饒麗莎，許珊珊*，黃田盛，理 挪，左丹丹，曹光球，林思祖

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州 350002；2.國家林業(yè)局 杉木工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002)

杉木(Cunninghamialanceolata)是我國南方特有的商品用材樹種[1]。主要分布在長江流域、秦嶺以南地區(qū)，在杉木主產(chǎn)區(qū)夏季高溫少雨，冬季寒冷干燥，極端低溫和干旱現(xiàn)象頻發(fā)。因此，杉木在生長過程中大多會(huì)面臨各種惡劣環(huán)境(洪澇，干旱，鋁毒害，鹽堿脅迫等)，容易引起杉木體內(nèi)活性氧代謝失衡，導(dǎo)致其體內(nèi)活性氧大量積累造成氧化損傷，最終使植物生長受抑。逆境脅迫下，為保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的傷害，植物在長期進(jìn)化過程中，建立了一套酶促和非酶促系統(tǒng)組成的抗氧化體系。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是一種抗氧化劑，是植物體內(nèi)清除自由基的重要成分。在清除植物體內(nèi)超氧陰離子自由基，減輕其對(duì)細(xì)胞的損傷，維持細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能中起著十分關(guān)鍵的作用[2]。研究表明，超氧化物歧化酶主要存在于需氧生物的各類器官中，比如細(xì)菌、原生生物和動(dòng)植物體內(nèi)，根據(jù)金屬輔因子的不同可將超氧化物歧化酶分為3類，即Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD[3]。Cu/Zn-SOD是超氧化物歧化酶結(jié)構(gòu)的第一族，占SOD的86%，高等植物中的Cu/Zn-SOD其大都存在于細(xì)胞溶膠和葉綠體中，在逆境中避免細(xì)胞與組織受到過量活性氧的損傷[4]。Ronald[5]等在1987年首次成功克隆出了玉米(Zeamays)的SOD2基因，隨后在木薯(Manihotesculenta)[6]、丹參(Salviamiltiorrhiza)[7]、油菜(Brassicanapus)[8]、蓮(Nymphaea)[9]、煙草(Nicotianatabacum)[10]、水稻(Oryzasativa)[11]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[12]、甘蔗(Saccharumofficinarum)[13]等植物中克隆獲得Cu/Zn-SOD基因。同時(shí)運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)將Cu/Zn-SOD基因轉(zhuǎn)化到煙草(NicotianatabacumL.)中，結(jié)果顯示Cu/Zn-SOD基因有效地提高煙草對(duì)鹽脅迫的耐受性[14]。B.D.McKersie[15]和Du[16]等將SOD基因分別轉(zhuǎn)入到苜蓿(MedicagoSativa)和玉米中，轉(zhuǎn)基因植株在逆境脅迫下的抗氧化能力均有明顯提高。目前，杉木關(guān)于超氧化物歧化酶的研究主要集中在逆境脅迫下酶活性的變化上，而對(duì)其基因?qū)用娴难芯枯^少。因此，研究杉木受逆境脅迫的相關(guān)基因，并對(duì)其進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，了解杉木在逆境脅迫下的耐受能力和抗逆分子機(jī)制，對(duì)克服逆境造成的農(nóng)林業(yè)的損害具有重要意義。本文以杉木組培苗為材料，根據(jù)杉木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)特異性引物，運(yùn)用RT-PCR獲得杉木Cu/Zn-SOD基因，利用生物信息學(xué)方法對(duì)其氨基酸組成、理化性質(zhì)、親疏水性、亞細(xì)胞定位、二級(jí)/三級(jí)結(jié)構(gòu)、磷酸化結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析，為進(jìn)一步探究杉木Cu/Zn-SOD基因在逆境脅迫中的功能及抗逆育種的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以國家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心組培室的020號(hào)組培苗作為試驗(yàn)材料，繼代在MS培養(yǎng)基中，待生長數(shù)月后整株取樣用于克隆分析。取成熟的杉木組培苗的根、莖和葉，用于組織特異性表達(dá)。取樣后迅速用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

取0.1 g杉木組培苗加入液氮迅速研磨至粉末狀，采用天根公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取總RNA。利用紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電檢測(cè)RNA的質(zhì)量。利用天根公司的TIANScript cDNA第1鏈合成試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)cDNA。

1.3 杉木Cu/Zn-SOD的克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)杉木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)特異性引物F1(5′-ATGGGTTCACTCAAGGCTGTTGCTG-3′)和R1(5′-TCAACCTTGAAGACCTATGACCCCG-3′)，進(jìn)行RT-PCR特異性擴(kuò)增目的片段。利用1.2反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板，采用50μ反應(yīng)體系全式金公司的2×TransTaq-T PCR SuperMix試劑盒進(jìn)行克隆。反應(yīng)條件為95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的條帶，連接PM18T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中篩選陽性克隆，送華大公司測(cè)序。

通過NCBI的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在線軟件對(duì)Cu/Zn-SOD基因進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測(cè)；通過NCBI和Phytozome11.0數(shù)據(jù)庫獲得Cu/Zn-SOD蛋白相似序列，采用Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)數(shù)據(jù)庫在線進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)；并用MEGA5.0軟件中的Neighbor-joining(臨位相連法)構(gòu)建蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。采用ExPASy-ProtParam tool軟件在線(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行杉木Cu/Zn-SOD蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析和親疏水性；用GORIV(http://npsa-pbil.ibcp.fr/)和SWISSMODEL(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白二級(jí)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；用Psort(http://psort.hgc.jp/form.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；通過軟件SignalIP4.1Server在線(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽；用NetPhos 2.0 Sever(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進(jìn)行磷酸化結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用Profun2.2Sever(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)進(jìn)行蛋白功能預(yù)測(cè)[17-18]。

1.4 杉木Cu/Zn-SOD組織特異性表達(dá)分析

試驗(yàn)以杉木Actin為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物F1：5′-CAGCAACTGGGATGATATGG-3′，R1：5′-ATTTCGCTTTCAGCAGTGGT-3′；擴(kuò)增杉木Cu/Zn-SOD基因設(shè)計(jì)引物F2：5′-ATTATAGGACGAGCTGTGGTTG-3′，R2：5′-AGTCTTCCGCCAGCATTT-3′。qPCR反應(yīng)采用TaKaRa生物公司的SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒，在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行試驗(yàn)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 杉木Cu/Zn-SOD基因的克隆

提取整株杉木組培苗總RNA并用紫外分光光度計(jì)測(cè)得A260/A280比值均在1.8～2.0，電泳檢測(cè)得28、18 s和5 s條帶清晰可見(圖1)，說明提取的RNA質(zhì)量較好，可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1條約461 bp的條帶(圖2)。

注：1.DL5000; 2.杉木總RNA。

2.2 杉木Cu/Zn-SOD同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用ORF Finder在線分析所得基因序列，結(jié)果表明該基因包含1個(gè)312 bp的開放閱讀框，編碼104個(gè)氨基酸(圖3)。利用DNAMAN軟件分析Cu/Zn-SOD序列(圖4)，與桉樹(Eucalyptusrobusta)、番茄(Lycopersiconesculentum)、甘薯(Dioscoreaesculenta)、南極草(Antarcticgrass)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、五色梅(Lantanacamara)、小麥(Triticumaestivum)、楊梅(Myricarubra)、楊樹(Populus)、油菜(Brassicanapus)、玉米、獐茅(Angiospermae)比對(duì)同源性總體為88.6%，序列一致性分別為77.12%、76.47%、77.78%、74.51%、76.47%、75.16%、72.55%、71.90%、79.08%、75.16%、77.12%、78.43%。通過構(gòu)建杉木和12個(gè)其他植物的Cu/Zn-SOD進(jìn)化樹(圖5)，發(fā)現(xiàn)杉木的Cu/Zn-SOD與南極草、小麥、玉米、獐茅聚為一類。結(jié)果表明杉木Cu/Zn-SOD基因核苷酸序列在進(jìn)化過程中保守程度較好。

注：1.DL5000; 2.3.Cu/Zn-SOD基因RT-PCR產(chǎn)物。

2.3 杉木Cu/Zn-SOD編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及疏水性

利用ExPasy在線軟件預(yù)測(cè)Cu/Zn-SOD氨基酸序列的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，Cu/Zn-SOD基因的蛋白質(zhì)分子式為C653H1045N197O219S4，總原子數(shù)2118，理論等電點(diǎn)為5.61，脂肪系數(shù)為77.06，分子量為15.287 91 kD。由18種組成氨基酸，含量由大到小分別是甘氨酸(Gly)19.0%、纈氨酸(Val)9.2%、天冬氨酸(Asp)7.2%、丙氨酸(Ala)7.2%、亮氨酸(Leu)7.2%、蘇氨酸(Thr)7.2%、絲氨酸(Ser)6.5%、組氨酸(His)5.9%、脯氨酸(Pro)5.2%、賴氨酸(Lys)4.6%、異亮氨酸(Ile)3.9%、谷氨酸(Glu)3.9%、谷氨酰胺(Gln)3.3%、天冬酰胺(Asn)3.3%、精氨酸(Arg)2.0%、苯丙氨酸(Phe)2.0%、半胱氨酸(Cys)1.3%、蛋氨酸(Met)1.3%。其中Gly的含量與蛋白質(zhì)肽鏈的折疊和形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)有關(guān)，研究表明杉木Cu/Zn-SOD的Gly含量最高，與其他物種Cu/Zn-SOD的Gly含量一致[19]。其中有17個(gè)負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)，正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)為10個(gè)。不穩(wěn)定指數(shù)為14.54，該蛋白為穩(wěn)定蛋白。在280 nm下的消光系數(shù)為125，主要是因?yàn)樵摶虻纳彼?Trp)和酪氨酸(0Tyr)含量為0.0%，蛋白質(zhì)的半衰期為30 h，和大部分蛋白一樣，酵母體內(nèi)>20 h，大腸桿菌體內(nèi)>10 h。

注：下劃線表示開放閱讀框。

注：A：杉木；B：桉樹；C:番茄；D:甘薯；E：南極草；F：擬南芥；G：五色梅；H：小麥；I：楊梅；J：楊樹；K：油菜；M：玉米；N：獐茅。表5同。

圖5 杉木Cu/Zn-SOD與其他植物Cu/Zn-SOD氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹

在線預(yù)測(cè)Cu/Zn-SOD蛋白的疏水曲線(圖6)，可知Cu/Zn-SOD蛋白在第148個(gè)氨基酸處最高值為2.078，疏水性最強(qiáng)；在第79個(gè)氨基酸處的最低值為-2.644，親水性最強(qiáng)。總平均疏水指數(shù)為-0.259，為親水性蛋白。

2.4 杉木Cu/Zn-SOD功能結(jié)構(gòu)域分析及亞細(xì)胞定位

利用NCBI在線預(yù)測(cè)Cu/Zn-SOD蛋白功能結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列屬于Cu-ZnSOD蛋白家族(圖7)。Cu/Zn-SOD與金屬原子相結(jié)合的位點(diǎn)十分保守，Cu離子的結(jié)合位點(diǎn)為第45、47、62和第119位；Zn離子的結(jié)合位點(diǎn)為第62、70、79和第82位，在所有報(bào)道的Cu/Zn-SOD序列中是非常保守的[20-22]。根據(jù)Psort在線軟件預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位可知蛋白Cu/Zn-SOD定位在細(xì)胞質(zhì)的概率最大為43.5%，其次是細(xì)胞核為30.4%、細(xì)胞核為26.1%。細(xì)胞質(zhì)定位信號(hào)區(qū)域預(yù)測(cè)為GKEGVSGVVQFTQEGDGPTTVSAKVSGL。

圖6 杉木Cu/Zn-SOD蛋白的疏水性預(yù)測(cè)

2.5 杉木Cu/Zn-SOD蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

根據(jù)GORIV在線軟件預(yù)測(cè)Cu/Zn-SOD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由延伸鏈(Ee)和無規(guī)則卷曲(Cc)組成。其中Ee占39.87%，Cc占60.13%(圖8)。蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)決定著該基因的功能，其中無規(guī)則卷曲是蛋白質(zhì)分子功能實(shí)施和構(gòu)象的重要區(qū)域。在Cu/Zn-SOD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲占取比例最大。Cu/Zn-SOD的三維結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)一致(圖9)，無規(guī)則卷曲所占比例最大為41%。

2.6 杉木Cu/Zn-SOD蛋白信號(hào)肽和磷酸化結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白在信號(hào)肽的指引下可在細(xì)胞內(nèi)輸運(yùn)信號(hào)，預(yù)測(cè)和分析蛋白信號(hào)肽對(duì)了解杉木Cu/Zn-SOD蛋白質(zhì)細(xì)胞定位及結(jié)構(gòu)域的分選有重要意義。根據(jù)軟件預(yù)測(cè)表明(圖10)，整個(gè)氨基酸肽鏈上沒有信號(hào)肽的存在，可預(yù)測(cè)該蛋白屬于非分泌蛋白。預(yù)測(cè)在第18號(hào)氨基酸時(shí)為信號(hào)肽剪切位點(diǎn)，其C值、Y值均達(dá)到最大，分別為0.182、0.167，第8號(hào)氨基酸S值最大為0.185。

圖7 杉木Cu/Zn-SOD基因編碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域

注：紫色為無規(guī)則卷曲;紅色為延伸鏈。

利用NetPhos Sever在線軟件對(duì)杉木Cu/Zn-SOD蛋白進(jìn)行磷酸化結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示(圖11)，絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr)可能發(fā)生磷酸化，其中Ser可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)有10個(gè)，分別在第2、16、32、36、59、98、102、107、111、134位氨基酸，發(fā)生概率：0.754、0.743、0.811、0.605、0.928、0.995、0.461、0.581、0.546、0.454；Thr可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)有11個(gè)，分別在第10、22、29、30、53、54、60、94、100、136、137位氨基酸，發(fā)生概率：0.966、0.562、0.557、0.655、0.470、0.453、0.488、0.461、0.468、0.459、0.445。蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)多于絲氨酸且概率也高，由此可推測(cè)Thr磷酸化位點(diǎn)可能具有調(diào)控杉木Cu/Zn-SOD蛋白構(gòu)象變化的作用。

圖9 杉木Cu/Zn-SOD蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖10 杉木Cu/Zn-SOD蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖11 杉木Cu/Zn-SOD蛋白磷酸化結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.7 杉木Cu/Zn-SOD蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及蛋白功能預(yù)測(cè)

根據(jù)TMHMM在線軟件預(yù)測(cè)杉木Cu/Zn SOD蛋白跨膜區(qū)域(圖12)，能具體了解蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)等。預(yù)測(cè)總概率為0.073 41，可知該蛋白為非跨膜蛋白。利用Protfun在線軟件預(yù)測(cè)杉木Cu/Zn SOD蛋白功能(表1)，可知該蛋白的細(xì)胞膜、輔因子合成、翻譯蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合、脂肪酸代謝等發(fā)揮著功能。其中具有優(yōu)勢(shì)功能的是輔因子合成、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合、翻譯蛋白、嘌呤和嘧啶、脂肪酸代謝，所占優(yōu)勢(shì)分別為2.917、1.885、1.614、1.362、1.308，而復(fù)制和轉(zhuǎn)錄最低為0.075。

2.8 杉木Cu/Zn-SOD組織特異性表達(dá)分析

通過對(duì)杉木各部位進(jìn)行real time-PCR分析，結(jié)果表明Cu/Zn-SOD基因在杉木的根、莖、葉中均有表達(dá)，且表達(dá)量存在顯著差異(圖13)。將根中的Cu/Zn-SOD基因相對(duì)表達(dá)量作為1，莖中的表達(dá)量則為根的2.76倍，葉片中的表達(dá)量為根的1.41倍。由此可知杉木Cu/Zn-SOD基因在莖部位的相對(duì)表達(dá)量最高，葉其次，根的相對(duì)表達(dá)量最低。

圖12 杉木Cu/Zn SOD蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

FunctionalcategoryProbOddsAmino＿acid＿biosynthesis0．0110．5Biosynthesis＿of＿cofactors0．212．917Cell＿envelope0．0330．541Cellular＿processes0．030．411Central＿intermediary＿metabolism0．0480．762Energy＿metabolism0．0350．389Fatty＿acid＿metabolism0．0171．308Purines＿and＿pyrimidines0．3311．362Regulatory＿functions0．0340．211Replication＿and＿transcription0．020．075Translation0．0711．614Transport＿and＿binding=>0．7731．885

圖13 杉木Cu/Zn-SOD組織特異性表達(dá)分析

3 結(jié)論與討論

在自然環(huán)境下，植物在生長過程中產(chǎn)生和清除的細(xì)胞氧自由基始終保持著動(dòng)態(tài)平衡，超氧化物歧化酶(SOD)具有清除自由基、維持活性氧代謝平衡的作用。當(dāng)受到外界脅迫時(shí)，Cu/ZnSOD可消除H2O2導(dǎo)致的氧化傷害，由此表明Cu/ZnSOD在植物抗逆抗氧化傷害中具有重要作用[23,19]。Cu/ZnSOD基因的表達(dá)可影響SOD活性的變化[24]，研究顯示豌豆Cu/ZnSOD轉(zhuǎn)化煙草后SOD活性提高了數(shù)倍[25]，番茄中的葉綠體Cu/ZnSOD基因轉(zhuǎn)入進(jìn)煙草后與對(duì)照相比耐低溫脅迫能力增強(qiáng)[26]。姚冉等人通過分子生物學(xué)手段從一株地?zé)嵫挎邨U菌中克隆得到Cu/ZnSOD基因并轉(zhuǎn)化到煙草中，結(jié)果表明，與野生型植株相比，Cu/Zn-SOD轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鹽脅迫的耐性得到顯著提升[14]。本研究采用RT-PCR技術(shù)克隆獲得杉木Cu/ZnSOD基因，對(duì)其進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析得知，Cu/ZnSOD具有Cu/Zn superoxide家族特有的典型特征序列，屬于Cu/ZnSOD家族。序列分析表明，該基因具有完整的編碼框，所編碼的蛋白與其他植物具有很高的同源性，達(dá)88.6%，杉木Cu/ZnSOD的后9個(gè)氨基酸為VCGVIGLQG，其他物種Cu/Zn SOD的后9個(gè)氨基酸ACGIIGLQC，相比是非常保守的區(qū)域。此外，利用生物信息學(xué)軟件分析杉木Cu/ZnSOD基因，結(jié)果表明克隆得到的杉木Cu/ZnSOD為胞質(zhì)Cu/Zn SOD，是非跨膜親水性穩(wěn)定非分泌蛋白，與前人研究的烏桕(Sapiumsebiferum)[27]、哈密瓜(Cucumismelovar.saccharinus)[28]、甘蔗(Saccharumofficinarum)[12]、水稻(Oryzasativa)[19]、丹參(Salviamiltiorrhiza)[6]、楊梅(Myricarubra)[21]、絲瓜(Luffacylindrica)[29]、小麥(Triticumaestivum)[30]等Cu/ZnSOD跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果類似。為進(jìn)一步研究杉木Cu/ZnSOD基因在逆境中的表達(dá)和功能以及轉(zhuǎn)基因等提供依據(jù)。

前人研究結(jié)果表明Cu/Zn SOD主要定位于植物綠色組織中，本研究中通過RT-PCR分析Cu/ZnSOD基因在杉木組織中的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)Cu/ZnSOD基因在杉木根、莖、葉中均有顯著表達(dá)，并具有表達(dá)部位的特異性，相對(duì)表達(dá)量在莖中最高、葉片次之，根中最少，由此驗(yàn)證了前人的結(jié)果。在甘蔗中，Cu/ZnSOD的組織表達(dá)特異性結(jié)果顯示，在莖葉的相對(duì)表達(dá)量顯著高于根的相對(duì)表達(dá)量[13]。在東方山羊豆Cu/ZnSOD基因相對(duì)表達(dá)量在葉中最多，莖中表達(dá)量居中，根中表達(dá)量最少[20]。而關(guān)于杉木Cu/ZnSOD基因的研究還處于早期，該基因在逆境脅迫中如何發(fā)揮調(diào)控作用仍不清楚，因此對(duì)于杉木Cu/ZnSOD基因的功能還需進(jìn)一步研究。

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