李成德 全 毅 蔡健梅 吳小文 申學(xué)基 阮德斌 張 琳 李海珠

(廣東省肇慶市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，肇慶 526020)

共激刺分子B7-H3(B7 homologue 3，B7-H3)是B7家族的新成員，是由316個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其mRNA 廣泛表達(dá)于人體組織中，并在多種腫瘤組織包括原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中高表達(dá)，參與HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。白細(xì)胞介素-21(Interleukin-21，IL-21)作為新的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)因子，是2000年發(fā)現(xiàn)的IL-2細(xì)胞因子家族成員，其在免疫調(diào)節(jié)[2]、抗腫瘤[3]中的作用越來越受到研究者的重視。 原發(fā)性肝癌(Primary hepatic carcinoma，PHC) (簡稱肝癌)是我國常見的惡性腫瘤之一，目前已知的與肝癌相關(guān)的肝炎病毒不少，乙型和丙型肝炎病毒是至今已初步明確的多見病源，其導(dǎo)致肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制仍然未明[4]。 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是全球性人類健康問題，在慢性乙型肝炎患者中，約15%～25%死于重型肝炎、肝硬化或肝癌。研究表明，在中國，肝癌患者多數(shù)由HBV持續(xù)感染所致。由于可溶性B7-H3(Soluble B7-H3，sB7-H3)、IL-21與HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌的相關(guān)研究卻鮮見，本組對HBV相關(guān)原發(fā)性肝癌血清B7-H3和IL-21表達(dá)及二者間的關(guān)系進(jìn)行了研究，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 2014年1月～2015年6月期間在本院住院且資料完整的HBV相關(guān)肝病患者，包括肝癌組50例原發(fā)性肝癌，男45例，女5例，年齡(55.5±9.9)歲；良性組71例乙肝患者[包括急性肝炎12例，男8例，女4例，年齡(33.3±10.4)歲；慢性中至重度肝炎21例，男15例，女6例，年齡(44.8±16.6)歲；代償型肝硬化20例，男14例，女6例，年齡(47.6±14.5)歲；失代償型肝硬化18例，男13例，女5例，年齡(52.4±10.7)歲]。經(jīng)生化和免疫檢測正常者20例為正常組，男15例，女5例，年齡(33.2±12.6)歲。 病例入選標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性肝癌診斷符合《中國肝癌診治指南》(2009版)；慢性乙型肝炎或肝硬化等診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南》(2010年)[5]。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，患者知情同意?；颊邩?biāo)本均在治療前抽取；要求使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3 000 r/min離心 10 min，迅速小心地分離血清，置-70℃冰箱備檢。

1.1.2材料與試劑 酶標(biāo)儀雷杜RT-6000酶標(biāo)儀 (上海斯立普)，恒溫箱比朗HH-420 (上海比朗)，全自動洗板機(jī)(鄭州基波斯)。 實(shí)時熒光定量擴(kuò)增儀ABI7500 (美國ABI)，干式恒溫器，K10CD(杭州藍(lán)焰)。人可溶性B7同源體3(sB7-H3)ELISA試劑、IL-21 ELISA試劑品牌均為Rapidbio，購自上海研輝生物科技有限公司；HBV DNA定量試劑(湖南圣湘)。

1.2方法

1.2.1sB7-H3定量檢測 樣本孔先加待測樣本10 μl，再加樣本稀釋液40 μl。除空白孔外，每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體 100 μl，封板膜封住反應(yīng)孔，37℃溫育60 min。經(jīng)全自動洗板機(jī)洗板之后，加底物 A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min；最后加入終止液 50 μl，15 min 內(nèi)測定，比色波長為450 nm。所得曲線方程：y=23.266x-0.798 7，相關(guān)系數(shù)為0.991 4。試劑靈敏度為1.0 ng/ml。

1.2.2IL-21定量檢測 操作流程同sB7-H3，所得曲線方程：y=336.16x+0.064 6，相關(guān)系數(shù)為0.993 1。試劑靈敏度為 1.0 pg/ml。

1.2.3HBV DNA定量采用實(shí)熒光PCR法檢測，試劑靈敏度為 5.0×102拷貝/ml。

2 結(jié)果

2.1一般資料 基礎(chǔ)資料詳見表1。為便于分析，病例按HBV DNA定性、定量結(jié)果分組，分別設(shè)定分組標(biāo)準(zhǔn)：HBV DNA定性分組：HBV DNA定量<1.00×103拷貝/ml為陰性組， ≥ 1.00×103拷貝/ml為陽性組； HBV DNA定量分組：HBV DNA<1.00×103拷貝/ml為陰性組，1.00×103拷貝/ml≤HBV DNA<5.00×104拷貝/ml為低含量組，5.00×104拷貝/ml≤HBV DNA<1.00×106拷貝/ml為中含量組，HBV DNA≥1.00×106拷貝/ml為高含量組。

表1HBV相關(guān)肝病患者基礎(chǔ)資料

Tab.1BasicdataofpatientswithHBVrelatedliverdiseases

ObjectnCharacterizationofHBVDNA(Positive/Negative)QuantitativeanalysisofHBVDNAx±s(Copies/ml)Hepatocellularcarcinomagroup5037/133.83×105±9.33×105Benigngroup7154/171.13×107±4.47×107 Acutehepatitis1212/03.74×107±6.15×107 Chronichepatitis2118/31.85×105±6.83×104 Compensatedcirrhosis2011/91.73×105±5.57×105 Decompensatedcirrhosis1813/52.03×106±5.92×106Normalgroup200/200

2.2HBV相關(guān)肝癌sB7-H3 、IL-21的表達(dá) 見表2、3。結(jié)果表明：肝癌患者sB7-H3與IL-21均呈高水平表達(dá)，明顯高于正常組(P<0.000 1)，亦高于良性組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3sB7-H3 、IL-21表達(dá)水平與不同疾病的關(guān)系

2.3.1sB7-H3 在不同肝炎疾病中的表達(dá)水平(圖1) 可觀察到sB7-H3 在不同肝炎疾病中呈較高水平表達(dá)，疾病組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，F(xiàn)=37.23)；不同疾病組與正常組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005，t值分別為：31.18、12.22、9.93、8.89和26.20)；急性肝炎分別與其余各疾病間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，t分別為2.14、2.48、2.52和2.93)； 而其余各疾病間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3.2IL-21在不同肝炎疾病中的表達(dá)水平(圖2) 結(jié)果顯示： 在肝炎疾病患者中，IL-21的表達(dá)呈較高水平，不同肝炎疾病間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，F(xiàn)=21.33)，不同疾病組與正常組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005，t值分別為：7.22、10.67、9.88、8.70和15.34)；各疾病間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4HBV相關(guān)肝癌患者sB7-H3 與IL-21之間的關(guān)系 經(jīng)相關(guān)性分析，結(jié)果表明sB7-H3與IL-21之間呈正相關(guān)(如圖3)，所得回歸方程：Y=9.689x+345.725，相關(guān)系數(shù)(r)=0.475。

GroupsnsB7-H3(ng/ml)ComparedtonormalgroupF/Pt/PComparedwiththebenigngroupF/Pt/PNormal2027.43±12.64//15.94/0.000-19.97/0.000Benign71195.23±70.8415.88/0.000-19.94/0.000//Hepatocellularcarcinoma50207.60±57.1624.93/0.000-26.33/0.0003.58/0.067-1.13/0.266

GroupsCases(n)IL-21(pg/ml)ComparedtonormalgroupF/Pt/PComparedwiththebenigngroupF/Pt/PNormal20307.31±169.63//27.55/0.000-17.26/0.000Benign712217.63±935.6427.65/0.000-17.20/0.000//Hepatocellularcarcinoma502357.28±805.0134.45/0.00-15.44/0.0000.082/0.776-0.84/0.409

圖1 sB7-H3 在不同肝炎疾病中的表達(dá)水平Fig.1 Expression level of sB7-H3 in different hepatitis diseases

圖2 IL-21在不同肝炎疾病中的表達(dá)水平Fig.2 Expression level of IL-21 in different hepatitis diseases

2.5肝癌患者sB7-H3、IL-21表達(dá)與HBV DNA定性分組 結(jié)果顯示：肝癌患者sB7-H3 與IL-21表達(dá)水平明顯增高，高于正常組(P<0.001)。HBV DNA陽性組二標(biāo)志物均值高于陰性組。采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)方差方程的 Levene 檢驗(yàn)后進(jìn)行均值方程的t檢驗(yàn)所得結(jié)果(表4)：HBV DNA定性分組間的sB7-H3 與IL-21經(jīng)方差檢驗(yàn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；t檢驗(yàn)結(jié)果表明HBV DNA定性分組間的IL-21有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)，sB7-H3均值則均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6sB7-H3 與IL-21在肝癌患者HBV DNA定量分組中的表達(dá)狀況 見圖4、5，sB7-H3 與IL-21在患者各分組中表達(dá)均高于正常組(t值分別為：12.26、20.84、9.78和12.64；5.99、11.99、9.57和6.31。P均為0.000<0.001)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)：sB7-H3表達(dá)差異在各組患者間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F均為0.95，P值>0.05)；而IL-21差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.34，P=0.008<0.01)。除HBV DNA陰性組分別與其余各組間IL-21均值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為：-3.367，-3.05和-2.14，P值分別為：0.002<0.005、0.006<0.01和0.045<0.05)外；而其余各組間的sB7-H3與IL-21表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 sB7-H3 與IL-21之間表達(dá)關(guān)系Fig.3 Expression relationship between sB7-H3 and IL-21

表4sB7-H3、IL-21表達(dá)與HBVDNA定性分組的關(guān)系

Tab.4RelationshipbetweensB7-H3，IL-21expressionandqualitativegroupingofHBVDNA

ProjectnsB7-H3(ng/ml)IL-21(ng/ml)Negativegroup14191.61±49.071645.74±826.12Positivegroup36213.35±44.162612.37±849.97F/P0.21/0.6470.06/0.816t/P-1.54/0.131-3.68/0.001

2.7sB7-H3與IL-21分別用于診斷HBV相關(guān)肝癌的效能分析

2.7.1以sB7-H3和IL-21的濃度為變量，正常組為參照水平做ROC曲線，研究它們在肝癌診斷中的準(zhǔn)確性，結(jié)果如圖6所示：sB7-H3、IL-21分別作為標(biāo)志物對肝癌與正常組進(jìn)行區(qū)分時，其AUC值分別是0.965(P=0.000)、0.975(P=0.001)，可提示二者作為血清標(biāo)志物在肝癌診斷都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7.2以sB7-H3和IL-21濃度為變量，良性組及正常組為參照水平做ROC 曲線，觀察它們在肝癌診斷中的準(zhǔn)確性，結(jié)果如圖7所示：sB7-H3、IL-21分別作為標(biāo)志物對肝癌與參照組進(jìn)行區(qū)分時，其AUC值分別是0.625(P=0.033)、0.639(P=0.026)，說明sB7-H3、IL-21作為血清標(biāo)志物用于肝癌診斷價值較低。

圖4 sB7-H3在肝癌患者HBV DNA定量分組中的均值圖Fig.4 Mean map of sB7-H3 in HBV DNA quantitative grouping of patients with hepatocellular carcinoma

圖5 IL-21在肝癌患者HBV DNA定量分組中的均值圖Fig.5 Mean map of IL-21 in HBV DNA quantitative grouping of patients with hepatocellular carcinoma

圖6 以正常組為參照的診斷肝癌ROC曲線Fig.6 ROC curve for diagnosing HCC with normal group as reference

圖7 以良性組及正常組為參照的診斷肝癌ROC曲線Fig.7 ROC curve for diagnosing HCC with benign group and normal group as reference

3 討論

B7-H3最早見于2001年Chapoval等[6]的報道，是從樹突狀細(xì)胞的cDNA庫中克隆出的B7家族新成員，屬于免疫球蛋白的超家庭成員。最近的研究[7]顯示肝癌臨床 TNM 分期越晚，B7-H3表達(dá)水平越高，同時腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages，TAMS )的浸潤程度也越高，B7-H3 表達(dá)和TAMS 浸潤在HCC病情進(jìn)展中趨勢一致，且均與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。IL-21主要是由活化的CD4+T細(xì)胞、NKT細(xì)胞和Th17細(xì)胞產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子，與IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15相似，擁有相同的細(xì)胞因子受體γ鏈即γc。一些研究表明IL-21有著廣泛的生物學(xué)功能，在各種疾病包括病毒感染中扮演著重要的角色[8]。

3.1sB7-H3與IL-21在乙肝相關(guān)肝癌患者中的表達(dá) 研究表明B7-H3在肝癌組織中表達(dá)水平高[9,10]；但sB7-H3在肝癌患者中的表達(dá)卻有爭議。本組結(jié)果顯示HBV相關(guān)肝癌患者sB7-H3均呈高水平表達(dá)，高于正常組(P<0.001)；結(jié)果與王斐斐[11]、許文[12]一致而與李淑湘[13]不同，其差異可能與病例的選擇或檢測的試劑有關(guān)；本組研究中肝癌組均值最高，良性組次之，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

HBV 侵入人體后引起機(jī)體免疫應(yīng)答，此過程中有多種細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，研究證實(shí)IL-21作為炎癥介質(zhì)，參與并影響著乙型肝炎疾病發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸[14,15]。本組結(jié)果表明HBV相關(guān)性肝癌患者血清IL-21呈高水平表達(dá)，均值高于正常組(P<0.001)，亦高于良性組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與sB7-H3表達(dá)趨勢一致。

近年來的報道[16,17]證實(shí)，B7-H3與IL-21之間存在關(guān)聯(lián)，本組結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了它們之間呈正相關(guān)，可推測在HBV相關(guān)肝病(癌)患者中，B7-H3與IL-21之間存在正性調(diào)節(jié)作用可能?；诟伟┗颊叽嬖诿庖吖δ芪蓙y，B7-H3與IL-21持續(xù)高表達(dá)，可能與患者疾病的發(fā)展、預(yù)后有關(guān)。

3.2sB7-H3與IL-21表達(dá)水平與HBV相關(guān)的各疾病之間的關(guān)系 有關(guān)報道顯示HBV患者中sB7-H3表達(dá)水平不一。本組研究表明sB7-H3在HBV相關(guān)疾病患者中的表達(dá)均有不同程度的增高，高于正常組(P<0.001)，結(jié)果與李廣云[18]一致，而與李淑湘[13]的和成婧[19]的不一致。

HBV感染后，患者IL-21水平和IL-21+CD4+T 細(xì)胞升高，且與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[20]。在CHB患者，病毒持續(xù)感染使IL-21 維持較低水平，當(dāng)用干擾素和核酸類似物等藥物治療后，隨著病毒清除和病毒載量下降，IL-21水平升高[21]，這可能與干擾素通過免疫調(diào)節(jié)途徑參與的抗病毒效應(yīng)相關(guān)[22]。 另一方面，CHB 患者的肝臟炎癥和纖維化程度與組織中IL-21 的表達(dá)顯著關(guān)聯(lián)[23]。本組研究結(jié)果表明IL-21在HBV相關(guān)疾病中的表達(dá)水平均高于正常對照，同相關(guān)研究[24-26]一致，其中急性乙型肝炎均值最高，肝癌次之，與sB7-H3在HBV相關(guān)的不同疾病中的表達(dá)趨勢一致，提示高表達(dá)的IL-21 可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌炎性因子損傷肝臟[20]。

3.3sB7-H3、IL-21表達(dá)與HBV DNA的關(guān)系 本研究顯示乙型肝炎患者血清B7-H3、IL-21表達(dá)水平均較高，高于正常組；進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)HBV DNA陽性的肝癌患者sB7-H3 與IL-21均值分別高于HBV DNA陰性的肝癌患者，但兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在HBV DNA定量分組中，我們嘗試了兩種分組劃分標(biāo)準(zhǔn)，但最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明與HBV DNA定性分組一致，提示B7-H3在HBV相關(guān)性肝癌患者血清中表達(dá)水平與HBV DNA的復(fù)制與否及復(fù)制水平無明顯關(guān)聯(lián)性，而IL-21與HBV DNA的復(fù)制與否有關(guān)，但與復(fù)制水平無明顯關(guān)聯(lián)性。sB7-H3表達(dá)與前期研究[27]一致；IL-21則與姚佳燕等[28]報道不一致，這可能與研究對象狀況不同有關(guān)。

3.4sB7-H3、IL-21分別診斷HBV相關(guān)肝癌的效能分析 李廣云等[18]以sB7-H3濃度為變量，正常組為參照水平做ROC曲線，研究sB7-H3作為標(biāo)志物在肝癌診斷中的準(zhǔn)確性，所得結(jié)果提示sB7-H3作為血清標(biāo)志物在肝癌臨床診斷中有價值。

本組先以sB7-H3、IL-21的濃度為變量，以正常組為參照水平做ROC曲線，觀察它們作為標(biāo)志物運(yùn)用于肝癌診斷中的準(zhǔn)確性，sB7-H3、IL-21分別作為標(biāo)志物對肝癌與正常組進(jìn)行區(qū)分時，其AUC值分別是1.00(P=0.000)和0.978(P=0.001)。然后再以sB7-H3、IL-21濃度為變量，良性組及正常組為參照水平做ROC 曲線，結(jié)果所得AUC值分別是0.625(P=0.033)和0.639(P=0.026)，提示sB7-H3、IL-21作為血清標(biāo)志物在臨床診斷HBV 相關(guān)肝癌診斷價值較低。

綜上所述sB7-H3、IL-21在HBV相關(guān)肝癌患者中表達(dá)水平高，且表達(dá)呈正相關(guān)；其持續(xù)高表達(dá)可能與乙型肝炎患者的疾病演變相關(guān)。而運(yùn)用sB7-H3、IL-21診斷肝癌的效能結(jié)果表明它們診斷肝癌組的效能受參照對象水平影響，其在肝癌中的診斷作用尚須更多的實(shí)驗(yàn)和證據(jù)加以證實(shí)。

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