李德燕，周運(yùn)超

(1．貴州大學(xué) 貴州省森林資源與環(huán)境研究中心，貴州 貴陽 550025；2．安順學(xué)院，貴州 安順 561000；3．貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

鈣是植物生長發(fā)育的必需營養(yǎng)元素之一，在維持植物正常生長、穩(wěn)定細(xì)胞壁、維持細(xì)胞膜通透性及膜蛋白的穩(wěn)定性等方面發(fā)揮著重要作用，還作為細(xì)胞內(nèi)第二信使參與植物的生長發(fā)育、光合作用電子傳遞與光合磷酸化、滲透調(diào)節(jié)作用及激素調(diào)控等生理生化過程[1-3]。馬尾松(Pinusmassoniana)是我國特有的工業(yè)用材樹種之一，分布于我國南方17個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)，是針葉樹種中分布最廣、綜合利用程度最高的鄉(xiāng)土樹種。目前，有關(guān)鈣對馬尾松影響相關(guān)的報(bào)道，主要集中在施肥[4-6]、不同巖性土壤[7]、生物循環(huán)[8-10]、種子發(fā)芽[11-12]、幼苗生理特征[13]及蛋白質(zhì)組學(xué)[14-15]等方面的研究，并取得了一系列豐碩的成果，表明鈣對馬尾松抗逆性、生長發(fā)育、產(chǎn)量等方面均具有重要影響。

我國酸雨區(qū)主要分布在長江以南[16]，馬尾松林地土壤中的鹽基離子在酸雨的作用下發(fā)生淋失作用，特別是Ca2+、Mg2+、K+和Na+流失嚴(yán)重[17-18]。此外，長期種植馬尾松引起林地水土流失加重，同時(shí)周期性采伐也使得林地大量養(yǎng)分消耗，使鈣在生態(tài)系統(tǒng)中的循環(huán)受到影響[19-21]，導(dǎo)致馬尾松生長受抑，生產(chǎn)力降低。研究表明，鈣濃度與馬尾松幼苗的株高和地徑生長情況密切相關(guān)[13]，因而馬尾松林地土壤中有效性鈣含量多少與其林分效益緊密相關(guān)。然而，目前有關(guān)鈣對馬尾松生理生化影響的報(bào)道較少，而有關(guān)鈣對馬尾松針葉的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和內(nèi)源激素含量以及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響特征尚不清楚。為此，本文以馬尾松1年生苗為研究對象，通過砂培模擬試驗(yàn)探究鈣對馬尾松苗生理生化特征及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，闡明馬尾松對鈣的適應(yīng)性機(jī)理，為馬尾松人工林種植及管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

試驗(yàn)于2015年3月至8月在貴州大學(xué)林學(xué)院苗圃溫室內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)材料為生長健壯且粗度和高度一致的1年生馬尾松苗，栽培基質(zhì)為3%稀鹽酸浸泡后蒸餾水充分清洗后的石英砂，每盆10 kg。試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理，每處理15盆，每盆種植3株。營養(yǎng)液為Hoagland營養(yǎng)液配加Amon微量元素，6個(gè)供Ca2+水平分別為0、0.4、1、2、3 mmol·L-1和4 mmol·L-1，其中4 mmol·L-1模擬酸性土壤(pH 5.8左右)溶液中平均Ca2+濃度[22-24]，Ca2+以Ca(NO3)2形式添加。馬尾松生長期間，每3 d澆1次(250 mL/盆)，并在第3次澆營養(yǎng)液前一天用大量蒸餾水洗鹽1次，之后按此法澆營養(yǎng)液直到試驗(yàn)結(jié)束。于苗木移植后第80天，每個(gè)處理隨機(jī)選取10株馬尾松苗不同方向的健康針葉(功能葉)測定相對電導(dǎo)率、葉綠素、可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白和內(nèi)源激素含量等指標(biāo)，以及針葉葉肉細(xì)胞觀察；同時(shí)隨機(jī)選取15株馬尾松苗用于生物量測定。

1.2 測定指標(biāo)及方法

將取出的馬尾松植株洗凈后，放入干凈搪瓷盤中置于恒溫箱內(nèi)105℃殺青30 min，70℃烘至恒重后測其生物量。參照葉尚紅[25]的方法測定馬尾松針葉相對電導(dǎo)率，采用95%乙醇提取后測定葉綠體含量，采用蒽酮法測定可溶性糖與淀粉含量，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定可溶性蛋白含量；參照楊衛(wèi)兵等[26]的方法采用高效液相色譜測定針葉中激素含量(吲哚乙酸，IAA；脫落酸，ABA；玉米素核苷，ZR；赤霉素，GA)；選擇春梢中段南向健康針葉，取針葉中部0.5 cm為材料，參照王鈞等[27]的方法進(jìn)行處理，用LIMB V型超薄切片機(jī)將包埋的樣品橫切成80 nm的薄片后，用醋酸鈾-檸檬酸鉛雙層染色后在H-7650型透射電鏡上觀測及拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS(20.0)、Excel(2013)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和差異顯著性(P<0.05)分析，多重比較采用新復(fù)極差法進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣對馬尾松生長的影響

不同鈣濃度下，馬尾松苗生長情況存在一定差異(圖1和圖2)。2 mmol·L-1Ca2+處理下的馬尾松生長較旺盛，株高生長量最大，針葉較寬且粗細(xì)均勻，主根較長，根尖個(gè)數(shù)最多，生物量最大；1 mmol·L-1和3 mmol·L-1Ca2+處理的植株生長勢次之，與2 mmol·L-1Ca2+處理相比，針葉寬度和厚度降低，主根長、根體積、根尖數(shù)和生物量也有所降低；而0 mmol·L-1和4 mmol·L-1Ca2+處理的生長勢相對較差，其中0 mmol·L-1Ca2+的植株生物量相對較低。這說明馬尾松幼苗在土壤溶液有效鈣含量為2 mmol·L-1左右時(shí)生長較適宜。

2.2 鈣對葉綠體含量的影響

葉綠素含量作為植物抗逆性的重要指標(biāo)之一，是植物養(yǎng)分狀況、光合作用能力和生長態(tài)勢的重要指示因子。從表1可知，隨著Ca2+增加，馬尾松苗針葉內(nèi)葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b和葉綠素a/b含量均呈先升高后降低的趨勢，最高值均出現(xiàn)在2 mmol·L-1Ca2+處理中，而最低值依次出現(xiàn)在4 mmol·L-1、4 mmol·L-1、4 mmol·L-1和0 mmol·L-1Ca2+處理中，依次低于相應(yīng)最高值18.65%、17.66%、18.39%和10.21%?？梢?，2 mmol·L-1Ca2+處理下馬尾松光合作用能力較強(qiáng)，利于馬尾松生長和發(fā)育。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

圖1不同鈣濃度對馬尾松生物量的影響

Fig.1 Effect of different Ca2+concentrationson total biomass ofP.massoniana

圖2 不同鈣濃度對馬尾松生長狀況的影響

鈣濃度/(mmol·L-1)葉綠素a/(mg·g-1)葉綠素b/(mg·g-1)葉綠素a+b/(mg·g-1)葉綠素a/b01．740±0．008e0．563±0．007b2．303±0．028e3．060±0．177b0．41．860±0．009d0．568±0．012b2．427±0．082d3．277±0．101a11．934±0．005c0．571±0．009b2．504±0．067c3．391±0．048a22．123±0．005a0．623±0．008a2．746±0．045a3．408±0．079a32．056±0．008b0．607±0．006a2．663±0．031b3．386±0．066a41．727±0．015e0．513±0．012c2．241±0．078f3．366±0．114a

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.3 鈣對相對電導(dǎo)率、可溶性糖、蛋白質(zhì)和淀粉含量的影響

葉片相對電導(dǎo)率是植物受害的敏感指標(biāo)之一，與細(xì)胞膜透性正相關(guān)。可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物通過大量積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以保持體內(nèi)膨壓，從而維持植物正常的生理過程。淀粉作為植物主要的長期儲存物質(zhì)之一，并在一定條件下可與可溶性糖相互轉(zhuǎn)化。馬尾松針葉相對電導(dǎo)率、可溶性糖和蛋白質(zhì)含量隨供Ca2+濃度增大先降低后升高，最低值都在2 mmol·L-1Ca2+處理中出現(xiàn)，而最高值依次出現(xiàn)在4 mmol·L-1、4 mmol·L-1和0 mmol·L-1Ca2+處理中，比2 mmol·L-1Ca2+處理依高出了12.41%、13.80%和17.15%；淀粉含量隨著鈣濃度增加先升高后降低，2 mmol·L-1Ca2+處理(最大值)的淀粉含量比0 mmol·L-1Ca2+處理(最小值)高出16.28%(表2)。由此可知，與2 mmol·L-1Ca2+處理相比， 0 mmol·L-1和4 mmol·L-1Ca2+處理下的針葉細(xì)胞膜受損嚴(yán)重，馬尾松通過積累大量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以保持體內(nèi)的膨壓，從而維持其細(xì)胞內(nèi)生理代謝活動的穩(wěn)定。

表2 不同鈣濃度對馬尾松針葉相對電導(dǎo)率、可溶性糖、蛋白質(zhì)和淀粉含量的影響

2.4 鈣對內(nèi)源激素的影響

2.4.1 內(nèi)源激素含量 一般認(rèn)為，植物內(nèi)源激素IAA、GA和ZR是生長促進(jìn)型激素，而ABA是生長抑制型激素。從圖3可知，馬尾松針葉內(nèi)GA、ZR和IAA含量隨供Ca2+濃度增加呈先增加后降低的趨勢，最高值分別出現(xiàn)在2 mmol·L-1、1 mmol·L-1和2 mmol·L-1Ca2+處理中，而最低值依次出現(xiàn)在4 mmol·L-1、0 mmol·L-1和4 mmol·L-1Ca2+處理中，分別比最高值降低了30.04%、35.85%和37.28%(圖3A～圖3C)。針葉內(nèi)ABA含量隨供Ca2+濃度增加先降低后增加，其最高值和最低值分別出現(xiàn)在4 mmol·L-1和2 mmol·L-1Ca2+處理中，而最高值是最低值的1.43倍。由此說明，不同供Ga2+水平下的馬尾松，通過改變內(nèi)源激素的含量水平，調(diào)節(jié)其體內(nèi)生理代謝的各個(gè)環(huán)節(jié)，以利于自身生長和發(fā)育。

圖3 不同鈣濃度對馬尾針葉內(nèi)源激素含量的影響

2.4.2 內(nèi)源激素間比例 由圖4可知，馬尾松針葉中ABA/GA、ABA/ZR、ABA/IAA和ABA/(GA+ZR+IAA)值隨著鈣濃度增加均呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢，但比值的大小存在差異。其中，最低值均出現(xiàn)在2 mmol·L-1Ca2+的處理中，最高值均出現(xiàn)在4 mmol·L-1Ca2+的處理中，1～3 mmol·L-1Ca2+處理下的馬尾松針葉中ABA/GA、ABA/ZR、ABA/IAA和ABA/(GA+ZR+IAA)比值無明顯變化。說明不同供Ca2+水平下的馬尾松，其生理過程受體內(nèi)多種激素的協(xié)同作用，通過調(diào)節(jié)激素含量間比值，共同決定其生長發(fā)育情況。

圖4 鈣濃度對馬尾針葉內(nèi)源激素比例的影響

2.5 鈣對針葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)與自然環(huán)境密切相關(guān)，其結(jié)構(gòu)的變化與生理機(jī)能的統(tǒng)一是植物適應(yīng)環(huán)境的基礎(chǔ)。不同鈣濃度下馬尾松苗的葉綠體內(nèi)均有不同程度的淀粉粒出現(xiàn)，同時(shí)細(xì)胞中的原生質(zhì)層與細(xì)胞壁的關(guān)系也存在一定差異(圖5)。供Ca2+濃度為2 mmol·L-1的馬尾松針葉細(xì)胞壁內(nèi)外壁平滑、完整，細(xì)胞核、葉綠體與線粒體形態(tài)較完整，未出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象；葉綠體中淀粉粒含量較多，間質(zhì)濃密，嗜鋨顆粒含量較少；線粒體數(shù)量不多，嵴豐富、清晰，內(nèi)含物較多(5D1-3、5E1-3)。在0～1 mmol·L-1Ca2+的處理中，隨著鈣濃度增加，馬尾松針葉葉肉細(xì)胞中質(zhì)壁分離程度逐漸減弱，葉綠體和線粒體形態(tài)逐漸變得完整、規(guī)則，淀粉粒含量逐漸增多，嗜鋨顆粒逐漸減少；其中，0 mmol·L-1Ca2+處理中部分葉綠體空泡化，并有部分線粒體被膜出現(xiàn)破裂，嵴結(jié)構(gòu)變得模糊(5A1-3，5B1-3，5C1-3)。供Ca2+濃度為3～4 mmol·L-1的處理中，隨Ca2+濃度增加，葉肉細(xì)胞中產(chǎn)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象加重，淀粉粒逐漸減少，嗜鋨顆粒含量增多，線粒體數(shù)目增多，部分線粒體被膜出現(xiàn)破裂現(xiàn)象(5E1-3)。除2 mmol·L-1Ca2+處理的馬尾松針葉細(xì)胞未出現(xiàn)質(zhì)壁分離外，其余處理中細(xì)胞質(zhì)壁分離的程度依次為3<1<0.4<4<0 mmol·L-1Ca2+，與細(xì)胞中的嗜鋨顆粒含量和線粒體數(shù)的變化趨勢相反，表明0 mmol·L-1Ca2+處理的馬尾松針葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損程度相對較重，其次為4 mmol·L-1Ca2+處理。

3 結(jié)論與討論

葉綠素含量是反映光合器官生理狀況的重要值指標(biāo)，其含量在一定程度反映了植物生長狀況和光合作用能力，也可表征逆境中植物組織、器官的衰老狀況[28-30]。植物細(xì)胞膜對維持細(xì)胞的微環(huán)境和正常生理代謝具有重要作用，而相對電導(dǎo)率是衡量細(xì)胞膜透性的重要指標(biāo)，其大小反應(yīng)了植物細(xì)胞受損的程度。植物可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量以避免或減少逆境帶來的傷害。本試驗(yàn)中，適宜的鈣(2 mmol·L-1Ca2+)能顯著提高馬尾松的光合色素(葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b)含量、淀粉含量及葉綠素a/b值，降低針葉細(xì)胞的電導(dǎo)率、可溶性糖和蛋白質(zhì)含量，有利于增強(qiáng)馬尾松的凈光合速率和有機(jī)物的積累，從而促進(jìn)植株生長。0～1 mmol·L-1和 3～4 mmol·L-1Ca2+處理的馬尾松針葉中光合色素降低，造成針葉捕光能力和光合活性降低，光合有機(jī)物合成能力下降，同時(shí)細(xì)胞膜透性增加，細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除平衡遭到破壞，引起膜脂過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損、膜透性增加和細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，生理生化代謝遭到破壞[13]。然而，鈣脅迫條件下馬尾松針葉中部分淀粉水解，增加了可溶性糖含量，為生長提供所需的物質(zhì)和能量，有利于植株維持一定滲透勢，可有效緩解鈣脅迫對馬尾松造成的不利影響。但是，針葉細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成和降解平衡被打破，引起蛋白質(zhì)含量降低，導(dǎo)致呼吸代謝增強(qiáng)[31]，使植株體內(nèi)養(yǎng)分耗損增加，有機(jī)物質(zhì)積累能力下降，最終表現(xiàn)為植株生物量降低。這可能與鈣脅迫下馬尾松對N的吸收代謝過程有關(guān)[32]，其原因有待深入研究。

內(nèi)源激素在植物生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用，作為信號分子參與了一系列與逆境脅迫相適應(yīng)的形態(tài)和生理生化變化[33]。IAA、GA和ZR為生長促進(jìn)型激素，具有促進(jìn)植物苗生長、延緩衰老的功效，而ABA作為生長抑制型激素，在逆境中可誘導(dǎo)相應(yīng)的基因表達(dá)，從而提高植物對逆境脅迫的抗性[34]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，適宜鈣濃度可增加馬尾松苗針葉中IAA、ZR和GA的含量，降低ABA含量、ABA/IAA、ABA/GA、ABA/ZR和ABA/(IAA+ZR+GA)的比值，而與高鈣或低鈣下針葉的內(nèi)源激素含量及比值變化相反，表明馬尾松內(nèi)激素并不是單一激素起作用，而是共同協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。同時(shí)，也表明馬尾松通過降低生長促進(jìn)型激素含量，減緩植株的生長速率，以適應(yīng)鈣脅迫環(huán)境。馬尾松針葉ABA的積累會誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，可引起針葉的光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率相應(yīng)降低[35]，這是其應(yīng)對鈣脅迫的一種生理反應(yīng)。ABA作為初始信號與ABA受體結(jié)合，并在磷酸酶和激酶的作用下激活細(xì)胞內(nèi)的第二信使并誘導(dǎo)鈣脅迫相關(guān)基因表達(dá)，確保馬尾松細(xì)胞膜系統(tǒng)完整以維持細(xì)胞正常滲透勢或膨壓[36]，從而提高馬尾松對鈣脅迫的適應(yīng)性。

注：A1-A3、B1-B3、C1-C3、D1-D3、E1-E3 和F1-F3依次為0 mmol·L-1、0.4 mmol·L-1、1 mmol·L-1、2 mmol·L-1、3 mmol·L-1和4 mmol·L-1Ca2+處理；A1,B1,C1,D1,E1×1 500 s; A2,B2,C2,D2,E2×15 000; A3,B3,C3,D3,E3×30 000; Chl:葉綠體; CW:細(xì)胞壁; N:細(xì)胞核; O:嗜鋨顆粒; SG:淀粉粒; V:vacuole; M:mitochondria。

圖5鈣對馬尾針葉超微結(jié)構(gòu)的影響

Fig.5 Effect of different Ca2+concentrations on the ultra-structure ofP.massoniananeedle tissue

完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)是植物體維持正常生理功能的基礎(chǔ)。逆境條件下，植物細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致細(xì)胞生理功能降低甚至喪失，是植物遭受逆境傷害的重要原因之一。逆境中的植物因細(xì)胞內(nèi)水分外滲，原生質(zhì)隨著液泡一起收縮而發(fā)生質(zhì)壁分離。本試驗(yàn)中，除2 mmol·L-1Ca2+處理的馬尾松葉肉細(xì)胞未觀察到質(zhì)壁分離現(xiàn)象外，其余處理均發(fā)生不同程度質(zhì)壁分離現(xiàn)象，而細(xì)胞質(zhì)壁分離程度與馬尾松幼苗植株生物量變化趨勢相反，表明鈣脅迫下馬尾松的細(xì)胞功能受損，正常生理活動受到一定影響，導(dǎo)致其生物量降低。葉綠素a/b值反映了葉綠體中內(nèi)囊體的垛疊程度，而內(nèi)囊體作為光能吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換的場所，低鈣或高鈣條件下馬尾松針中葉綠素a/b值降低，說明了光能轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)能的能力降低[37]。嗜鋨顆粒由葉綠體或類囊體的膜脂被ROS氧化而形成[38]，故馬尾松針葉細(xì)胞中嗜鋨顆粒增加表明葉綠體內(nèi)部膜脂過氧化程度加劇，從而對馬尾松的生長產(chǎn)生抑制作用。淀粉作為光合作用的產(chǎn)物，淀粉粒數(shù)量減少說明馬尾松對鈣脅迫采取了積極的防御措施，通過淀粉粒降解而合成更多有機(jī)溶質(zhì)，從而調(diào)節(jié)滲透壓[39]。線粒體是氧化磷酸化、釋放能量的場所，其數(shù)目與細(xì)胞的生理功能及需求密切相關(guān)，馬尾松針葉細(xì)胞中葉綠體周圍的線粒體數(shù)量明顯增多，說明線粒體數(shù)量增多可能是對鈣脅迫下單位線粒體活性降低的一種補(bǔ)償方式[40-41]，一定程度上緩減了鈣對馬尾松的脅迫作用。因此，低鈣或高鈣引起馬尾松針葉葉綠體和類囊體發(fā)育異常，使得葉綠體膜結(jié)構(gòu)和類囊體基粒片層排列遭到一定破壞，淀粉粒降解，嗜鋨顆粒增多，部分線粒體膜破損且內(nèi)嵴模糊，質(zhì)壁分離現(xiàn)象發(fā)生，導(dǎo)致馬尾松針葉細(xì)胞的生理生化代謝發(fā)生紊亂。由此可見，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變是鈣脅迫下馬尾松生物量降低的重要因素之一。

綜上所述，不同供鈣水平下，馬尾松幼苗可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的激素含量及比值，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)正常生理生化代謝進(jìn)程，從而保護(hù)細(xì)胞膜、細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能完整，改善針葉的光合狀況，以利于其生長發(fā)育，其中2 mmol·L-1Ca2+對馬尾松苗生長較有利。因此，在馬尾松人工林培育過程中，根據(jù)林地土壤中鈣含量及其生長狀況進(jìn)行科學(xué)合理補(bǔ)充鈣肥，對實(shí)現(xiàn)馬尾松人工林可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

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③全面開展監(jiān)測評價(jià)。建成11個(gè)坡地徑流場、163個(gè)觀測小區(qū)和14個(gè)溝道控制站，基本覆蓋全市的水土流失監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)。依托科技部中德合作項(xiàng)目，引進(jìn)德國先進(jìn)設(shè)備，構(gòu)建土壤蒸滲儀監(jiān)測點(diǎn)→坡面土壤侵蝕和平原區(qū)監(jiān)測點(diǎn)→小流域監(jiān)測→大流域監(jiān)測構(gòu)成的監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，對降水、徑流、泥沙、土壤水分循環(huán)、水質(zhì)水量、生物多樣性、水文形態(tài)特征等開展監(jiān)測，及時(shí)評估水土保持效益，為生態(tài)清潔小流域建設(shè)提供科學(xué)依據(jù)。

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