劉 培,董文淵,鄭靜楠,浦 嬋,張孟楠
(1.西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室(西南林業(yè)大學(xué)),云南 昆明 650224; 2.西南林業(yè)大學(xué) 云南生物多樣性研究院,云南 昆明 650224;3.西南林業(yè)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,云南 昆明 650224)
筇竹(Qiongzhueatumidinoda),屬禾本科(Gramineae)筇竹屬(Qiongzhuea)植物, 為地下莖復(fù)軸混生的小型竹種,被列為國家三級保護的珍稀瀕危竹種之一[1],僅分布于中國的西南部分地區(qū),筇竹節(jié)間隆起獨特,是重要的工藝用竹,筇竹筍味道鮮美,營養(yǎng)豐富,遠銷海內(nèi)外,具有重要的生態(tài)價值、觀賞價值和經(jīng)濟價值。近年來筇竹無性系種群嚴重退化,同時開花現(xiàn)象較為常見,群數(shù)量急劇減少[2-3]。竹類植物有生長快速、分布廣泛、使用多樣性等特點,是木材不可或缺的替代物[4]。植物葉結(jié)構(gòu)特征與系統(tǒng)分類[5-6]、光合速率[7]和抗逆性[8]等密切相關(guān)。解剖形態(tài)觀察和比較分析作為認識、保護、開發(fā)筇竹的有效途徑卻鮮見報道[9]。筇竹葉解剖學(xué)研究作為筇竹研究的基礎(chǔ),是筇竹后續(xù)研究不可缺少的一部分,將對筇竹資源的可持續(xù)開發(fā)利用和保護提供重要的依據(jù)。
材料:筇竹葉片2016年2-3月采集于云南省昭通市大關(guān)縣木桿鎮(zhèn)細沙村大羅漢壩。該地區(qū)地處云南省東北部,屬于中溫帶氣候,溫差較小,年平均氣溫9~12℃,年平均光照966.7 h,年平均降水量991.7 mm。試驗地竹林海拔1 550~1 640 m,坡度39°~44°。土壤以黃棕壤為主,成土母巖為花崗巖,土層深厚且濕潤,呈酸性反應(yīng);林分郁閉度大,林下形成深厚的腐殖層,林下生長有其他植物。
主要儀器:生物組織包埋機、石蠟切片機、烘片機、Nikon E100光學(xué)顯微-拍攝系統(tǒng)。
分別取自稈齡1~4年生的筇竹,每一年齡各選取3株,每株從中部冠層取不同枝條上長勢良好、無病蟲害的成熟葉片,每枝至少3片。將取好的葉片立即放入70%的FAA固定液固定,切片前用15%的HF去硅38 h,流水沖洗1 d,常規(guī)石蠟制片,切片厚度8~10 μm,番紅-固綠對染,Nikon E100光學(xué)顯微鏡下觀察拍照,D3K-MS測量細胞長度、厚度,每類細胞至少測量50個,同時測量以下指標:主脈木質(zhì)部導(dǎo)管數(shù)、葉肉細胞層數(shù)、梭形細胞長、梭形細胞寬、泡狀細胞數(shù)。
直接觀察制片圖片,獲取主脈木質(zhì)部導(dǎo)管數(shù)、葉肉細胞層數(shù)、泡狀細胞數(shù)(選取3個視野進行測定,取均值) 。
在40倍鏡下利用圖像分析系統(tǒng)隨機測定梭形細胞、表皮細胞、葉肉細胞、薄壁細胞、厚壁細胞、泡狀細胞的長度和寬度(梭形細胞至少測3個,其余細胞每類至少測50個,取均值)。測量的數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0軟件進行分析。
筇竹葉片的顯微結(jié)構(gòu)與其他竹類植物的葉片在結(jié)構(gòu)上差異不大,主要分為表皮、葉肉、葉脈3部分(圖1)。因此,在種的分類上沒有多少參考意義,符合早期一些學(xué)者的研究結(jié)論[10]。
2.1.1 表皮 筇竹葉片表皮分為上表皮和下表皮且各只有1層細胞,長5.22~20.38 μm,寬3.90~14.68 μm。上表皮細胞較大,具有光滑平厚的角質(zhì)層(圖1B-7),并有少量氣孔和硅細胞,在2個維管束間,具有大型泡狀細胞(圖1A-2,圖1B-2)。泡狀細胞一般為2~5個,長14.98~34.88 μm,寬9.99~32.97 μm,排列為扇形,中間細胞較大,兩旁較小,常深入到葉肉1/3以上的部位。但在葉片的邊緣無泡狀細胞的分布。下表皮細胞形狀差異很大,不存在泡狀細胞,角質(zhì)層向外突出成刺狀形成大小不等的乳突(圖1A-8,圖1B-8),并排列著豐富的氣孔和硅質(zhì)細胞(圖1B-3)。
2.1.2 葉肉 筇竹葉肉細胞常為3~4層,靠近上表皮的第1層的細胞較大,排列較整齊,為細胞壁自上而下單向指狀向內(nèi)褶疊的臂細胞(圖1B-4),長7.67~25.20 μm,寬2.68~13.86 μm。其他層的葉肉細胞壁呈放射狀或不規(guī)則狀。維管束兩側(cè)的葉肉細胞為無色透明的大型梭形細胞,長24.49~78.17 μm,寬5.37~15.01 μm。筇竹葉梭形細胞僅存在于離主脈最近的2個一級平行脈之間,且在葉緣的部位沒有觀察到梭形細胞的分布。趙惠如[11]等認為梭形細胞的有無、大小與葉肉細胞的分化程度有關(guān)。但有學(xué)者根據(jù)梭形細胞的位置特點,推測其可能與葉肉細胞的水分貯存和運輸有關(guān);也有學(xué)者根據(jù)其無色透明的特點,認為梭形細胞有利于光線更好的透進葉肉細胞[12]。
2.1.3 葉脈 禾本科植物的葉脈分為主脈及兩側(cè)的平行脈,且由維管束鞘及維管束組成[13]。竹類的葉維管束外圍無“花環(huán)”構(gòu)造,因此它是一個C3低光效植物[14]。按照丁雨龍[15]等的命名方法,又可將主脈兩側(cè)的平行脈分為一級平行脈,二級平行脈等。筇竹葉脈的維管束鞘通常由2層細胞組成:外層為較大的薄壁細胞,長5.68~13.74 μm,寬2.70~10.09 μm;內(nèi)層為厚壁細胞,長3.11~11.64 μm,寬1.83~8.19 μm。葉片以主脈的維管束發(fā)育最為完善,越細脈維管束的結(jié)構(gòu)越簡化,在二級平行脈及葉緣處的維管束往往無后生導(dǎo)管的發(fā)育,僅剩下孔徑較小的管胞和篩胞。
主脈維管束往往與許多小維管束交織在一起形成一個復(fù)合的維管系統(tǒng)(圖1-A1,圖2-A1,圖2-A2,圖2-A3,圖2-A4),這些小維管束具有完備的厚壁內(nèi)鞘和木質(zhì)部及韌皮部的分化,主脈外的維管束鞘細胞排列不規(guī)則,外層薄壁細胞大小不一,且往往不成完整的鞘狀,內(nèi)層是由 1~2 層排列不太整齊的厚壁細胞構(gòu)成。
注:(A):筇竹葉片橫切面,10X;(B)(C):筇竹葉片橫截面,40X;1-主脈維管束;2-泡狀細胞;3-氣孔;4-葉肉;5-二級平行脈;6-梭形細胞;7-上表皮;8-下表皮;9-薄壁細胞;10-厚壁細胞;11-一級平行脈。
圖1筇竹葉片解剖結(jié)構(gòu)
Fig.1 Leaves anatomical structure ofQ.tumidinoda
注:A1、B1、C1分別為1年生稈齡筇竹葉片主脈維管束、一級平行脈、二級平行脈;A2、B2、C2分別為2年生稈齡筇竹葉片主脈維管束、一級平行脈、二級平行脈;A3、B3、C3分別為3年生稈齡筇竹葉片主脈維管束、一級平行脈、二級平行脈;A4、B4、C4分別為4年生稈齡筇竹葉片主脈維管束、一級平行脈、二級平行脈。
圖2不同稈齡筇竹葉片解剖結(jié)構(gòu)
Fig.2 Leaves anatomical structure ofQ.tumidinodawith different stalk ages
一級平行脈有韌皮部、原生木質(zhì)部、次生木質(zhì)部導(dǎo)管等結(jié)構(gòu)(圖1-C1,圖2-B1,圖2-B2,圖2-B3,圖2-B4),韌皮部靠近遠軸面。維管束外被2層鞘細胞包圍,外層為薄壁細胞,內(nèi)層為厚壁細胞,維管束鞘細胞排列規(guī)則整齊。
二級平行脈木質(zhì)部沒有大型的導(dǎo)管,韌皮部也較小(圖1-A5,圖2-C1,圖2-C2,圖2-C3,圖2-C4)。外層薄壁鞘細胞比內(nèi)層厚壁鞘細胞發(fā)達,束外兩層維管束鞘細胞排列規(guī)則整齊。
葉脈維管束木質(zhì)部導(dǎo)管及韌皮部的排列,靠近上表皮的近軸面為原生導(dǎo)管,兩側(cè)的后生導(dǎo)管和原生導(dǎo)管呈“V”形排列,后生木質(zhì)部往往在同一側(cè)分化出兩個大小相等的導(dǎo)管。韌皮部有大的篩管和小的伴胞組成。無論主脈及次級平行脈維管束的兩側(cè)均有厚壁組織與兩側(cè)的表皮相連,但以靠近下表皮的厚壁組織較為發(fā)達,數(shù)量多且木質(zhì)化程度高。這些結(jié)構(gòu)與王曙光[16]等描述的云南箭竹葉片結(jié)構(gòu)相似。
2.2.1 筇竹種群內(nèi)葉片解剖變異分析 通過對筇竹葉片解剖指標分析(表1)可知,筇竹種群內(nèi)葉片除葉肉細胞層數(shù)外,其余指標的變異系數(shù)均超過15.68%,說明筇竹葉形態(tài)在種群內(nèi)遺傳多樣性比較豐富。其中,變異系數(shù)最大的是葉肉細胞寬度,達26.08%,變異系數(shù)最小的是葉肉細胞層數(shù),僅有9.30%,說明葉肉細胞寬度受環(huán)境影響較大,而葉肉細胞層數(shù)受環(huán)境影響較小,遺傳相對穩(wěn)定。
2.2.2 筇竹葉片不同細胞長寬回歸分析 為了研究筇竹葉片各類細胞長寬之間的相關(guān)關(guān)系,對筇竹表皮細胞、泡狀細胞、葉肉細胞、薄壁細胞、厚壁細胞的長與寬進行線性回歸分析(表2)。
表1 筇竹種群內(nèi)葉指標變異系數(shù)
表2 不同細胞長寬線性回歸方程
經(jīng)F檢驗,F(xiàn)分布的顯著概率全為0.000,說明表皮細胞寬、泡狀細胞寬、葉肉細胞寬、薄壁細胞寬、厚壁細胞寬作為自變量,分別與表皮細胞長、泡狀細胞長、葉肉細胞長、薄壁細胞長、厚壁細胞長作為因變量時存在高度相關(guān)的線性關(guān)系。由表2也可以看出,除葉肉細胞長與葉肉細胞寬相關(guān)性偏低,其余細胞長寬之間具有較高相關(guān)性。
表皮細胞長與表皮細胞寬之間的回歸方程為:
Y=X+4.208,R=0.664
泡狀細胞長與泡狀細胞寬之間的回歸方程為:
Y=0.731X+10.229,R=0.779
葉肉細胞長與葉肉細胞寬之間的回歸方程為:
Y=0.621X+9.951,R=0.305
薄壁細胞長與薄壁細胞寬之間的回歸方程為:
Y=0.813X+4.281,R= 0.611
厚壁細胞長與厚壁細胞寬之間的回歸方程為:
Y=0.757X+4.139,R= 0.555
在研究中,可用各類細胞的寬度對各類細胞的長度進行預(yù)測。
2.2.3 不同稈齡筇竹葉片解剖結(jié)構(gòu)分析 筇竹葉片的更新是周期性的,通常為1 次/a,可以通過竹葉更新時遺留的小枝痕數(shù)來判斷竹株的年齡。為了研究不同稈齡筇竹葉片之間是否存在差異,對不同稈齡的筇竹葉片細胞進行多重比較,結(jié)果見表3。
表3 不同稈齡筇竹葉片細胞差異比較
注:同一列里標有相同字母的平均值在a=0.05水平上差異不顯著。
由表3可知,不同稈齡的泡狀細胞長度、泡狀細胞寬度、薄壁細胞寬度及厚壁細胞寬度差異不顯著。不同稈齡的表皮細胞長度、表皮細胞寬度、葉肉細胞長度、葉肉細胞寬度、薄壁細胞長度、厚壁細胞長度中,僅表皮細胞長度稈齡2年生竹與1、3、4年生竹差異顯著;表皮細胞寬度稈齡1年生竹與2、3、4年生竹差異顯著;葉肉細胞寬度稈齡1年生竹與4年生竹差異顯著;薄壁細胞長度稈齡3年生竹與4年生竹差異顯著;厚壁細胞長度稈齡3年生竹與1、2、4年生竹差異顯著;葉肉細胞長度稈齡1年生竹與2年生竹差異不顯著,其余年生之間均有顯著差異。根據(jù)數(shù)據(jù)比較,多數(shù)指標不同年齡之間的差異并不顯著。即使有差異也是個別之間的差異,因此,筇竹稈齡并沒有對葉片形態(tài)特征產(chǎn)生明顯差別。
由表3還可知,不同稈齡筇竹葉片細胞變化規(guī)律,表皮細胞長寬均為稈齡2年生>4年生>3年生>1年生;泡狀細胞長度為稈齡2年生>3年生>4年生>1年生;泡狀細胞寬度為稈齡1年生≥3年生>2年生>4年生;葉肉細胞長寬均為稈齡1年生>2年生>3年生>4年生;薄壁細胞長度為稈齡3年生>1年生>2年生>4年生;薄壁細胞寬度為稈齡3年生>2年生>1年生>4年生;厚壁細胞長度為稈齡4年生>2年生>1年生>3年生;厚壁細胞寬度為稈齡1年生>4年生>2年生>3年生。葉肉細胞中含大量葉綠體,葉片進行光合作用的主要部分。葉綠素含量決定植物對太陽輻射的利用率[17],從不同稈齡的葉肉細胞長寬變化規(guī)律看出,1、2年生筇竹光合作用能力明顯高于3、4年生竹,因此,在筇竹無性系繁殖造林中,最好選用1、2年生新竹,有利于提高筇竹存活率。
植物葉的形態(tài)結(jié)構(gòu),在不同的環(huán)境條件下會表現(xiàn)出差異,這是植物對環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果,從植物組織結(jié)構(gòu)的研究中可以了解植物對特定環(huán)境的適應(yīng)性[18]。
本研究通過石蠟切片,對筇竹的葉片的顯微結(jié)構(gòu)進行了分析,發(fā)現(xiàn)筇竹葉片表皮細胞長5.22~20.38 μm,寬3.90~14.68 μm;泡狀細胞長14.98~34.88 μm,寬9.99~32.97 μm;葉肉細胞長7.67~25.20 μm,寬2.68~13.86 μm;薄壁細胞長5.68~13.74 μm,寬2.70~10.09 μm,厚壁細胞長3.11~11.64 μm,寬1.83~8.19 μm。筇竹葉片整體顯微結(jié)構(gòu)與其他竹類葉片結(jié)構(gòu)差異不大,在種的分類上沒有多少參考意義,只有找出各種竹類葉間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的差異性,才是對竹類系統(tǒng)分類有價值的參考依據(jù)。
對筇竹葉片顯微結(jié)構(gòu)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),種群內(nèi)筇竹葉片在顯微結(jié)構(gòu)上存在變異,各指標變異系數(shù)范圍為9.30%~26.08%,除個別指標外,變異系數(shù)均在15%以上。
構(gòu)建了筇竹葉片各類細胞長寬之間的回歸方程,表皮細胞長與表皮細胞寬之間的回歸方程為Y=X+4.208,R=0.664;泡狀細胞長與泡狀細胞寬之間的回歸方程Y=0.731X+10.229,R=0.779;葉肉細胞長與葉肉細胞寬之間的回歸方程Y=0.621X+9.951,R=0.305;薄壁細胞長與薄壁細胞寬之間的回歸方程Y=0.813X+4.281,R=0.611;厚壁細胞長與厚壁細胞寬之間的回歸方程Y=0.757X+4.139,R=0.555,可用各類細胞的寬度對各類細胞的長度進行預(yù)測。
對不同稈齡的筇竹葉片細胞進行多重比較,發(fā)現(xiàn)僅少數(shù)指標之間存在差異,多數(shù)指標不同年齡之間的差異并不顯著,筇竹稈齡并沒有對葉片形態(tài)特征產(chǎn)生明顯差別。1、2年生筇竹光合作用能力明顯高于3、4年生竹,因此,在筇竹無性系繁殖造林中,最好選用1、2年生新竹,有利于提高筇竹存活率。
筇竹葉片的更新是周期性的,通常為1 次/a,種群內(nèi)葉片顯微結(jié)構(gòu)存在變異,說明筇竹葉對生境變化反應(yīng)靈敏,形態(tài)可塑性大,對環(huán)境適應(yīng)能力強,遺傳多樣性比較豐富,原因可能是形態(tài)特征是基因與環(huán)境共同作用的產(chǎn)物。這些變異都將有利于筇竹的保護和開發(fā)利用,本文豐富了筇竹研究的基礎(chǔ)信息,但僅對筇竹葉片進行了研究,在實踐中還需要對筇竹其他營養(yǎng)器官的變異進行系統(tǒng)的研究。
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