潘怡然,崔康平,張 碩,常佳麗,黃 霞* (.合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,安徽 合肥 30009；.清華大學(xué),環(huán)境模擬與污染控制國家重點實驗室,北京 00084)

厭氧消化是有機(jī)廢物資源化的重要手段.厭氧消化按照操作溫度的不同可分為低溫消化、中溫消化和高溫消化.高溫厭氧消化由于具有更好的水解效果往往比中低溫消化具有更好的產(chǎn)甲烷效果[1].厭氧消化一般認(rèn)為需要經(jīng)過三個階段:水解、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸及產(chǎn)甲烷.其中產(chǎn)甲烷階段因為產(chǎn)甲烷古菌的世代周期長、對生長條件要求苛刻等原因,生長緩慢,所以往往是厭氧消化過程主要的限制性步驟[2].

最近研究發(fā)現(xiàn)顆?；钚蕴?GAC)能通過直接種間電子傳遞(DIET)過程提高產(chǎn)甲烷的速率[3-4].DIET是一種新型互營產(chǎn)甲烷方式.傳統(tǒng)的產(chǎn)甲烷互營過程[5],是指互營菌通過產(chǎn)生的載體即氫氣或者甲酸鹽將電子傳遞給產(chǎn)甲烷菌[6-7].而DIET是通過細(xì)菌自身產(chǎn)生的中介體實現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移[8-9],這種過程由于減少了傳質(zhì)阻力而速度快于傳統(tǒng)互營方式[10].Liu等[3]首次發(fā)現(xiàn)DIET產(chǎn)甲烷過程的存在.但是,目前的研究只關(guān)注 GAC對中溫厭氧消化產(chǎn)甲烷的影響,GAC對于高溫消化的影響尚未有文獻(xiàn)記載.由于溫度條件的差異,高溫消化的群落與中溫差異明顯[11].另外,目前研究確認(rèn)的可以通過DIET給出電子的細(xì)菌僅有電活性菌Geobacter,而且已知的Geobacter均生活在35℃以下[12],所以GAC能否通過DIET作用來促進(jìn)高溫消化產(chǎn)甲烷尚不清楚.因此本研究的目的是觀察 GAC對高溫消化過程的影響,分析微生物量和群落結(jié)構(gòu)的變化并探究其中的機(jī)理.

1 材料與方法

1.1 產(chǎn)甲烷潛勢批實驗

1.1.1 接種源 厭氧污泥取自北京市小紅門污水處理廠的中溫厭氧發(fā)酵罐,污泥濃度 MLVSS為(17.62±0.61)g/L.

1.1.2 GAC預(yù)處理 實驗選用椰殼制顆粒活性炭,購買于上海市 Heaton環(huán)?？萍加邢薰?經(jīng)過研磨過20目篩,酸洗?堿洗?水洗?105℃烘干備用.為避免活性炭對基質(zhì)吸附的影響,在培養(yǎng)基不添加厭氧污泥的情況下對顆粒活性炭進(jìn)行吸附飽和.

表1 實驗設(shè)計Table 1 Experiment design

1.1.3 批實驗 以 120mL血清瓶作為反應(yīng)器,每瓶添加培養(yǎng)基 50mL.實驗設(shè)置如表 1所示,每一種設(shè)置有 3個平行樣.培養(yǎng)基成分:乙酸鈉20mmol/L, NH4Cl 1.0g, NaCl 0.25g, MgCl2?6H2O 0.1g, CaCl2?2H2O 0.1g, KH2PO40.11g,K2HPO4?3H2O 0.22g, Na2SO40.05g,微量元素和維生素配方參考之前的研究[13].培養(yǎng)基中分別加入 1g鮮重的厭氧污泥,1g預(yù)處理過的顆?；钚蕴?CO2/N2混合氣(體積比 1:4)曝氣除氧,密封后至于55℃, 150rpm搖床培養(yǎng).在培養(yǎng)過程中監(jiān)測頂空產(chǎn)氣和液相中乙酸濃度變化,產(chǎn)氣達(dá)到平臺期時,批實驗結(jié)束.

1.2 化學(xué)分析

1.2.1 MLVSS 污泥濃度用混合液揮發(fā)性固體濃度MLVSS表征,依據(jù)國標(biāo)法測試.

1.2.2 甲烷含量 頂空甲烷含量采用 gilent 7890B氣相色譜儀(TCD檢測器,porapak Q柱和molsieve 5A柱;N2載氣45mL/min;He載氣25mL/min;氣體烘箱溫度70℃;進(jìn)樣器溫度250℃;TCD溫度200℃).

1.2.3 乙酸濃度 使用 Agilent HPLC Model-1100(Atlantis T3色譜柱和UV柔性波長檢測器)分析樣品中乙酸基質(zhì)的濃度,流動相為0.05%H3PO4,流速為 3mL/min,柱溫為 55℃.自動進(jìn)樣,進(jìn)樣量為20μL.

1.3 分子生物學(xué)分析

1.3.1 DNA提取、高通量測序和數(shù)據(jù)分析 批實驗后,提取主要的3組實驗樣品的DNA,分別標(biāo)記為AS-origin (起始厭氧污泥), AS-end (未添加GAC的對照組厭氧泥),GAC+AS(添加GAC的實驗組厭氧泥).收集含有顆粒活性炭的生物樣品時,需要水洗劇烈搖晃多次,將顆?；钚蕴勘砻娴纳锬は聪聛?將生物樣品離心冷凍保存.本研究使用Fast-DNA Spin Kit for Soil(MP Biomedicals,santa Ana,CA)試劑盒提取 DNA,使用 Nanodrop?Spectrophotometer ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)分析提取的核酸濃度和純度.

16S rRNA測序使用引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和 806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’),借助 Illumina Miseq平臺(北京計算中心)進(jìn)行.使用 QIIME進(jìn)行序列分析,選擇 UCLUST方法分析操作分類單位(OTUs)的代表性序列,在RDP分類器上注釋分類信息.

1.3.2 定量PCR 運(yùn)用定量PCR測定總細(xì)菌?總古菌和產(chǎn)甲烷菌的量,總細(xì)菌通過測定細(xì)菌16S rRNA基因的拷貝數(shù)來定量,選擇的引物為Bac519f/Bac907r;總古菌通過測定古菌 16S rRNA基因的拷貝數(shù)來定量,選擇的引物為Ar364f/Ar934r[14];產(chǎn)甲烷菌通過測定 mcrA基因的拷貝數(shù)來定量,選擇的引物為 ME1f/ME3r[15].在iCycler IQ三倍體器(Bio-Rad)上經(jīng)過熱循環(huán),采集熒光信號等過程得出標(biāo)準(zhǔn)樣和模板相應(yīng)的拷貝數(shù)[14-16].

2 結(jié)果與討論

2.1 GAC促進(jìn)高溫消化產(chǎn)甲烷

如圖1所示,在投加GAC條件下高溫厭氧消化產(chǎn)甲烷過程得到促進(jìn).投加 GAC的實驗組最大產(chǎn)甲烷速率開始于第 7d,最大產(chǎn)甲烷速率為0.217mol/(L?d)快于開始于第10d的未投加GAC的對照組的最大產(chǎn)甲烷速率0.083mol/(L?d);且前者達(dá)到平臺期需要的時間為 16d,要明顯短于后者4d左右.如圖2所示,添加GAC的實驗組乙酸消耗較快,乙酸平均降解速率達(dá)到 0.093g/(L?d),速率明顯大于未添加GAC對照組的乙酸平均降解速率 0.074g/(L?d),與產(chǎn)氣趨勢相對應(yīng).未投加乙酸只加厭氧泥的空白對照CK1的產(chǎn)甲烷量只有對應(yīng)實驗組的 2%不到,乙酸也未見降解.該結(jié)果可排除吸附飽和的乙酸對試驗的影響.未加乙酸和厭氧泥的非生物空白對照 CK2,未見甲烷的產(chǎn)生和乙酸的降解,該結(jié)果可排除背景生物環(huán)境的影響.

圖1 頂空中甲烷含量Fig.1 The amount of methane in headspace

圖2 乙酸濃度的變化Fig.2 Variation of Acetate concentration

本研究結(jié)果與近期的研究相似.Liu等[3]在Geobacter metallireducens和 Methanosarcina barkeri互營共培養(yǎng)體系中,發(fā)現(xiàn)投加 GAC促進(jìn)產(chǎn)CH4速率約2.5倍.Lee等[4]在半連續(xù)厭氧反應(yīng)器中投加 GAC,發(fā)現(xiàn) GAC促進(jìn)產(chǎn) CH4速率約80%.

2.2 生物量變化

圖3 細(xì)菌、古菌和甲烷古菌的定量PCR結(jié)果Fig.3 Quantative PCR results of bacteria, archaea, and methangen

采用定量PCR分析總細(xì)菌、古菌、產(chǎn)甲烷古菌的總數(shù).如圖 3所示,實驗組與對照組總細(xì)菌、古菌、產(chǎn)甲烷古菌的總數(shù)變化不大,均在同一數(shù)量級范圍內(nèi),說明 GAC載體對于生物量的貢獻(xiàn)微小.這有可能是因為載體表面之間的摩擦使得生物難以附著.GAC的添加對甲烷古菌有明顯的促進(jìn)作用,宿程遠(yuǎn)等[17]研究生物質(zhì)炭的添加對厭氧體系的作用,通過三維熒光光譜和傅里葉紅外分析發(fā)現(xiàn),生物質(zhì)炭的投加能夠促進(jìn)產(chǎn)甲烷菌的活性.

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)變化

生物種群結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)基于16sRNA基因高通量測序.如圖 4所示,在門水平,厭氧污泥處理前后具有一定的相似性,Euyarchaeota均為優(yōu)勢古菌,Firmicutes,Synergistetes, Chloroflexi為共同的優(yōu)勢細(xì)菌.但厭氧污泥處理前后也表現(xiàn)出明顯的差異,起始污泥的優(yōu)勢細(xì)菌Bacteroidetes和WWE1經(jīng)過批實驗處理后成為非優(yōu)勢細(xì)菌,另外Termotogae和OP8經(jīng)過實驗處理后比例明顯上升.

圖4 門水平種群結(jié)構(gòu)Fig.4 Microbial structure in pylum level

在科水平進(jìn)一步分析群落結(jié)構(gòu)變化.在細(xì)菌方面,如圖 5所示,起始污泥優(yōu)勢菌群Dethiosulfobiaceae (7%), D2 (13%),經(jīng)過高溫以及加入GAC的處理后,這兩種菌群的比例下降明顯;在經(jīng)過高溫處理但未加 GAC的處理中,Thermodesulfolbiaceaea (9%)比例增加明顯并成為其優(yōu)勢細(xì)菌,并強(qiáng)化出 Termotogae;在經(jīng)過高溫處理且加入GAC的處理中, Thermodesulfolbiaceaea(21%)和 Anaerobaculaceae (11%)的比例增加明顯且稱為優(yōu)勢菌群,并強(qiáng)化出Termotogae.在古菌方面,如圖 6所示,起始污泥優(yōu)勢甲烷古菌為Methanosaetaceae (14%),在經(jīng)過高溫處理但未加GAC的處理中以及加入GAC的處理中,優(yōu)勢的甲烷古菌均變?yōu)镸ethanosacinaceae (比例分別為42%和11%).

圖5 科水平優(yōu)勢細(xì)菌分布Fig.5 Dominate bacteria in family level

圖6 科水平優(yōu)勢產(chǎn)甲烷古菌分布Fig.6 Dominate methanogen at fanmily level

本研究種群結(jié)構(gòu)的明顯變化與高溫處理緊密相關(guān).高溫處理后的污泥中,不論有無添加GAC,高溫消化菌 Thermodesulfolbiaceae均成為優(yōu)勢細(xì)菌,高溫消化菌 Termotogae均得以強(qiáng)化,Methanosacinaceae成為優(yōu)勢古菌.這與以往高溫消化的群落研究相似.Ho等[1]在剩余污泥高溫消化的研究中,發(fā)現(xiàn)Methanosacinaceae為優(yōu)勢甲烷古菌,高溫消化菌Termotogae的比例明顯提高.

添加GAC和未加GAC的處理相比,群落結(jié)構(gòu)非常相近,主要的差異表現(xiàn)在Anaerobaculaceae上,在加入GAC的處理中該科細(xì)菌明顯富集并成為優(yōu)勢菌群,目前對于 Anaerobaculaceae(屬于梭桿菌綱)的研究較少,尚不能確認(rèn)其在添加 GAC的厭氧群落中的功能.加入 GAC的處理中沒有發(fā)現(xiàn)已知電活性菌的存在,這意味著在高溫消化群落之中可能存在其他可以向甲烷古菌直接傳遞電子的細(xì)菌,這留待進(jìn)一步更為細(xì)致的研究.

3 結(jié)論

3.1 GAC的加入明顯促進(jìn)高溫消化,通過定量PCR分析這種促進(jìn)的機(jī)理與GAC對生物量的貢獻(xiàn)并不相關(guān).

3.2 高通量測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)高溫下添加 GAC富集了高溫消化菌 Thermodesulfolbiaceae,Anaerobaculaceae,以及古菌Methanosacinacea.

3.3 需要進(jìn)一步研究 GAC對高溫消化的強(qiáng)化機(jī)理,在下一步研究中需要進(jìn)行長期實驗,解析微生物群落的響應(yīng).

參考文獻(xiàn)：

[1]Ho D P, Jensen P D, Batstone D J. Methanosarcinaceae and acetate-oxidizing pathways dominate in high-rate thermophilic anaerobic digestion of waste-activated sludge [J]. Applied &Environmental Microbiology, 2013,79(20):6491.

[2]Carballa M, Regueiro L, Lema J M. Microbial management of anaerobic digestion: exploiting the microbiome-functionality nexus [J]. Current Opinion in Biotechnology, 2015,33:103-111.

[3]Liu F, Rotaru A E, Shrestha P M, et al. Promoting direct interspecies electron transfer with activated carbon [J]. Energy &Environmental Science, 2012,5(10):8982-8989.

[4]Lee J Y, Lee S H, Park H D. Enrichment of specific electro-active microorganisms and enhancement of methane production by adding granular activated carbon in anaerobic reactors [J].Bioresource Technology, 2016,205:205.

[5]Schink B. Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation [J]. Microbiology & Molecular Biology Reviews Mmbr, 1997,61(2):262-280.

[6]McInerney M J, Sieber J R, Gunsalus R P. Syntrophy in anaerobic global carbon cycles [J]. Current opinion in biotechnology, 2009,20(6):623-632.

[7]Stams A J M, Plugge C M. Electron transfer in syntrophic communities of anaerobic bacteria and archaea [J]. Nature Reviews Microbiology, 2009,7(8):568-577.

[8]Reguera G, Mccarthy K D, Mehta T, et al. Extracellular electron transfer via microbial nanowires [J]. Nature, 2005,435(7045):1098-1101.

[9]Malvankar N S, Vargas M, Nevin K P, et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks [J]. Nature Nanotechnology, 2011,6(9):573-579.

[10]Cruz V C, Rossetti S, Fazi S, et al. Magnetite particles triggering a faster and more robust syntrophic pathway of methanogenic propionate degradation [J]. Environmental Science & Technology,2014,48(13):7536.

[11]Dang H, Jensen P, Batstone D. Effects of Temperature and Hydraulic Retention Time on Acetotrophic Pathways and Performance in High-Rate Sludge Digestion [J]. Environmental Science & Technology, 2014,48(11):6468-6476.

[12]Lovley D R, Ueki T, Zhang T, et al. Geobacter : The Microbe Electric's Physiology, Ecology, and Practical Applications [J].Advances in Microbial Physiology, 2011,59:1.

[13]Morita M, Malvankar N S, Franks A E, et al. Potential for Direct Interspecies Electron Transfer in Methanogenic Wastewater Digester Aggregates [J]. Mbio, 2011,2(4):e00159-11.

[14]Kemnitz D, Kolb S, Conrad R. Phenotypic characterization of Rice Cluster III archaea without prior isolation by applying quantitative polymerase chain reaction to an enrichment culture[J]. Environmental Microbiology, 2005,7(4):553–565.

[15]Bao Q L, Xiao K Q, Chen Z, et al. Methane production and methanogenic archaeal communities in two types of paddy soil amended with different amounts of rice straw [J]. Fems Microbiology Ecology, 2014,88(2):372–385.

[16]Xu Y, Ma K, Huang S, et al. Diel cycle of methanogen mcrA transcripts in rice rhizosphere [J]. Environmental Microbiology Reports, 2012,4(6):655–663.

[17]宿程遠(yuǎn),鄭 鵬,盧宇翔,等.海泡石與生物質(zhì)炭強(qiáng)化厭氧處理養(yǎng)豬廢水 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2017,37(10):3764-3772.