朱思雅，王夢琳 ，金 娟

肝細(xì)胞癌是現(xiàn)如今社會(huì)最為常見的惡性腫瘤之一，又因其惡性程度高，且發(fā)生發(fā)展速度較快，治療困難，而一直是臨床研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一[1]。阿司匹林是應(yīng)用最早，最廣泛和最常用的非甾體類解熱鎮(zhèn)痛抗炎風(fēng)濕藥，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風(fēng)濕和抗血小板聚集等的眾多的藥理作用，阿司匹林發(fā)揮藥效較快且藥效穩(wěn)定，超劑量易于被發(fā)現(xiàn)和解決，很少發(fā)生變態(tài)反應(yīng)。長期規(guī)律使用阿司匹林者和未服用阿司匹林者相比，可有效降低癌癥的發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移[2-3]。細(xì)胞自噬是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，發(fā)生應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞自噬可以阻止致癌的損傷蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的累積，阻止細(xì)胞的癌變；但是如果腫瘤形成，細(xì)胞自噬為癌細(xì)胞提供豐富的營養(yǎng)，促進(jìn)腫瘤生長。因此，在腫瘤進(jìn)展的過程中，細(xì)胞自噬的作用表現(xiàn)出了兩面性，細(xì)胞自噬與腫瘤的關(guān)系十分復(fù)雜且目前尚未完全闡明。該研究旨在研究一定濃度的阿司匹林對人肝癌HepG2細(xì)胞具有增殖抑制作用，并進(jìn)一步探討一定濃度阿司匹林對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制作用與細(xì)胞內(nèi)自噬的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株人肝癌HepG2細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2主要試劑阿司匹林購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；腺苷酸活化蛋白激酶(the expression of Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抗體購自英國艾美捷科技有限公司；小牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自杭州市四季青公司;辣根酶標(biāo)記的β-actin、辣根酶標(biāo)記抗兔lgG抗體和辣根酶標(biāo)記抗鼠lgG抗體購自北京中杉金橋生物有限公司；吖啶橙(acridine orange，AO)染料、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國西格瑪奧德里奇公司。

1.3主要儀器SW-CI-2F超凈工作臺(中日合資蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；Multiskan Go[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；超純水儀(上海力新儀器有限公司)。

1.4方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人肝癌HepG2細(xì)胞從液氮中取出復(fù)蘇，然后在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2MTT法檢測人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖活力 HepG2細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM稀釋成5×104/ml濃度，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μl,細(xì)胞培養(yǎng)過夜。當(dāng)細(xì)胞生長到60%～70%時(shí)，加入用DMEM配制的不同濃度阿司匹林，各組的終濃度為：2.5、5、10、20 mmol/L每孔加入100 μl(每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h,每孔加入5 mg/ml濃度的新鮮配制的MTT溶液 20 μl,繼續(xù)孵育4 h后，棄去各孔中的培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μl后室溫下在搖床上振蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm波長檢測吸光度值。

1.4.3平板克隆實(shí)驗(yàn) 取生長對數(shù)期的人肝癌HepG2細(xì)胞，常規(guī)消化離心收集細(xì)胞的沉淀，用含有血清的DMEM培養(yǎng)基使其重懸成為單細(xì)胞懸液(1×104孔)，加入用DMEM配制的含不同濃度阿司匹林(2.5、5、10、20、40 mmol/L)的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，后撤去含藥培養(yǎng)液，換上正常含血清的DMEM培養(yǎng)液。置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周左右。經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加入5 ml的4%多聚甲醛固定細(xì)胞，固定15 min。去除固定液，加入適量GIMSA應(yīng)用染色液，染色30 min，使用流水緩慢清洗去染色液，空氣干燥，倒置。用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，后計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?%) =(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.4.4AO熒光染色 取生長對數(shù)期細(xì)胞，常規(guī)消化離心，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2×104/500 μl每孔),待細(xì)胞貼壁后棄去原有培養(yǎng)液，換上用DMEM培養(yǎng)液配制的不同濃度阿司匹林(10、20 mmol/L)于37 ℃、5% CO2下孵育，培養(yǎng)液僅含DMSO組作對照組。培養(yǎng)2、4、6 h后每孔加入100 μl AO染液(1 μg/ml)繼續(xù)孵育40 min，棄上清液，95%乙醇溶液固定5 min，PBS清洗細(xì)胞3～4次，每次5 min，倒置熒光顯微鏡立即觀察。

1.4.5Western blot法檢測蛋白的表達(dá) 取生長對數(shù)期的人肝癌HepG2細(xì)胞，細(xì)胞裂解法冰上裂解細(xì)胞提取蛋白，BCA法蛋白定量，變性蛋白加入到SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，恒壓將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1 h。一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h,TBST洗膜，顯影。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，組間比較采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MTT法測定阿司匹林對HepG2細(xì)胞增殖活力的影響阿司匹林10 mmol/L作用于人肝癌HepG2細(xì)胞24 h后對人肝癌HepG2細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制作用，與未加阿司匹林的對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.5,P<0.01)。阿司匹林10 mmol/L作用于細(xì)胞48 h后對人肝癌HepG2細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制作用，與未加入阿司匹林的對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.3,P<0.01)。40 μmol/L自噬抑制劑氯喹(chloroquine diphosphate salt,CQ)促進(jìn)10 mmol/L阿司匹林對HepG2細(xì)胞的增殖抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=163.8,P<0.01)。10 mmol/L阿司匹林能抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖活力，合用自噬抑制劑CQ后CQ促進(jìn)這種增殖抑制。見圖1、2。

圖1 24、48 h阿司匹林對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖活力的影響

A：阿司匹林作用24 h：B：阿司匹林作用48 h；1：對照組；2、3、4、5：阿司匹林2.5、5、10、20 mmol/L；與對照組比較：**P<0.01

圖2 CQ聯(lián)合阿司匹林對HepG2細(xì)胞增殖活力的影響

1：CQ 40 μm;2：阿司匹林 10 mmol/L;3：CQ+阿司匹林；與阿司匹林10 mmol/L組比較：**P<0.01

2.2平板克隆實(shí)驗(yàn)細(xì)胞克隆形成率表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量，貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞，反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力。阿司匹林(2.5、5、10、20、40 mmol/L)對HepG2細(xì)胞有抑制作用，見圖3。

圖3 阿司匹林作用后HepG2的相對克隆率

A：對照組；B、C、D、E、F：阿司匹林2.5、5、10、20、40 mmol/L；與對照組比較：**P<0.01

2.3AO熒光染色AO熒光染色法利用對pH敏感標(biāo)記酸性囊泡細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，是一種具有細(xì)胞滲透性的熒光染色方法，DNA和胞質(zhì)為亮綠色，若為酸性囊泡AO發(fā)出紅色熒光，是常用檢測細(xì)胞自噬的方法之一。10、20 mmol/L濃度的阿司匹林處理后，出現(xiàn)了橘紅色的自噬小體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

2.4Westernblot法測定AMPK、mTOR蛋白表達(dá)阿司匹林(10、20 mmol/L)作用于人肝癌HepG2細(xì)胞24 h后,提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，檢測蛋白表達(dá)。與對照組比較，AMPK蛋白表達(dá)增加，mTOR蛋白下調(diào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

3 討論

肝細(xì)胞癌是世界范圍內(nèi)最常見的實(shí)體瘤之一，也是死亡率最高的疾病之一。乙型肝炎病毒(hepadnavividae， HBV)感染是肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的主要病因之一。HBV是一種有包膜病毒，含有一個(gè)環(huán)狀的部分雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA基因組，為親肝細(xì)胞性DNA病毒，HBV進(jìn)入體內(nèi)可利用由多聚酶編碼的DNA多聚酶-逆轉(zhuǎn)錄酶復(fù)制。病毒特異性T細(xì)胞反應(yīng)可激活其他炎癥細(xì)胞及干擾素、腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子釋放，從而抑制病毒復(fù)制并清除感染細(xì)胞。沒有足夠的病毒特異性T細(xì)胞反應(yīng)，HBV以穩(wěn)定形式持續(xù)存在，其特殊區(qū)域復(fù)制被認(rèn)為是導(dǎo)致慢性HBV感染的原因。對HBV持續(xù)性的炎癥反應(yīng)即慢性活動(dòng)性肝炎，可引起肝細(xì)胞壞死、肝纖維化、可能導(dǎo)致肝硬化。HBV引起的慢性活動(dòng)性肝炎和肝硬化是肝細(xì)胞癌的主要危險(xiǎn)因素。我國人口眾多，又是HBV感染的高發(fā)國家之一，由乙肝進(jìn)展所致的HCC給我國醫(yī)療資源帶來了巨大的的負(fù)擔(dān)。然而，目前尚無預(yù)防和治療HBV相關(guān)的抗HCC的有效藥物。研究[4]表明非甾體抗炎藥阿司匹林能顯著減少肝內(nèi)HBV特異性T細(xì)胞和非特異性炎性細(xì)胞，阻止HBV相關(guān)的HCC的發(fā)生和發(fā)展。因此，本研究推測阿司匹林可能在HBV相關(guān)的HCC預(yù)防和治療中發(fā)揮重要作用。自噬是最近研究熱點(diǎn)之一，細(xì)胞在正常情況下很少發(fā)生自噬，除非有誘發(fā)因素，且誘發(fā)因素眾多，也是最近研究熱點(diǎn)。細(xì)胞在接受到自噬誘導(dǎo)信號之后會(huì)在胞質(zhì)形成一個(gè)像“脂質(zhì)體”樣的膜結(jié)構(gòu)，然后不斷擴(kuò)張，呈扁平狀，不斷延伸，將胞質(zhì)中的任何成分，全部攬入其中，成為密閉的球狀的自噬體。電鏡下可觀察到。自噬體與溶酶體融合，期間自噬體的內(nèi)膜和內(nèi)容物被溶酶體酶降解合為一體，產(chǎn)物(氨基酸、脂肪酸等)被輸送到胞質(zhì)中，供細(xì)胞重新利用，殘?jiān)慌懦黾?xì)胞外或留在胞質(zhì)中。AMPK被稱為細(xì)胞的代謝和能量的感受器。在細(xì)胞代謝中起作用，而腫瘤細(xì)胞內(nèi)部代謝紊亂，會(huì)引起AMPK活性變化[5-6]。腫瘤抑制因子LKB1作用于其上游，P53和TSC2為其下游底物[7-8]。AMPK既能通過mTOR-TSC2負(fù)向調(diào)控自噬，又能磷酸化ULK1引發(fā)自噬[9-10]。以上都說明AMPK在自噬中起到至關(guān)重要的作用。本研究顯示，10 mmol/L濃度的阿司匹林對人肝癌HepG2細(xì)胞具有增殖抑制作用且和自噬抑制劑CQ合用時(shí)此作用會(huì)被促進(jìn)。10 mmol/L濃度阿司匹林作用于人HepG2細(xì)胞時(shí)會(huì)出現(xiàn)自噬小體，并且增加相關(guān)蛋白AMPK的表達(dá)而降低mTOR蛋白表達(dá)。提示10 mmol/L濃度的阿司匹林對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制作用與自噬有關(guān)。

圖4阿司匹林作用人肝癌HepG2細(xì)胞不同時(shí)間后細(xì)胞經(jīng)AO染色×400

A：對照組；B：阿司匹林10 mmol/L；C：阿司匹林20 mmol/L；1:2 h；2：4 h；3：6 h

圖5 Western blot法測定相關(guān)蛋白表達(dá)

與HepG2組AMPK蛋白的表達(dá)比較：**P<0.01；與HepG2組mTOR蛋白表達(dá)比較：##P<0.01

[1] 范 潔，張 磊，王 嘯.人參皂苷Rk3對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2016,51(11):1604-8.

[2] Rothwell P M, Wilson M, Price J F,et al. Effect of daily aspirin on risk of cancer metastasis: a study of incident cancers during randomised controlled trials[J]. Lancet, 2012,379(9826):1591-601.

[3] Burn J, Gerdes A M,Macrae F,et al. Long-term effect of aspirin on cancer risk in carriers of hereditary colorectal cancer: an analysis from the CAPP2 randomised controlled trial[J]. Lancet,2011,378(9809):2081-7.

[4] Futakuchi M, Ogawa K, Tamano S,et al. Suppression of metastasis by nuclear factor kappaB inhibitors in aninvivolung metastasis model of chemically induced hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Sci,2004, 95(1):18-24.

[5] Hawley S A, Fullerton M D, Ross F A,et al. The ancient drug salicylate directly activates AMP-activated protein kinase[J]. Science,2012,336(6083):918-22.

[6] Din F V, Valanciute A, Houde V P,et al. Aspirin inhibits mTOR signaling, activates AMP-activated protein kinase, and induces autophagy in colorectal cancer cells[J]. Gastroenterology,2012,142 (7):1504-15.

[7] Okoshi R, Ozaki T, Yamamoto H,et al. Activation of AMP-activated protein kinase induces p53-dependent apoptotic cell death in response to energetic stress[J]. J Biol Chem,2008,283(7):3979-87.

[8] Imamura K, Ogura T, Kishimoto A,et al. Cell cycle regulationviap53 phosphorylation by a 5′-AMP activated protein kinase activator, 5-aminoimidazole- 4-carboxamide-1-beta-D-ribofuranoside, in a human hepatocellular carcinoma cell line[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 287(2):562-7.

[9] Jones R G, Plas D R, Kubek S,et al. AMP-activated protein kinase induces a p53-dependent metabolic checkpoint[J]. Mol Cell,2005,18(3):283-93.

[10] Gwinn D M, Shackelford D B, Egan D F,et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint[J]. Mol Cell,2008,30(2):214-26.