許云華 ，陳菁鈺 ，羅 寧 ，姚文穎

（1.江蘇師范大學(xué)連云港校區(qū)生命科學(xué)系，江蘇連云港222006；2.連云港師范高等?？茖W(xué)校生命科學(xué)系，江蘇連云港222006）

細(xì)菌纖維素（Bacterial cellulose，BC）是指在不同條件下，由醋酸菌屬（Acetobacter）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、根瘤菌屬（Rhizobium）和八疊球菌屬（Sarcina）等中的某種微生物合成的纖維素的統(tǒng)稱［1-5］。由于其具有空間三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能有效阻止微生物的侵入，因此可應(yīng)用于醫(yī)用敷料，與現(xiàn)有的人工皮膚和傷口輔料相比，該膜具有機(jī)械強(qiáng)度高、與皮膚相容性好、無刺激性，能有效緩解疼痛，防止細(xì)菌感染，促進(jìn)傷口快速愈合，有利于皮膚組織生長等優(yōu)點(diǎn)，此膜還可作為緩釋藥物的載體攜帶各種藥物，利于皮膚表面給藥，促使創(chuàng)面的愈合和康復(fù)［6］。

黃酮類化合物（Flavonoids）（亦稱類黃酮）是廣泛存在于自然界中的多酚類植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，其數(shù)量種類繁多,結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多樣，具有許多潛在的藥用價(jià)值和生物活性，特別是抗氧化及抗自由基作用和防腐抑菌等生理作用，其中抑菌活性是研究熱點(diǎn)之一［7］。黃酮類化合物的生理活性與獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)密不可分，眾多研究表明，類黃酮的抑菌活性主要與黃酮芳環(huán)上羥基多少和羥基的位置有關(guān)。張金桐等［8］在黃酮類化合物的生物活性與電子結(jié)構(gòu)關(guān)系的量子化學(xué)研究中得出結(jié)論，黃酮分子中C4=O，C5－OH和 C7－OH 是抗菌活性的首要基團(tuán)；其次為 C3－OH 基團(tuán)；C’3－OH，C’4－OH 也具備一定的抗菌活性。

由于黃酮類化合物具有良好的抑菌效果，可以抑制炎性生物酶的滲出，促進(jìn)傷口愈合和止痛，所以對進(jìn)行負(fù)載黃酮類藥物的細(xì)菌纖維素抑菌效果的研究有著一定的理論依據(jù)。而且現(xiàn)國內(nèi)關(guān)于細(xì)菌纖維素醫(yī)用敷料的研究大多數(shù)是負(fù)載銀離子，殼聚糖等，目前對負(fù)載黃酮類藥物的細(xì)菌纖維素的抑菌效果及促進(jìn)傷口愈合和止痛的研究少見報(bào)道。因此本文重點(diǎn)對黃酮類似物如槲皮素、桑色素以及黃芩素負(fù)載在細(xì)菌纖維素上進(jìn)行的抑菌研究，以期為細(xì)菌纖維素醫(yī)用敷料關(guān)于黃酮類化合物的利用及進(jìn)一步開發(fā)提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌（連云港師范高等?？茖W(xué)校微生物實(shí)驗(yàn)室冷凍保藏）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

直徑為1 cm的細(xì)菌纖維素膜（南京理工大學(xué)化學(xué)生物功能材料研究所提供，1 cm打孔器打孔）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥品

槲皮素，桑色素，冰醋酸，牛肉膏，蛋白胨，瓊脂粉，氯化鈉，氫氧化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）黃芩素（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)器材

高壓蒸汽滅菌鍋、超凈臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、水浴鍋等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 配置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（固體、液體培養(yǎng)基）

牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 15 g、水 1 000 ml、PH7.2-7.4。

1.2.2 菌種的活化與提純

將配制好的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿以及其他有關(guān)器皿放進(jìn)高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行滅菌，將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌從斜面培養(yǎng)基上用平板劃線法接種到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，放入37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后的兩種菌取2-3環(huán)單菌落接種到滅菌后的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h。最后用涂布平板法接種到固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h。

1.2.3 配置不同濃度的黃酮類藥物（槲皮素、桑色素、黃芩素）

稱取不同質(zhì)量的黃酮類藥物（槲皮素、桑色素、黃芩素），溶于冰醋酸中，配制得不同濃度的槲皮素溶液（大腸桿菌 1，2，3，4，5 mmol·L-1，金黃色葡萄球菌 1，2，3，4，5 mmo·/L-1）、桑色素溶液（大腸桿菌0.673 mg·mL-1、0.683 mg·mL-1、0.690 mg·mL-1、0.693 mg·mL-1，金黃色葡萄球菌 0.350 mg·mL-1、0.370 mg·mL-1、0.380 mg·mL-1、0.400 mg·mL-1）、黃芩素（大腸桿菌 0.20 mg·mL-1、0.36 mg·mL-1、0.52 mg·mL-1、0.60 mg·mL-1、0.76 mg·mL-1、0.90 mg·mL-1，金黃色葡萄球菌 0.10 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.35 mg·ml-1、0.45 mg·mL-1）。

同時(shí)用直徑1 cm打孔器將BC膜處理好后，浸泡于配制好的黃酮類藥物溶液中，浸泡24小時(shí)。

1.2.4 抗菌活性檢測（定性方法：抑菌圈法）

參照GB/T 20944.1-2007《紡織品抗菌性能的評價(jià)第1部分：瓊脂擴(kuò)散法》。

將制備好的負(fù)載不同濃度黃酮類藥物的BC膜平鋪在平板中央，37℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h。設(shè)置純細(xì)菌纖維素（BC膜只浸泡于冰醋酸中）作為對照組。每個(gè)濃度用3-4個(gè)培養(yǎng)皿作為平行實(shí)驗(yàn)。

檢查是否有抑菌圈，有抑菌圈出現(xiàn)則測量抑菌圈與負(fù)載黃酮類藥物細(xì)菌纖維素材料膜半徑之差，每個(gè)試樣至少測量三處，按下式計(jì)算試樣的抑菌帶寬度。

抑菌帶寬度H=D-d

H—抑菌帶寬度（mm）；D—抑菌帶外半徑的平均值（mm）；d—BC膜的半徑（mm）

細(xì)菌在培養(yǎng)皿中，能夠迅速生長，但由于材料具有抗菌能力，細(xì)菌在樣品的周圍會(huì)產(chǎn)生一個(gè)明顯的細(xì)菌阻滯圈，即抑菌圈。樣品的抗菌性能由抑菌圈的抑菌帶寬度大小來評價(jià)，抑菌圈的抑菌帶寬度越大，表明該材料的抗菌效果越好；反之，則表明該材料的抗菌效果越差。

2 結(jié)果與討論

2.1 負(fù)載不同濃度槲皮素的BC膜對革蘭氏菌的抑菌效果

2.1.1 通過負(fù)載不同濃度槲皮素的BC膜對大腸桿菌的抑菌效果的實(shí)驗(yàn)，得到如下表2.1.1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及圖2.1.1關(guān)系曲線。

表2 .1.1 不同濃度的槲皮素對大腸桿菌的抑菌效果

圖2 .1.1 槲皮素濃度對大腸桿菌的抑菌效果曲線

結(jié)果分析：由圖2.1.1槲皮素濃度對大腸桿菌的抑菌效果曲線可以直觀的看出，隨著槲皮素濃度的不斷增大抑菌帶寬度也隨之增大，表明負(fù)載槲皮素的BC膜對大腸桿菌的抑菌效果越好；當(dāng)濃度為3 mmol/L時(shí)，抑菌帶的寬度達(dá)到最大值，即抑菌效果最好；當(dāng)濃度大于3 mmol/L時(shí)，抑菌效果緩慢下降達(dá)到一定的平衡。

根據(jù)表2.1.1發(fā)現(xiàn)，對照組中出現(xiàn)抑菌圈，而且對照組抑菌帶寬度值比實(shí)驗(yàn)組的值要大得多，其實(shí)細(xì)菌纖維素本身不具有抗菌性能，但是實(shí)驗(yàn)所用的溶劑為冰醋酸，本身具有一定的抑菌效果，所以對照組中出現(xiàn)抑菌圈。同時(shí)本次實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)雙抑菌圈，上述表中數(shù)據(jù)（除對照組外）均采用小抑菌圈的數(shù)值原因是，貼BC膜時(shí)未將膜上多余的冰醋酸溶液濾干，導(dǎo)致培養(yǎng)時(shí)，多余的冰醋酸擴(kuò)散較快先發(fā)揮較弱抑菌作用產(chǎn)生大抑菌圈，而負(fù)載在BC膜上的黃酮類藥物后發(fā)揮抑菌作用產(chǎn)生小抑菌圈，所以對照組的抑菌圈是冰醋酸擴(kuò)散導(dǎo)致的大圈，數(shù)值肯定比實(shí)驗(yàn)組的值要大。

2.1.2 通過負(fù)載不同濃度槲皮素的BC膜對金黃色葡萄球菌的抑菌效果的實(shí)驗(yàn)，得到如下表2.1.2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及圖2.1.2。

表2 .1.2 不同濃度的槲皮素對金黃色葡萄球菌抑菌效果

圖2 .1.2 槲皮素濃度對金黃色葡萄球菌的抑菌效果曲線

結(jié)果分析：由圖2.1.2槲皮素濃度對金黃色葡萄球菌的抑菌效果曲線可以直觀的看出，隨著槲皮素濃度的不斷增大抑菌帶寬度也隨之增大，表明負(fù)載槲皮素的BC膜對金黃色葡萄球菌的抑菌效果越好；當(dāng)濃度為4 mmol/L時(shí)，抑菌帶的寬度達(dá)到最大值，即抑菌效果最好；當(dāng)濃度大于4 mmol/L時(shí)，抑菌效果迅速下降。

2.2 負(fù)載不同濃度桑色素的BC膜對革蘭氏菌的抑菌效果

2.2.1 通過負(fù)載不同濃度桑色素的BC膜對大腸桿菌的抑菌效果的實(shí)驗(yàn)，得到如下表2.2.1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及圖2.2.1。

表2 .2.1 不同濃度的桑色素對大腸桿菌的抑菌效果

圖2 .2.1 桑色素濃度對大腸桿菌的抑菌效果曲線

結(jié)果分析：由圖2.2.1桑色素濃度對大腸桿菌的抑菌效果曲線可以看出，有一個(gè)最小峰和一個(gè)最大峰，在桑色素溶液濃度為0.690 mg/ml時(shí)，此時(shí)抑菌圈最大，可得出桑色素對大腸桿菌的最適抑菌濃度為0.690 mg/ml。

2.2.2 通過負(fù)載不同濃度桑色素的BC膜對金黃色葡萄球菌的抑菌效果的實(shí)驗(yàn)，得到如下表2.2.2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及圖2.2.2關(guān)系曲線。

表2 .2.2 不同濃度的桑色素對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

圖2 .2.2 桑色素濃度對金黃色葡萄球菌的抑菌效果曲線

由關(guān)系圖2.2.2中可以看出，在濃度為0.38 mg/ml之前隨著濃度的升高，抑菌圈也隨之增大，但當(dāng)濃度大于0.38 mg/ml時(shí)，抑菌圈變小，所以可以得出桑色素對金黃色葡萄球菌的最適抑菌濃度為0.38 mg/ml。

2.3 負(fù)載不同濃度黃芩素的BC膜對革蘭氏菌的抑菌效果

2.3.1 通過負(fù)載不同濃度黃芩素的BC膜對大腸桿菌的抑菌效果的實(shí)驗(yàn)，得到如下表2.3.1實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及圖2.3.1關(guān)系曲線。

表2 .3.1 不同濃度的黃芩素抑制大腸桿菌的效果

圖2 .3.1 黃芩素濃度對大腸桿菌的抑菌效果曲線

結(jié)果分析：Chinnam等研究證實(shí)黃芩素對大腸桿菌抑制作用的半數(shù)有效濃度（IC50）約為0.078黃芩素濃度（mg/ml）［9］。根據(jù)IC50的值制取六個(gè)濃度的黃芩素溶液，研究抑制大腸桿菌生長的最佳濃度。從圖2.3.1可知當(dāng)黃芩素濃度為0.36 mg/ml時(shí)，抑菌圈平均值最大，為1.73 cm，即為最佳濃度。

2.3.2 通過負(fù)載不同濃度黃芩素的BC膜對金黃色葡萄球菌的抑菌效果的實(shí)驗(yàn)，得到如下表2.3.2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及2.3.2曲線圖。

表2 .3.2 不同濃度的黃芩素抑制金黃色葡萄球菌的效果

圖2 .3.2 黃芩素濃度對金黃色葡萄球菌的抑菌效果曲線

結(jié)果分析：根據(jù)以往研究可知，黃芩素可抑制金黃色葡萄球菌的生長，其最低抑菌濃度為0.04 mmol/L［10］，黃芩素的分子量為270.24，即0.010 8 mg/ml，依據(jù)此數(shù)據(jù)，配制五個(gè)不同濃度的黃芩素溶液來研究抑制金黃色葡萄球菌的最佳濃度。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，當(dāng)黃芩素濃度為0.1 mg/ml時(shí)，抑菌圈平均值最大為1.71 cm；當(dāng)黃芩素濃度＞0.35 mg/ml時(shí)，雖然抑菌效果呈上升趨勢，但會(huì)使用更多的黃芩素；當(dāng)濃度更小時(shí)，則會(huì)超出分析天平的量程或者需要更多的溶劑。綜合考慮，抑制金黃色葡萄球菌生長的黃芩素最佳濃度為0.1 mg/ml。

文章所做關(guān)于負(fù)載不同濃度黃酮類藥物的BC膜對革蘭氏菌的抑菌效果的實(shí)驗(yàn)中，出現(xiàn)雙抑菌圈的現(xiàn)象，在培養(yǎng)抑菌24 h后，出現(xiàn)一個(gè)較大的抑菌圈，抑菌效果不明顯仍有較多菌落，48 h后再次觀察，出現(xiàn)較小的抑菌圈，小抑菌圈中的菌落較少抑菌效果較好，同時(shí)大抑菌圈未消失。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能由于實(shí)驗(yàn)所用的溶劑為冰醋酸，本身具有一定的抑菌效果，而且貼BC膜時(shí)未將膜上多余的冰醋酸溶液濾干，導(dǎo)致培養(yǎng)時(shí)，多余的冰醋酸擴(kuò)散較快先發(fā)揮較弱抑菌作用，而負(fù)載在BC膜上的黃酮類藥物后發(fā)揮抑菌作用，因此，實(shí)驗(yàn)分析所用全部數(shù)據(jù)為抑菌圈的小圈（內(nèi)圈）數(shù)值。

3 結(jié)論

經(jīng)過負(fù)載黃酮類藥物BC膜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果的實(shí)驗(yàn)，可以得出負(fù)載槲皮素的BC膜對大腸桿菌的最適抑菌濃度為3 mmol/L，抑菌圈的半徑為1.31 cm，對金黃色葡萄球菌對的最適抑菌濃度為4 mmol/L，抑菌圈的半徑為1.23 cm；負(fù)載桑色素的BC膜對大腸桿菌的最適抑菌濃度為0.690 mg/ml，抑菌圈的半徑為1.22 cm，對金黃色葡萄球菌對的最適抑菌濃度為0.380 mg/ml，抑菌圈的半徑為1.9 cm；負(fù)載黃芩素的BC膜對大腸桿菌的最適抑菌濃度為0.36 mg/ml，抑菌圈的半徑為1.73 cm，對金黃色葡萄球菌對的最適抑菌濃度為0.1 mg/ml，抑菌圈的半徑為1.71 cm。

細(xì)菌纖維素功能材料是當(dāng)今生物技術(shù)和材料科學(xué)發(fā)展的前沿之一，其功能化研究日益重要，受到了各國科學(xué)家的高度關(guān)注。同時(shí)天然藥物中黃酮類化合物的抑菌作用也正在不斷的挖掘中，將植物中提取的黃酮類化合物運(yùn)用到臨床上還需要進(jìn)一步深人研究。［11］但目前對負(fù)載黃酮類藥物的細(xì)菌纖維素的抑菌效果及促進(jìn)傷口愈合和止痛的研究仍少見報(bào)道。文章進(jìn)行的負(fù)載黃酮類藥物細(xì)菌纖維素的抑菌研究，其制備過程簡便、環(huán)保、生產(chǎn)成本低，有望為醫(yī)療業(yè)藥業(yè)拓開新的思路，實(shí)現(xiàn)以后敷料產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

［1］郝常明,羅祎.細(xì)菌纖維素-一種新興的生物材料［J］.纖維素科學(xué)與技術(shù),2002,10:56.

［2］旺達(dá)姆E J,貝特斯SD,斯泰因比歇爾A.生物高分子（第5卷）多糖I-原核生物多糖［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004.

［3］JONASR,FARAH LF.Production and application ofmicrobial cellulose［J］.Polymer Degradation and Stability,1998,59:101.

［4］馬承鑄,顧真榮.細(xì)菌纖維素生物理化特性和桑葉用途［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2001,17:93.

［5］楊禮富.細(xì)菌纖維素研究新進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào),2003,30:95.

［6］CZAJAW,KRYSTYNOWICZA,BIELECKI S.Microbial cellulose—The natural power toheal wounds［J］.Biomaterial,2006,27:145.

［7］李葉,唐浩國,劉建學(xué).黃酮類化合物抑菌作用的研究進(jìn)展［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊,2008,12（12）:32-34.

［8］姚曉敏,孫向軍,王建強(qiáng).綠色蔬菜的脫色機(jī)理及護(hù)色方法［J］.食品工業(yè)科技,2000,21（5）:19-20.

［9］代重山,湯樹生,張青杰,等.黃芩苷和黃芩素的生物學(xué)功能及其在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.中國飼料,2015（8）:11-18.

［10］云寶怡,周磊,謝鯤鵬,等.黃芩素抑菌活性及其機(jī)制的初步研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào),2012,47（12）:1587-1592.

［11］靳蕊,徐敏紋,劉瑩,等.黃酮類化合物的抑菌作用及其機(jī)制的研究［J］.Continuing Medical Education,August,2016,30（8）:93-98.