詹 磊 程良斌 蔡 岳

(湖北省中醫(yī)院肝病科，武漢 430060 )

肝癌的死亡率僅次于肺癌[1]，全世界每年有近60萬新增肝癌患者，中國的肝癌發(fā)病率及死亡率均高居世界首位[1,2]。原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)病機制復雜，其發(fā)生、發(fā)展和轉移與腫瘤細胞的多基因突變、免疫逃避、細胞信號傳導通路異常等均有關[2-4]。T淋巴細胞免疫是機體對抗腫瘤細胞的主要免疫機制[2,4]。報道指出，肝癌細胞能通過修飾自身表面抗原改變肝癌的微環(huán)境，從而逃避免疫監(jiān)視。程序性死亡蛋白1(Programmed death 1，PD-1)主要由T淋巴細胞表達。PD-1通過與PD-L1及PD-L2的結合傳遞信號，從而抑制T淋巴細胞激活，誘導T淋巴細胞凋亡[5]。報道指出，肝癌組織中PD-1/PD-L1的高表達可抑制CD8陽性T淋巴細胞的增殖、誘導T淋巴細胞凋亡，引起機體抗腫瘤免疫反應下降[6]。另外，PD-1/PD-L1信號通路可抑制IL-2與γ干擾素的產生，從而刺激T淋巴細胞分泌IL-10，抑制T淋巴細胞活性[7]。PD-1或PD-L1抗體已被應用于臨床，并取得了一定的療效。美國FDA已批準PD-1抗體作為治療黑色素瘤、非小細胞肺癌的臨床用藥[8]。

COX-2可通過前列腺素途徑在腫瘤免疫應答中發(fā)揮抑制免疫的作用[9]。塞來昔布(Celecoxib)是一種特異性環(huán)氧化酶2(COX-2)抑制劑，現(xiàn)已被廣泛應用于各類腫瘤的化療及放療增敏治療[10]。近期的研究指出，黑色素瘤中COX-2的表達與PD-L1呈顯著正相關[11]。而關于COX-2能否影響PD-1的功能以及塞來昔布的抗肝癌機制是否依賴PD-1尚無人報道。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1資料來源 本次研究共納入2012年2月～2016年6月我院收治的65例行手術治療的原發(fā)性肝細胞癌患者作為研究對象；所有患者中男性58例，女性7例；患者的年齡介于30～72歲之間，平均(50.3±7.6)歲；所有患者HBsAg(乙肝表面抗原)均為陽性；參照2011版原發(fā)性肝細胞癌的診療規(guī)范進行診斷，所有患者均確診為原發(fā)性肝細胞癌；術后診斷顯示所有患者的肝癌標本均為肝細胞癌；所有患者均接受核苷酸類似物抗病毒治療，入院后檢測HBV DNA均為陰性；排除臨床資料不完整的患者；排除長期營養(yǎng)不良患者；排除長期臥床患者；排除近期及長期服用影響機體免疫藥物患者；排除并發(fā)其他腫瘤患者。另選取15例我院肝膽外科提供的肝臟正常組織標本作為對照；對照組患者的年齡介于30～48歲之間，平均(45.6±11.9)歲。納入研究的所有患者均告知本次研究的目的及方法，所有患者均簽署知情同意書，研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2材料與設備 主要試劑包括塞來昔布(美國輝瑞公司)，COX-2抗體(美國Santa Cruz公司)，PD-1抗體、CD8抗體(美國Abcam公司)，F(xiàn)oxp3抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，β-actin抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)。流式抗體包括：FITC標記的CD8抗體、APC標記的CD4抗體、PE標記的CD25抗體(美國BioLegend公司)。SDS-PAGE試劑(上海碧云天生物技術有限公司)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)，青霉素、鏈霉素(美國Sigma公司)。小鼠淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限公司)。Lipofectamine?2000轉染試劑(Thermo Fisher)。PD-1及對照siRNA(廣州銳博生物科技有限公司)。BALB/c小鼠購自武漢大學實驗動物中心。H22細胞(H22-H8D8)購自美國ATCC公司。主要設備包括CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺、流式細胞儀、Bio-Rad垂直電泳儀，Bio-Rad、Western blot化學發(fā)光成像系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1小鼠模型的建立 從液氮中取出凍存的H22小鼠肝癌細胞，37℃水浴中迅速復蘇，用注射器(2 ml)抽取后迅速注入BALB/c雌性小鼠(共10只)腹腔內。取接種腫瘤7 d后生長良好的H22荷瘤小鼠，頸椎脫臼處死，消毒后剪開并剝去皮膚，用無菌注射器(5 ml)穿過腹壁肌層抽取腹水，用PBS液將腫瘤細胞稀釋至1×107cells/ml。另選取45只BALB/c雌性小鼠，每只背部皮下注射腹水稀釋液0.2 ml。

1.2.2分組及給藥 接種后第2天將H22荷瘤小鼠隨機分為對照組、塞來昔布組和PD-1抗體組，每組15只。對照組小鼠不予任何特殊處理；塞來昔布組小鼠每天以200 mg/kg塞來昔布進行灌胃，連續(xù)用藥28 d；PD-1抗體組給予PD-1抗體腹腔注射，100 μl/只，每3天給藥一次，共9次。每隔1天進行1次腫瘤大小測量，測量腫瘤的最長徑(a)與最短徑(b)，按(a×b2/2)公式計算腫瘤的體積(V)，繪制腫瘤的生長曲線與小鼠的生存曲線。末次給藥24 h后將所有存活小鼠脫臼處死，用EDTA-K2抗凝劑采血管收集小鼠靜脈血，置于冰盒中保存，取100 μl用于流式細胞檢測。完整取出腫瘤組織，多聚甲醛固定，用于病理檢測及免疫組化染色。

1.2.3免疫組化染色 將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH6.0)高壓鍋抗原熱修復，加3%H2O2室溫避光孵育30 min，PBS洗5 min×3次。采用SP法檢測COX-2、PD-1、CD8及Foxp3水平。即用10%正常非免疫羊血清37℃孵育60 min，滴加一抗工作液4℃冰箱過夜，PBS洗5 min×3次。滴加二抗工作液，37℃孵育60 min，PBS洗5 min×3次。滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，37℃孵育60 min，PBS洗5 min×3次。DAB顯色、蘇木素復染、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。每個切片隨機選取5個視野，顯微鏡下觀察染色陽性細胞所占百分比。

1.2.4流式細胞術檢測 取100 μl加入抗凝劑的小鼠靜脈血，根據說明書加入適當比例的待測抗體(CD8、CD4、CD25)，混勻后室溫避光孵育30 min。向每管中加入1 ml紅細胞裂解液，室溫避光溶血10 min。1 500 r/min離心5 min，棄上清。加1 ml PBS洗滌，1 500 r/min離心3 min，棄上清。加0.5 ml PBS重懸細胞，混勻上流式儀檢測。CD4+CD25+T細胞即為Treg。

1.2.5小鼠PBMC分離及檢測 小鼠PBMC的分離嚴格按照產品說明書進行。將分離的PBMC進行體外培養(yǎng)，分別轉染PD-1與對照siRNA，使用100 μmol/L塞來昔布或空白處理各組細胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)36 h后收細胞樣。Western blot檢測各組細胞COX-2、PD-1、CD8及Foxp3水平。

2 結果

2.1患者的基本信息 研究初期共納入93例HCC患者，其中9例臨床資料不完整，6例長期營養(yǎng)不良，3例長期臥床，2例為惡性腫瘤患者，5例有近期服用影響機體免疫藥物史，3例并發(fā)其他腫瘤。最終65例患者被納入本次研究。所有患者中40例(61.5%)患者的年齡≥50歲；58例(69.8%)為男性。所有患者均為肝硬化及HBsAG陽性患者。患者的臨床病理分級與分期等情況見表1所示。

2.2肝癌組織COX-2與PD-1的表達及相關性分析 對HCC患者及正常組織標本進行IHC分析，光密度分析結果顯示，HCC患者腫瘤組織中COX-2與PD-1的表達水平均顯著高于對照組(P<0.001)。Pearson相關性分析顯示，HCC患者腫瘤組織中COX-2的表達水平與PD-1呈顯著正相關(R2=0.673,P<0.001)，見圖1。

2.3小鼠模型的建立與分析 皮下注射H22細胞后所有小鼠均成功建模。給藥4周后對照組、塞來昔布組和PD-1抗體組分別有6只、12只和13只存活。塞來昔布、PD-1抗體治療小鼠的腫瘤生長曲線和生存曲線均顯著優(yōu)于對照組(P<0.05)，塞來昔布組、PD-1抗體組小鼠的腫瘤生長曲線和生存曲線相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。IHC與流式分析顯示，塞來昔布能顯著降低腫瘤組織中PD-1的表達(P<0.001)；塞來昔布與PD-1抗體均能使腫瘤組織及外周血CD8+T細胞顯著增多(P<0.001)，使Treg細胞顯著減少(P<0.001)，見圖2、3。

表1患者的基本信息

Tab.1Basicdataofpatients

Parameters[n(%)]Parameters[n(%)]Age≥50y40(61.5)HBsAG65(100.0)Male58(89.2)BCLCstageCirrhosis65(100.0)A17(26.2)Child-PughclassB22(33.8)A27(41.5)C15(23.1)B21(32.3)D11(16.9)C17(26.2)PathologicalgradeAFP(μg/L)Welldifferentiated21(32.3)≥40049(75.4)Moderatelydifferentiated26(40.0)<40016(24.6)Poorlydifferentiated18(27.7)

Note：AFP.alpha-fetoprotein;HBsAG.The hepatitis B surface antigen;BCLC.Barcelona clinic liver cancer.

圖1 肝癌組織中COX-2與PD-1表達水平及相關性分析Fig.1 Expression and correlation of COX-2 and PD-1 in the tissue of liver cancerNote:A.Immunohistochemical results of COX-2 and PD-1；B.IOD analysis of IHC staining;C.Correlation analysis.**.P<0.001.

圖2 小鼠模型分析Fig.2 Mice model analysisNote:A.Survival curve;B.Tumor growth curve;C.IOD analysis of IHC staining.**.P<0.001.

圖3 小鼠模型分析Fig.3 Mice model analysisNote:A，B.Results offlow cytometry analysis of peripheral blood.**.P<0.001.

圖4 Western blot檢測小鼠PBMC中COX-2、PD-1、CD8與Foxp3水平Fig.4 Western blot analysis of COX-2,PD-1,CD8 and Foxp3 level in PBMC

2.4PBMC中COX-2、PD-1、CD8與Foxp3水平檢測 Western blot結果顯示，塞來昔布能顯著降低小鼠PBMC的COX-2、PD-1、CD8及Foxp3水平，而不影響轉染PD-1 siRNA后PBMC的CD8及Foxp3水平，如圖4所示。

3 討論

塞來昔布為非甾體類抗炎藥，能特異性抑制COX-2 的合成，具有特異性強、副作用小的特點。大量臨床、體內外實驗及流行病學分析均證明塞來昔布能針對多種腫瘤發(fā)揮促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤新生血管形成以及預防腫瘤發(fā)生的作用[9]。COX-2在多種腫瘤細胞中表達增強，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[9,10]。臨床數據分析表明COX-2的表達量與腫瘤的大小、分期及淋巴結轉移數目緊密相關[11]。報道指出，COX-2可通過前列腺素途徑在腫瘤的免疫應答中發(fā)揮免疫抑制作用[12]。COX-2誘導的地諾前列酮能抑制自然殺傷細胞活性和T淋巴細胞、B淋巴細胞的增殖，從而降低干擾素γ與IL-2的合成，促進腫瘤細胞的生長[7,10,13]。

近期的研究指出，使用塞來昔布能有效抑制小鼠肝癌的生長，降低荷瘤小鼠腫瘤浸潤淋巴細胞及外周血中的Treg比例[14]。塞來昔布抑制腫瘤生長可能與其下調Treg水平及參與腫瘤免疫調節(jié)有關。目前尚無報道對COX-2抑制劑是通過何種信號傳導機制調節(jié)Treg水平的研究。

本次研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者腫瘤組織中COX-2與PD-1的表達水平均顯著高于正常肝臟標本。同時，HCC患者腫瘤組織中COX-2的表達水平與PD-1呈顯著正相關。這些結果表明COX-2與PD-1可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮重要作用，同時，提示這兩種分子之間可能存在一定的聯(lián)系。PD-1和其配體PD-L1、PD-L2是免疫檢查點信號的重要分子，其介導的免疫抑制是腫瘤細胞逃避免疫細胞識別與殺傷的重要方式[5,6,15]。PD-1在腫瘤特異性T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞及一些損傷相關的T細胞中高表達，其配體PD-L1在多種腫瘤細胞中均有表達。采用抗PD-1/PD-L1的免疫療法在黑色素瘤、腎癌、非小細胞肺癌等多種腫瘤中均取得了顯著療效。已有文獻指出，在肝炎向肝癌轉化過程中PD-1及其配體PD-L1、PD-L2的表達水平顯著上調，并且PD-1、PD-L1與PD-L2均與肝癌細胞的惡性程度顯著相關[16]。

本次小鼠模型實驗顯示，塞來昔布與PD-1抗體治療均能顯著改善小鼠的腫瘤生長曲線和生存曲線。另外，塞來昔布與PD-1抗體組小鼠的腫瘤生長曲線和生存曲線相比差異均無統(tǒng)計學意義。塞來昔布能顯著降低腫瘤組織中PD-1的表達；塞來昔布與PD-1抗體均能使腫瘤組織及外周血中Treg細胞顯著減少，同時使CD8+T細胞顯著增多。這些結果表明塞來昔布的確可以通過影響腫瘤免疫發(fā)揮抗腫瘤的效果，且其調節(jié)腫瘤免疫的機制可能與PD-1抗體類似。為了進一步研究塞來昔布的作用機制，我們分離了小鼠PBMC進行體外實驗，結果表明，塞來昔布能顯著降低小鼠PBMC的COX-2、PD-1、CD8及Foxp3水平，而對轉染了PD-1 siRNA后的PBMC則不能進一步降低CD8及Foxp3水平。

綜上所述，HCC患者腫瘤組織中COX-2與PD-1均顯著增高。塞來昔布能降低PD-1的表達水平，這可能是其調節(jié)腫瘤免疫從而發(fā)揮抗肝癌作用的機制之一。

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