包福祥 阿米娜 蘆婷 趙鑫鑫 錢英紅 杜雅楠*

1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院

2.農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院

犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)為負(fù)鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，可引起犬科、鼬科和浣熊科動物的急性、高度接觸性、致死性疾病，該病的主要傳染源為患病動物和隱性感染的帶毒動物。目前，犬瘟熱常年發(fā)生，呈散發(fā)、地方流行，傳染性強(qiáng)、發(fā)病率和死亡率高，是養(yǎng)犬業(yè)、經(jīng)濟(jì)動物養(yǎng)殖和野生動物危害最大的疾病之一。CDV由15616個核苷酸組成，編碼基因按3’～5’端排序依次為：3’端前導(dǎo)序列、核衣殼蛋白基因（N）、磷蛋白基因（P）、基質(zhì)蛋白基因（M）、融合蛋白基因（F）、血凝素蛋白基因（H）、聚合酶蛋白基因（L）和5’端引導(dǎo)序列。研究表明，CDV的N、F和H三種蛋白在病毒感染和宿主免疫方面起主要作用。因此，H、F和N蛋白的克隆和表達(dá)將對CDV的診斷和治療具有非常重要的意義。

一、材料和方法

1.材料

（1）主要試劑。英特威犬四聯(lián)疫苗（寵必威）由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)獸醫(yī)院劉俊平教授提供；Trizol試劑為Invitrogen產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；T4連接酶為NEB公司產(chǎn)品；Ex-Taq DNA聚合酶、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DL2000、DL5000 Maker、pMD19-T（Simple）Vector、EcoRI、XhoI、BamHI限制性內(nèi)切酶均購自Takara公司；大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)、Transetta (DE3)感受態(tài)購自北京全式金公司；Ni-NTA Sefinose(TM) Resin購自生工生物工程(上海)股份有限公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒購自碧云天公司。

（2）PCR引物。根據(jù)GenBank中發(fā)表的CDV Onderstepoort毒株基因序列，用Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)了三對特異性引物H1/H2、N1/N2、F1/F2，引物序列如表1所示，并在PCR產(chǎn)物上、下游分別引入酶切位點(diǎn)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 CDV H、F和N蛋白基因特異性引物

2.試驗(yàn)方法

（1）CDV H、F、N基 因 的PCR擴(kuò) 增。 利 用Trizol試劑法從英特威犬四聯(lián)疫苗中提取CDV總RNA，并以總RNA為模板，用oligo (dT)12-18為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以合成的cDNA為模板，H1/H2、N1/N2、F1/F2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將CDV H、F、N基因PCR產(chǎn)物回收后與pMD19-T Simple Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞。

（2）CDV H、F、N蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建。將pMD19T-H，pMD19T-N，pMD19T-F重組質(zhì)粒和pET-28a載體分別用XhoI/ BamHI 和XhoI /EcoRI進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并將得到的H、F、N片段和pET-28a載體進(jìn)行切膠回收，再利用T4連接酶將回收的片段和載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有Kana+抗性的LB固體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定。

（3）CDV H、F、N蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化。將鑒定正確的CDV H、F、N表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有Kana+抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落至3 ml 含有Kana+抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃ 200 rpm過夜培養(yǎng)。取1 ml的菌液接種到100 ml含有Kana+抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 rpm培養(yǎng)2 h，菌液OD600值達(dá)到0.4～0.6，加入終濃度1 mM的IPTG誘導(dǎo)5～8 h，4000 rpm離心10 min收集細(xì)菌，用PBS緩沖液洗滌兩次后用超聲破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，4℃1000 rpm離心10 min，分別收集破碎上清和沉淀，將沉淀用PBS溶液洗2次后加入3 ml帶有8 M尿素的Binding Buffer進(jìn)行溶解。將1 ml Ni-NTA resin放入15 ml 離心管中，加入3 ml Binding Buffer洗滌兩次，然后將蛋白加入平衡好的Ni-NTA resin中，在冰上靜止結(jié)合2 h，4℃ 5000 rpm離心5 min，收集上清，標(biāo)記為穿透液（FL），在Ni-NTA resin中加入2 ml Binding Buffer洗滌2次，洗滌液標(biāo)記為W，最后加入2 ml含有150 mM咪唑的Elution Buffer洗滌2次，標(biāo)記為E。將表達(dá)和純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測。

二、結(jié)果

1.CDV H、F、N基因的PCR擴(kuò)增

以H、F、N基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，如圖1所示，分別得到H基因990 bp、F基因939 bp和N基因1080 bp的片段，與預(yù)期目的片段大小相符。

2.CDV H、F、N蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

將CDV H、F、N基因連接pET-28a載體構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，以重組表達(dá)質(zhì)粒為模板，以H1/H2、N1/N2、F1/F2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，如圖2所示，得到與預(yù)期大小相符的片段。

圖1 CDV H、F、N基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 CDV H、F、N蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

將重組質(zhì)粒以XhoI/BamHI 和XhoI/EcoRI進(jìn)行酶切，結(jié)果如圖3所示，可以得到大小為5000 bp左右的pET-28a載體和1000 bp左右的CDV H、F、N基因片段，證明目的片段已正確插入pET-28a載體。

3. CDV H、F、N蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化產(chǎn)物SDSPAGE鑒定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Transetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)和經(jīng)親和純化后的蛋白進(jìn)行SDSPAGE分析，結(jié)果如圖4所示，顯示在相對分子量約37 KDa處有目的蛋白表達(dá)條帶，與預(yù)測的重組蛋白分子量相符。

圖4 重組蛋白SDS-PAGE鑒定結(jié)果

三、討論

犬瘟熱是目前危害犬科動物、經(jīng)濟(jì)動物和野生動物的主要疫病之一。研究發(fā)現(xiàn)，CDV的H、F和N蛋白在病毒感染和機(jī)體免疫過程中具有非常重要的作用。CDV H蛋白由19441946個核苷酸構(gòu)成，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，對CDV宿主的特異性起決定作用，是CDV重要的免疫原。H蛋白可通過結(jié)合到細(xì)胞表面的受體上而將CDV吸附到宿主細(xì)胞上，與F蛋白共同介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞間發(fā)生膜融合，進(jìn)入宿主細(xì)胞。F蛋白由2205個核苷酸組成，可以分為三個功能區(qū)：附著區(qū)、融合區(qū)和穿膜區(qū)，其中能對蛋白或整個病毒生物學(xué)特性造成影響的位于病毒粒子外側(cè)的附著區(qū)和融合區(qū)是病毒感染細(xì)胞并在宿主體內(nèi)擴(kuò)散所必需的重要成分。N蛋白是CDV含量最多的蛋白，由1683個核苷酸組成。N蛋白包括三個區(qū)域：N末端可變區(qū)、C末端可變區(qū)和中間的高度保守區(qū)，中間的保守區(qū)在N蛋白的結(jié)構(gòu)和功能中起主要作用。N蛋白因?yàn)槠漭^強(qiáng)的保守性，可以在感染初期就產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，同時引起抗體反應(yīng)。因此，在患病的初期診斷和治療中，N蛋白有較為重要的影響。本研究所表達(dá)和純化的CDV H、F和N蛋白為CDV的診斷方法和治療性抗體的開發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。