NLRP3—caspase-1—細(xì)胞因子通路參與牙周組織的固有免疫反應(yīng)引發(fā)和/或加劇牙周炎，導(dǎo)致牙周組織的不可逆性破壞。

2.2 激活NF-κB通路

雖然牙周炎是微生物菌斑引發(fā)的慢性炎癥性疾病，但遺傳和牙周局部微環(huán)境都有助于牙周炎的發(fā)生發(fā)展。轉(zhuǎn)錄因子是基因特異性因子，常作為遺傳和環(huán)境因素之間的聯(lián)系。NF-κB是第一個被證實(shí)響應(yīng)ROS的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS被清除后，NF-κB的活性即被消除[22]，而其被激活后則能協(xié)調(diào)多種炎癥因子的表達(dá)。臨床研究顯示，與對照組相比，NF-κB在牙周炎受試者中高度活化，活化的NF-κB能增強(qiáng)促炎細(xì)胞因子（如IL-6、IL-1β、TNF-α）和趨化因子（如IL-8）分泌，從而觸發(fā)炎性反應(yīng)和破骨細(xì)胞分化，導(dǎo)致牙周組織破壞[23]。這些炎性細(xì)胞因子除了能促進(jìn)牙周局部的炎性反應(yīng)，也能調(diào)控NF-κB配體的受體激活劑（RANKL）和骨保護(hù)素（OPG）的表達(dá)，而RANKL和OPG被認(rèn)為是骨代謝的主要調(diào)節(jié)劑，所以二者也被認(rèn)為是牙周炎時牙槽骨破壞機(jī)制的關(guān)鍵[24]。研究證實(shí)，牙周炎使牙周組織中RANKL過表達(dá)能促進(jìn)牙槽骨吸收，而保護(hù)牙槽骨免遭吸收的OPG水平則顯著降低，從而間接促進(jìn)牙槽骨吸收[25]。受損牙周細(xì)胞生成的過量ROS激活NF-κB后，通過介導(dǎo)IL-6、IL-1β等一眾細(xì)胞因子過表達(dá)而調(diào)控RANK/RANKL/OPG通路上調(diào)破骨細(xì)胞活性，導(dǎo)致牙根嚴(yán)重吸收、牙槽骨高度逐步喪失、牙齒過早剝落以及牙周動態(tài)平衡和牙槽骨重構(gòu)紊亂，并且還可通過RANK非依賴途徑誘導(dǎo)牙槽骨丟失[24]。趨化因子IL-8對中性粒細(xì)胞（PMNs）有明顯的靶向特異性，能在炎癥部位募集并激活PMNs，活化的PMNs通過釋放酶原顆粒和ROS能有效降解牙周結(jié)締組織成分，同時，內(nèi)皮細(xì)胞也被大量持續(xù)滲出的PMNs聚集而遭繼發(fā)性損害[26]。因此，IL-8能協(xié)同IL-6和IL-1β等細(xì)胞因子破壞牙周組織。另外，研究證實(shí)[27]，NF-κB作為NALP3炎性體形成的次級信號分子，能啟動NLRP3炎癥體。Yoshida等[28]的研究證實(shí)，在牙周炎時，NF-κB通過調(diào)節(jié)NLRP3炎癥體的表達(dá)來調(diào)節(jié)牙周炎癥。

2.3 激活JNK通路

被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶（SAPKs）的JNKs可被多種胞外刺激激活（生長因子、細(xì)胞活素類、氧化應(yīng)激等），誘導(dǎo)不同細(xì)胞系發(fā)生凋亡。近年研究表明，牙周炎時過量ROS能激活JNK信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁可誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）產(chǎn)生過量ROS，并接受較短時間刺激后即可檢測到水平較高的磷酸化JNK，其濃度隨時間的延長逐步降低；隨后，線粒體發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的變化而釋放細(xì)胞色素C（Cyt-c），激活caspase-3和caspase-9級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)HGFs凋亡[29]。另外，ROS激活JNK通路也可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的生成和釋放。P.g能在牙齦上皮細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生過量ROS后激活JNK通路，并在活化的JNKs介導(dǎo)下上調(diào)IL-1β和IL-6的表達(dá)，造成上皮細(xì)胞損傷而加劇牙齦炎癥，抑制ROS的生成即可抑制JNK通路活化，從而阻止炎性細(xì)胞因子釋放[30]。但是，上述情況都需要ROS持續(xù)激活JNK通路。Nakano等[31]的研究認(rèn)為，ROS可以利用兩種不同的機(jī)制來調(diào)控JNK的持續(xù)活化：ROS通過激活MAPKKK導(dǎo)致JNK活化和/或滅活，從而誘導(dǎo)JNK去磷酸化的ROS抑制MAP激酶磷酸酶（MKPs）。另外，他們也推測caspase級聯(lián)反應(yīng)的激活也能反過來激活JNK通路。

2.4 啟動自噬

自噬（autophagy）是進(jìn)化上保守的細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng)將損傷或多余的細(xì)胞材料如受損的細(xì)胞器、變性的蛋白質(zhì)和細(xì)菌等遞送至溶酶體，為新的合成或能源產(chǎn)生而將各材料降解[32]。近年研究證實(shí)，線粒體ROS是調(diào)節(jié)自噬的重要信號分子。過量生成的ROS可通過靶向自噬相關(guān)基因（Atgs）和/或上游信號通路如雷帕霉素復(fù)合物1（mTORC1）、Beclin1和Atg12-Atg5復(fù)合物等的哺乳動物靶標(biāo)來調(diào)節(jié)自噬活性[33]。就目前的研究發(fā)現(xiàn)而言，ROS至少可通過四種不同機(jī)制調(diào)節(jié)自噬[33]：①激活JNKs后磷酸化Bcl-2，導(dǎo)致Beclin 1解離和自噬誘導(dǎo)；②激活PI3K-AKT通路導(dǎo)致mTOR活化，使其發(fā)揮自噬誘導(dǎo)抑制劑的作用；③依賴AMPK抑制TORC1活性，利于激活自噬；④激活A(yù)tg12-Atg5復(fù)合物促進(jìn)自噬延長。

新興證據(jù)表明，牙周炎患者牙周細(xì)胞線粒體產(chǎn)生的過量ROS可激活牙周組織的自噬作用。用LPS處理HGFs后發(fā)現(xiàn)，Atg12和微管相關(guān)蛋白I輕鏈3（MAP-LC3）的蛋白及轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)均增加，并與牙周炎患者外周血單核細(xì)胞線粒體產(chǎn)生的ROS呈正相關(guān)，當(dāng)線粒體產(chǎn)生的ROS減少，自噬也隨之減少[34]。這表明自噬參與牙周炎癥的調(diào)控，自噬對牙周炎有雙重作用，能促進(jìn)細(xì)胞死亡或抑制感染細(xì)胞凋亡[35]。首先，自噬可能是牙周炎時細(xì)胞死亡的一種模式。由牙周厭氧菌生成和釋放，隨后被齦下成熟菌斑高度濃縮的丁鹽酸在牙齦上皮細(xì)胞啟動自噬而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[36]。其次，自噬可能阻斷凋亡誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡并保持細(xì)胞在牙周炎癥微環(huán)境中的生存能力。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)自噬被抑制時，牙周炎患者外周血單核細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞活力下降[34]。用自噬的抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MeA）作用于LPS處理過的HGFs，發(fā)現(xiàn)自噬受抑制，隨后出現(xiàn)細(xì)胞活力下降且細(xì)胞凋亡百分率增加[35]。牙周炎患者的牙周組織和牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）的體外實(shí)驗(yàn)也表明，牙周炎時自噬的激活可能保護(hù)細(xì)胞免于凋亡[37]。上述都說明自噬在牙周炎時對細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，并且自噬和凋亡在牙周炎中是共存的，推測這是牙周炎時自噬和凋亡的信號串?dāng)_所致，而究其根本可能是二者的上游調(diào)節(jié)因子之間相互作用的結(jié)果。因此，細(xì)胞凋亡與自噬之間的復(fù)雜關(guān)系可能是牙周炎發(fā)病機(jī)制的重要因素之一。再次，牙周病原菌也能調(diào)節(jié)牙周組織的自噬作用。P.g可利用自噬增強(qiáng)其滲透并定植于宿主牙周組織，內(nèi)化后P.g可誘導(dǎo)自噬，抑制感染宿主細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致牙周微環(huán)境有利于其復(fù)制和逃避宿主防御系統(tǒng)[38]。Cho等[39]的研究還報道了P.g的細(xì)胞內(nèi)侵襲在感染細(xì)胞中誘導(dǎo)自噬，并通過G1細(xì)胞周期停滯來抑制細(xì)胞增殖。此外，據(jù)報道P.g位于早期內(nèi)涵體內(nèi)，大約一半的內(nèi)化生物體被分選到裂解室，包括自噬體[40]，而相當(dāng)數(shù)量的特定內(nèi)涵體內(nèi)剩余的細(xì)胞內(nèi)病原體可以調(diào)節(jié)受感染細(xì)胞的細(xì)菌出口，導(dǎo)致它們能進(jìn)一步滲透至牙周組織[41]?？傊?，自噬能通過介導(dǎo)P.g的存活、復(fù)制和傳播影響牙周炎的發(fā)病和進(jìn)展。綜上所述，自噬可能通過以下機(jī)制參與牙周炎的發(fā)生發(fā)展：①調(diào)節(jié)免疫信號，導(dǎo)致炎性疾病和牙周組織損傷；②保護(hù)牙周細(xì)胞免于凋亡；③調(diào)節(jié)牙周病原菌的入侵。

3 小結(jié)和展望

大量研究證據(jù)表明，生理水平的ROS可以作為激活對牙周組織有益的應(yīng)激反應(yīng)的信號分子，但過量的ROS和/或抗氧化缺陷則會導(dǎo)致牙周組織的氧化損傷和功能障礙。本文梳理了目前已證實(shí)的幾種ROS對牙周炎發(fā)病和促進(jìn)疾病發(fā)展的機(jī)制，一來旨在從這一角度對牙周炎的發(fā)病機(jī)制和病程進(jìn)展有個總體認(rèn)識，二來希望能對未來關(guān)于這一方面的研究有所助益。未來我們還需深究局部和系統(tǒng)性氧化還原狀態(tài)在牙周炎的作用機(jī)制，并利用這些研究成果研發(fā)新藥或嘗試用于臨床治療，以確定針對氧化應(yīng)激的特異性干預(yù)是否有益于臨床療效。

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