趙玉紅, 李 欣, 趙立青, 李小菊, 石建黨, 李登文, 張金紅, 周 浩

(南開大學(xué) 生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心, 天津 300071)

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)是在傳統(tǒng)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)[1],具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)、污染少且能實(shí)時監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于mRNA表達(dá)分析、基因定量分析、點(diǎn)突變分析、等位基因分析、單核苷酸多態(tài)性分析、DNA甲基化的檢測及對多種傳染病病原體的定量定性分析等[2]。其基本工作原理是:在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累來實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,得到產(chǎn)物擴(kuò)增曲線,然后采用合適的數(shù)據(jù)分析方法,計(jì)算初始模板數(shù)量(絕對定量)或初始模板數(shù)量的相對比值(相對定量)[3]。

為使學(xué)生掌握這項(xiàng)在生命科學(xué)中廣泛應(yīng)用的先進(jìn)核酸定量分析技術(shù),設(shè)計(jì)“實(shí)時熒光定量PCR分析IPTG誘導(dǎo)EGFP基因在大腸桿菌中的異源表達(dá)”綜合實(shí)驗(yàn)。將EGFP基因插入原核表達(dá)載體pET-28a中,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21。以IPTG(異丙基硫代β-D-半乳糖苷)不同的誘導(dǎo)濃度、不同的誘導(dǎo)溫度對增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),分析IPTG不同誘導(dǎo)濃度、不同誘導(dǎo)溫度對蛋白表達(dá)量的影響,以確定最佳表達(dá)條件。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

菌株：含pET-28a-EGFP質(zhì)粒的大腸桿菌BL21。

主要試劑：細(xì)菌RNA提取試劑盒(Omega)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)，熒光定量預(yù)混試劑盒(SuperReal,TIANGEN)，LB培養(yǎng)基以及巰基乙醇、IPTG等。

主要儀器：實(shí)時熒光定量PCR儀(Bio-Rad-IQ5)，高速冷凍離心機(jī)(Beckman J-25)，金屬浴(卡尤迪)，渦旋混合儀(上海滬西-WH-2)以及超微量分光光度計(jì)(Nanodrop2000c)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大腸桿菌誘導(dǎo)培養(yǎng)及菌體收集

(1) 大腸桿菌誘導(dǎo)培養(yǎng)：在LB培養(yǎng)基中加入Amp(氨芐青霉素)至終質(zhì)量濃度為100 mg/L,37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜;將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌按1%的接種量接種于新的LB培養(yǎng)基(Amp終質(zhì)量濃度為100 mg/L),37 ℃、200 r/min培養(yǎng),OD600至0.6～0.8。

(2) 菌體收集：分裝菌液,共10份,每份10 mL,按照表1添加一系列濃度的IPTG,分別于16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)18 h、37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h。每3 mL收集一管菌體,可直接提取總RNA或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 IPTG不同濃度、不同溫度誘導(dǎo)培養(yǎng)下的大腸桿菌

2.2 大腸桿菌總RNA提取

參照試劑盒說明書。取3 mL菌液,4 ℃,5 000×g、離心6 min,去上清；加入100 μL溶菌酶/TE buffer,渦旋30 s,30 ℃、溫育10 min；加入350 μL BRK和30 mL beads,充分渦旋5 min,13 000g、離心5 min；取400 μL上清轉(zhuǎn)移至1.5 mL新管,70 ℃溫育5 min,13 000g、離心2 min；取上清轉(zhuǎn)移至新管,加入280 μL無水乙醇,劇烈渦旋15 s；將所有樣品轉(zhuǎn)移至2 mL離心管的吸附柱內(nèi),9 000g、離心30 s；加入400 μL RNA洗脫bufferⅠ,10 000g、離心2 min,棄洗脫液和收集管；加入500 μL洗脫bufferⅡ,9 000g、離心30 s,棄洗脫液；9 000g、空離2 min；轉(zhuǎn)移柱子至1.5 mL新管,加60 μL DEPC水,9 000g、離心1 min,重復(fù)1次。以DEPC水作為參照,用超微量分光光度計(jì)檢測RNA濃度及其純度。

2.3 反轉(zhuǎn)錄-PCR

以O(shè)ligo(dT)18作為引物,參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒使用說明書,按表2配制反轉(zhuǎn)錄體系,充分混勻,瞬時離心。每個樣品做3個平行,陰性對照不加模板RNA。RT-PCR反應(yīng)條件:25 ℃,5 min；42 ℃,60 min；70 ℃,5 min；4 ℃,Forever。所得cDNA可直接用于實(shí)時熒光定量PCR或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的體系

2.4 實(shí)時熒光定量PCR

2.4.1 PCR特異性引物的設(shè)計(jì)和合成

利用NCBI 上Gen Bank數(shù)據(jù)庫,查詢EGFP和大腸桿菌16S rRNA基因的mRNA序列,利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,并用BLAST進(jìn)行同源性比較,按引物設(shè)計(jì)原則和 BLAST 同源性比較結(jié)果,確定目的片段序列及長度。引物由華大基因合成。

16SrRNA-up1:CTTGCTGCTTTGCTGACGAG

16SrRNA-dn1:GGTCCCCCTCTTTGGTCTTG

擴(kuò)增片段長度為125 bp。

EGFP-up1:CAAGATCCGCCACAACATCG

EGFP-dn1:GACTGGGTGCTCAGGTAGTG

擴(kuò)增片段長度為120 bp。

2.4.2 反應(yīng)體系

反應(yīng)體系見表3。

表3 實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系

2.4.3 反應(yīng)程序

熒光定量擴(kuò)增反應(yīng)程序:(1)95 ℃預(yù)變性5 min；(2)95 ℃變性10 s；(3)60 ℃復(fù)性10 s；(4)72 ℃延伸20 s，(2)—(4)進(jìn)行40個循環(huán)；(5)在反應(yīng)程序結(jié)束后,以0.5 ℃/5 s的速率從60 ℃緩慢遞增到95 ℃,連續(xù)測定樣品的熒光強(qiáng)度,進(jìn)行熔解曲線分析。

2.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Excel 建立數(shù)據(jù)庫,應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間比較采用方差分析檢驗(yàn),以p<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 大腸桿菌總RNA提取

大腸桿菌中總RNA的提取結(jié)果見表4。結(jié)果顯示,用試劑盒法提取的RNA濃度較高,同時A260/A280比值在1.8～2.2之間,表明大腸桿菌總RNA提取質(zhì)量高,可用于后續(xù)的實(shí)時熒光定量PCR分析。

表4 大腸桿菌總RNA提取結(jié)果

3.2 擴(kuò)增曲線

熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1,擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)出熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期3個階段,S型曲線光滑平穩(wěn),符合定量檢測要求[4]。

圖1 擴(kuò)增曲線

3.3 熔解曲線

熔解曲線結(jié)果見圖2,擴(kuò)增產(chǎn)物為單一峰,對應(yīng)目的基因EGFP的Tm(DNA溶解溫度)值均一,未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和明顯引物二聚體。因此,可以采用SYBR GreenⅠ法進(jìn)行相對定量分析。

圖2 Real-time PCR熔解曲線

3.4 IPTG最佳誘導(dǎo)條件的確定

采用比較閾值法(2-△△Ct法)對實(shí)時熒光定量結(jié)果進(jìn)行分析。由軟件對EGFP基因和16s rRNA基因的擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析,分別得到相應(yīng)的Ct(cycle threshold)值,以樣本中的16s rRNA的Ct值作為內(nèi)參,根據(jù)公式2-ΔΔCt= 2-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)處理組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)對照組計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的2-ΔΔCt值,將對照組的2-ΔΔCt值設(shè)為 1,實(shí)驗(yàn)組

與之相比,進(jìn)行相對定量。結(jié)果見圖3,當(dāng)IPTG濃度為270 μmol/L、誘導(dǎo)溫度為16 ℃、誘導(dǎo)時間為18 h時,EGFP mRNA的表達(dá)量最大。在教學(xué)、科研工作中,可以根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的誘導(dǎo)條件:可以選擇低溫(16 ℃)、長時間誘導(dǎo)；也可以選擇高溫(37 ℃)、短時間誘導(dǎo),節(jié)約時間,提高實(shí)驗(yàn)效率。

圖3 IPTG不同溫度、不同濃度誘導(dǎo)大腸桿菌中EGFP的表達(dá)

4 教學(xué)探討

4.1 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法的選擇

常用的實(shí)時定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法主要有染料法和熒光探針法2種。

(1) 雙鏈DNA結(jié)合染料。某些染料能結(jié)合到雙鏈DNA上,發(fā)射熒光,并且結(jié)合后的染料發(fā)光強(qiáng)度明顯增加。隨著PCR過程中雙鏈的指數(shù)級增長,更多的染料結(jié)合到雙鏈DNA中,將信號進(jìn)一步放大。當(dāng)DNA變性時,信號又降下來。通過檢測結(jié)合到雙鏈DNA上的熒光染料,可以觀察到一個動態(tài)的擴(kuò)增過程。但該方法有2個缺點(diǎn): 一是它的特異性完全依賴于引物,二是熒光信號的強(qiáng)弱依賴于雙鏈DNA的質(zhì)量而不是分子數(shù),因而特異性相對較低[5]。

(2) 熒光探針法。熒光探針法主要包括水解探針(hydrolysis probe)、分子信標(biāo)(molecular beacon)和雜交探針(hybridization probe)等[6-7],利用各種不同探針與DNA特異性的結(jié)合,提高檢測的靈敏度,但需要合成高成本的熒光探針,成本較高。

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時熒光定量PCR中常用的SYBR Green Ⅰ染料法。SYBR GreenⅠ是一種非飽和性熒光染料,能夠結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位,實(shí)時監(jiān)測擴(kuò)增進(jìn)程,而且價格相對較低、通用性好,能夠滿足一般的教學(xué)需求。但是,由于SYBR GreenⅠ能與任何ds DNA結(jié)合,因此它也能與非特異性的ds DNA(如引物二聚體)結(jié)合,使實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生假陽性結(jié)果[8],影響定量的準(zhǔn)確性。為提高檢測結(jié)果的靈敏度,本實(shí)驗(yàn)選用大腸桿菌中高度保守的16S rRNA序列設(shè)計(jì)引物，并確立最佳的退火溫度，結(jié)合熔解曲線(melting curve)優(yōu)化反應(yīng)條件,排除非特異性擴(kuò)增和引物二聚體與染料非特異性結(jié)合而引起的干擾。

4.2 內(nèi)參基因的選擇

合適的內(nèi)參基因?qū)τ谀康幕虻臄?shù)據(jù)校正非常重要,正確選擇內(nèi)參基因可以降低起始樣本質(zhì)和量的誤差以及反應(yīng)效率的誤差[9]。理想的內(nèi)參基因應(yīng)滿足以下條件:在分析的組織或樣品中表達(dá)穩(wěn)定；表達(dá)不受內(nèi)源性或外源性因素的影響;表達(dá)水平與目的基因表達(dá)水平相近；不存在假基因(pseudogene)的干擾。

因此在進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR分析時,應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的內(nèi)參基因,以提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。

4.3 數(shù)據(jù)分析

常見的實(shí)時熒光定量分析包括相對定量和絕對定量兩種方法。

(1) 相對定量。通過比較目的基因和內(nèi)參基因的相對含量變化來判斷基因轉(zhuǎn)錄的變化。

(2) 絕對定量。使用一系列已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立Ct值與起始模板量對數(shù)值之間的線性關(guān)系。通過未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出未知樣品的起始拷貝數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)采用了相對定量中常用的2-△△Ct法,其中△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)對照組。實(shí)驗(yàn)中,要求學(xué)生了解實(shí)時熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值3個概念，掌握熒光閾值設(shè)定的基本原則、明確Ct值的概念以及以Ct 值進(jìn)行定量的原理。

4.4 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

(1) RNA提取過程中所用的槍頭、離心管等皆為RNase free,且經(jīng)高壓滅菌處理。

(2) 菌體生長到對數(shù)生長期,OD600達(dá)到0.6～0.8之間時,再進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

(3) IPTG濃度梯度設(shè)計(jì)要合理,以保證熒光定量分析時Ct值具有明顯的梯度差,利于數(shù)據(jù)分析[10]。

(4) 為盡量減少操作誤差,在制備反應(yīng)體系時應(yīng)先制備混合反應(yīng)液,混勻后再分裝到PCR反應(yīng)管中。

(5) 為提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性,需要設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)和陰性對照。設(shè)置重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的目的在于按照統(tǒng)計(jì)學(xué)要求,對數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的校正以消除誤差[8]；設(shè)置陰性對照的目的在于檢測實(shí)驗(yàn)中所用的引物、模板、酶等是否受到污染,若體系中存在污染,則實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可用。

(6) 由于總RNA得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素,用于定量分析的初始樣品濃度不同。雖然實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)中會用一些看家基因來校正因樣品初始濃度不同而造成的差異,但是建議保持初始模板量(RNA或cDNA)一致,盡量減少實(shí)驗(yàn)誤差,提高結(jié)果的可靠性。

5 結(jié)語

由于受操作復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期長、成本高等因素影響,目前在科研實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用的實(shí)時定量PCR分析技術(shù)難以應(yīng)用于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)。為此設(shè)計(jì)“實(shí)時熒光定量PCR分析IPTG誘導(dǎo)EGFP基因在大腸桿菌中的異源表達(dá)”綜合性實(shí)驗(yàn),通過培養(yǎng)誘導(dǎo)菌體蛋白表達(dá)、提取大腸桿菌總RNA、反轉(zhuǎn)錄、實(shí)時定量PCR、結(jié)果分析與討論,使學(xué)生有機(jī)會在16個學(xué)時里就可以學(xué)習(xí)到這項(xiàng)先進(jìn)的分析技術(shù),開闊視野,為今后自主開展科學(xué)研究工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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