張萬方，孫寅瑋，王孟慧，黃向瑜，樊松樂，徐 磊

USP2是一種去泛素化酶(deubiquitylating enzymes，DUB)，位于11號染色體上(11q23.3)[1]。泛素化是蛋白質(zhì)降解的一種重要方式[2]。DUB的作用主要是將泛素從目的蛋白上去掉，是維護(hù)機(jī)體泛素水平的一個重要機(jī)制[3]，USP2基因經(jīng)過5′末端的選擇性剪切可產(chǎn)生USP2a和USP2b兩個亞型。研究[4]表明USP2a與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，沉默USP2a能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。如在前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌中USP2a能夠促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲[5-7]，抑制USP2a則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。另外，USP2a能穩(wěn)定CyclinD1[9]，參與細(xì)胞周期調(diào)控等。因此推測USP2a可能一種新的腫瘤標(biāo)志基因[10]。該研究通過表達(dá)USP2a C末端重組蛋白，檢測重組USP2a蛋白的酶活性，并通過LC-MS/MS檢測USP2a對不同性質(zhì)底物的酶活性情況，為進(jìn)一步分析USP2a的催化機(jī)制，開發(fā)USP2a的功能型抑制劑提供重要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1引物設(shè)計與合成以USP2a cDNA為模板，設(shè)計擴(kuò)增其C末端結(jié)構(gòu)域的特異引物，USP2a-1 F:5′-GGAATTCATGAATTCTAAGAGTGCCCAGG-3′(含有EcoR I酶切位點(diǎn))，USP2a-1 R：5′-CCGCTCGAGCTACATTCGGGAGGG-3′(含有Xho I酶切位點(diǎn))，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2目的片段的擴(kuò)增與表達(dá)載體的構(gòu)建采用25 μl PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增；PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，25個循環(huán)；72 ℃、8 min。產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測并回收目的片段。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，25個循環(huán)；72 ℃、 8 min。產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測并回收目的片段。

1.3pET28-USP2a-C的表達(dá)與純化取單克隆菌落，接種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)。第2天擴(kuò)大培養(yǎng)到100 ml含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，采用30 ℃、180 r/min繼續(xù)培養(yǎng)；檢測OD=0.6～0.8時進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)，IPTG濃度為0.8 mmol/L，誘導(dǎo)4 h后收集菌液；超聲裂解后，分別收集上清和沉淀，通過SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況。使用組氨酸標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，依照說明書進(jìn)行蛋白純化。

1.4重組蛋白USP2a-C的酶活性分析使用SPEX Fluorolog-2 spectrofluorometer (激發(fā)光波長 λ, 380 nmol/L; 發(fā)射光波長 λ, 440 nmol/L) 檢測系統(tǒng)，分析重組蛋白的酶活性。根據(jù)米氏方程v=(Vmax×[S])/([S]+Km)，對底物Ub-AMC進(jìn)行梯度稀釋，分別測出每個濃度梯度的反應(yīng)初始速率(v)，以v對底物濃度[S]作圖，同時設(shè)立空白對照。

1.5LC-MS/MS分析蛋白USP2a-C的酶活性選取底物Ub-V77(肽鍵)和Di-Ub(異肽鍵)分別和USP2a-C進(jìn)行反應(yīng)，并分別在0、15、30、60、120 min時加入終止緩沖液(水 ∶乙腈 ∶乙酸=80 ∶20 ∶1)終止反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果在Agilent 1200 HPLC和Agilent Q6410上進(jìn)行檢測[11]，采用Mass Hunter workstation software進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到USP2a-C降解Ub-V77和Di-Ub的反應(yīng)曲線圖。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理由于USP2a-C蛋白催化分解底物的降解過程符合非線性關(guān)系，因此采用R Core Team，2015統(tǒng)計軟件，R語言中的nls函數(shù)進(jìn)行非線性擬合，兩條非線性關(guān)系的顯著性檢驗(yàn)采用Chen et al[12]提出的殘差平方和的F檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果

2.1USP2a的克隆以USP2a cDNA為模板，PCR擴(kuò)增USP2a C末端催化結(jié)構(gòu)域基因片段，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1 000 bp左右處有特異性條帶，大小與預(yù)期相符。

連接載體pET28a(+)，挑取單菌落經(jīng)菌液PCR檢測和雙酶切鑒定，結(jié)果均能得到與預(yù)期大小一致的DNA條帶，見圖1。經(jīng)過DNA測序證實(shí)USP2a C末端基因序列克隆成功，測序結(jié)果見圖2～5。

圖1 重組質(zhì)粒pET28-USP2a-C的鑒定

A：PCR電泳圖；M：DNA Marker；1：USP2a-C；2：無模板空白對照；B：雙酶切電泳圖；3：重組質(zhì)粒pET28-USP2a-C；4：空質(zhì)粒pET28a

圖2 USP2a-C正向測序結(jié)果

圖3 USP2a-C正向測序結(jié)果BLAST對比結(jié)果

圖4 USP2a-C反向測序結(jié)果

圖5 USP2a-C反向測序結(jié)果BLAST對比結(jié)果

2.2USP2a-C的表達(dá)與純化將測序正確的重組質(zhì)粒pET28-USP2a-C進(jìn)行表達(dá)與純化，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，上清液中含有大量的目的蛋白，分子量41 ku，與預(yù)期大小相同，證明USP2a-C以可溶性蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)。確定表達(dá)條件后，大量表達(dá)純化USP2a-C蛋白，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA柱層析純化目的蛋白，收集樣品，得到純化的USP2a-C蛋白，見圖6 。

純化后SDS-PAGE電泳圖上只有目的蛋白一條帶，說明USP2a-C蛋白純化程度很高。使用LC-MS/MS分析純化的USP2a-C蛋白的純度和分子量。分析得到單一的主峰，檢測的分子量大小為41 361.8 ku與理論值(41 362.1 ku)一致，證明所純化得到的是USP2a-C目的蛋白，見圖7。

2.3USP2a-C蛋白的酶動力學(xué)分析根據(jù)米氏方程v=(Vmax×[S])/([S]+Km)，得到USP2a-C分解Ub-AMC的最大反應(yīng)速率Vmax=6.579 40×10-10mol/(L·s)，米氏常數(shù)Km=1.085 68×10-6mol/L，催化常數(shù)Kcat=2.74×10-11/s，催化效率Kcat/Km=2.53×105mol/(L·s)。證實(shí)純化的USP2a-C蛋白具有良好的催化活性，見圖8。

圖6 重組USP2a-C蛋白電泳圖

A：重組USP2a-C蛋白誘導(dǎo)表達(dá)圖；M： Marker(ku)；1：空白對照；2：全菌液；3：超聲裂解后的上清液；4：超聲裂解后的沉淀；B：重組USP2a-C蛋白純化電泳圖；5～8：洗滌穿出液；9：Ni-NTA珠子；10～11：純化后的目的蛋白

2.4LC-MS/MS分析USP2a-C蛋白酶分解不同底物的酶活性分別選取了雙泛素Di-Ub(UbK48C-UbD77)和泛素的衍生物Ub-V77作為底物。其中Di-Ub中兩個乏素之間是正常的異肽鍵結(jié)構(gòu)；底物Ub-V77的Ub和氨基酸殘疾V77之間是由肽鍵相連接。

從圖9可知，反應(yīng)在加入酶后立即開始， 15 min時底物的Di-Ub被分解了45.83%，Ub-V77被分解了55.35%， 60 min時，底物Ub-V77的分解率已達(dá)到96.35%，Ub-V77的分解率也已達(dá)到90%左右，120 min時兩個反應(yīng)均已檢測不到底物，反應(yīng)結(jié)束。由此可以證明純化的USP2a-C蛋白具有完好的半胱氨酸蛋白酶活性，能有效地催化分解異肽鍵和肽鍵底物。

圖7 LC-MS/MS分析純化的USP2a-C的蛋白性質(zhì)

A：USP2a-C催化水解梯度稀釋的Ub-AMC產(chǎn)物AMC的吸收值隨時間的變化圖；B：不同濃度梯度的Ub-AMC反應(yīng)初速度對底物濃度的關(guān)系圖

圖9 USP2a-C分解Di-Ub和Ub-V77的活性分析圖

a：Di-Ub；b：UbK48C；c：Ub-wt+Ub-D77；d：Ub-wt；e：Ub-V77；f：Ub-V77-SO2

2.5USP2a-C分解Di-Ub和Ub-V77酶活性的統(tǒng)計分析經(jīng)過非線性擬合統(tǒng)計分析，顯示USP2a-C分解Di-Ub和Ub-V77兩種不同性質(zhì)底物的反應(yīng)進(jìn)程的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明表達(dá)純化的USP2a-C蛋白半胱氨酸蛋白酶活性正常。見圖10。

圖10 USP2a-C催化分解底物的非線性擬合圖

3 討論

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，因此本研究選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。以USP2a cDNA為模板，用PCR法克隆了USP2a C末端催化結(jié)構(gòu)域基因片段，成功構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET28-USP2a-C，并獲得了可溶性表達(dá)的USP2a-C蛋白。為了檢測獲得的USP2a C末端片段的酶活性，本研究選用了DUB通用底物Ub-AMC檢測酶的活性，結(jié)果證明重組蛋白具有很高的酶活性，并且酶活性穩(wěn)定，室溫放置3 h后酶活性依然不受影響。根據(jù)酶動力學(xué)原理，測定出了USP2a-C蛋白的酶動力學(xué)參數(shù)(米氏常數(shù)Km 、催化常數(shù)Kcat 以及催化效率Kcat/Km)與文獻(xiàn)[11]報道一致。

真核蛋白通過大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)多以包涵體的形式產(chǎn)生，通常沒有活性，需要通過體外復(fù)性使蛋白得以活化，復(fù)性過程對酶的量以及活性造成一定的損失，得到活性酶產(chǎn)量很少。因此對于原核表達(dá)的重組蛋白酶，獲得可溶性表達(dá)就顯得至關(guān)重要，本研究為了得到可溶性表達(dá)的USP2a-C重組蛋白，對誘導(dǎo)表達(dá)的條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過20、25、30、37、42 ℃等一系列溫度的實(shí)驗(yàn)，顯示在30 ℃條件下,誘導(dǎo)4 h可產(chǎn)生大量的可溶性表達(dá)的蛋白。

為了檢測表達(dá)的USP2a-C蛋白的半胱氨酸蛋白酶功能是否完整，本研究選用了兩種不同性質(zhì)的底物Di-Ub和Ub-V77進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。他們都不含熒光因子，不能通過熒光檢測分析酶活性，通常對于沒有熒光物質(zhì)的底物在檢測酶活性時多使用SDS-PAGE的方法[13]。SDS-PAGE檢測方法通常是將反應(yīng)體系配好后，按照反應(yīng)條件的要求進(jìn)行反應(yīng)，等反應(yīng)完成后，將整個反應(yīng)體系進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過電泳條帶的深淺以及有無判斷酶活性變化。但是SDS-PAGE不靈敏，而且只能觀察反應(yīng)系統(tǒng)中底物或產(chǎn)物物質(zhì)的量的最終變化結(jié)果，不能準(zhǔn)確地對反應(yīng)過程以及產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。本研究采用LC-MS/MS方法，不但能夠?qū)崟r監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)程情況，而且能對反應(yīng)過程中底物或產(chǎn)物的變化進(jìn)行定量檢測和定性測定。通過對LC-MS/MS檢測的USP2a-C降解兩種不同性質(zhì)底物的反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行非線性擬合統(tǒng)計分析后顯示，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明表達(dá)純化的USP2a-C蛋白半胱氨酸蛋白酶具有完整的酶活性。

大量的研究[14-18]表明USP2a與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要關(guān)系，目前推測USP2a是一種新的腫瘤標(biāo)志物。因此研究USP2a的活性功能以及底物特異性將對腫瘤的檢測與治療提供重要的理論依據(jù)。下一步將對USP2a的催化機(jī)制以及在細(xì)胞中的活性機(jī)制開展進(jìn)一步的研究。

總之，本研究獲得了USP2a的可溶性表達(dá)并初步分析了USP2a活性情況，為今后研究USP2a催化機(jī)制以及開發(fā)USP2a抑制劑提供了重要基礎(chǔ)，對腫瘤的診斷和新藥的開發(fā)具有重要意義。

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