江哲珍 祝少博*余黎 汪冰 鄧玲瓏 魏馳

骨肉瘤是青少年和兒童常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，其臨床特點(diǎn)是轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差、生存率低等[1]。近年來，新輔助化療的開展與應(yīng)用使患者生存率由之前的15%左右提高到80%左右[2]，但現(xiàn)有化療藥物的毒副作用較大，部分患者因?yàn)闊o法堅(jiān)持完成化療而導(dǎo)致腫瘤出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)，治療效果得不到提高[3,4]，這一現(xiàn)象引起了臨床醫(yī)生和腫瘤研究者的極大關(guān)注和重視。研究新型、高效低毒的抗腫瘤藥物，對(duì)改善骨肉瘤患者的預(yù)后具有重要的意義，現(xiàn)已成為骨肉瘤治療研究的重點(diǎn)之一。

左旋含羞草堿（L-Mimosine）是一種從含羞草或銀合歡中提取出來的少見的植物氨基酸，分子量大小為198.2。左旋含羞草堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)較特殊，與胸腺嘧啶極其相似，但作用不同于目前常用的化學(xué)治療藥物[5,6]。研究發(fā)現(xiàn)左旋含羞草堿能夠可逆性抑制哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期，主要在G1/S期起作用，影響細(xì)胞DNA復(fù)制的啟動(dòng)及復(fù)制鏈的延長(zhǎng)[7]。已有研究發(fā)現(xiàn)左旋含羞草堿能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，但左旋含羞草堿作用的確切機(jī)制尚不清楚[8-10]。本研究主要探討左旋含羞草堿對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用，并初步探討其中的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

骨肉瘤細(xì)胞系MG-63和U2-OS購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM-F12培養(yǎng)基、PBS溶液及胰蛋白酶-EDTA（杭州吉諾生物），胎牛血清（Gibco公司），CCK-8試劑盒（日本同仁生物科技有限公司），F(xiàn)ITCAnnexinⅤ-PI凋亡雙染試劑盒（Roche公司），Hoechst33258（Sigma-Aldrich公司），兔抗人p-Histone H2A.x、PI3Kp110 、mTOR、GAPDH一抗（Cell Signaling Technology）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

骨肉瘤細(xì)胞MG-63及U2-OS用RPMI1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清）常規(guī)培養(yǎng)，置入37℃、5%CO2飽和濕度條件下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；人成骨細(xì)胞hFOB1.19在DMEM-F12培養(yǎng)基（10%胎牛血清），置入33.5℃、5%CO2飽和濕度條件下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。左旋含羞草堿溶于PBS溶液中，實(shí)驗(yàn)時(shí)直接加入培養(yǎng)基中達(dá)到實(shí)驗(yàn)終濃度，細(xì)胞分6組：空白對(duì)照組，100 M左旋含羞草堿組，200 M左旋含羞草堿組，400 M 含左旋羞草堿組，100 mg/mL檸檬酸鐵胺組，400 M左旋含羞草堿+100mg/mL檸檬酸鐵胺組。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合狀態(tài)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,吸管反復(fù)將細(xì)胞輕輕吹打呈單細(xì)胞懸液，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞按1500個(gè)/孔接種于96孔板，置于37℃、含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)，按照1.2步驟中的分組加藥處理，每種濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。再分別培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后取出培養(yǎng)板，每孔加入CCK8試劑10 L孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處培養(yǎng)細(xì)胞的OD值，并按以下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：抑制率 (%)=腫瘤細(xì)胞抑制率 (IR)=(對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值)/對(duì)照孔OD值×100%。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，并描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人骨肉瘤細(xì)胞或人成骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合狀態(tài)，用 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞輕輕吹打呈單細(xì)胞懸液，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞按105個(gè)/孔接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照1.2步驟中的分組處理,每種濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，離心，PBS洗滌一次，加入 FITC-Annexin V及PI染料，避光孵育30 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 Hochest染色法檢測(cè)細(xì)胞核固縮

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至近融合狀態(tài)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞輕輕吹打呈單細(xì)胞懸液，用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞按104個(gè)/孔接種于6孔板，置于37℃、含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照1.2步驟中的分組處理，每種濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，在培養(yǎng)基中加入Hoechst33258至終濃度為10 mg/L，避光孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核固縮比例并拍照。

1.6 蛋白印跡法檢測(cè)DNA損傷信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，按3×105個(gè)/瓶接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、含5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照1.2步驟中的分組處理，每組三瓶，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，離心，PBS洗滌一次，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定濃度并調(diào)整各組一致。聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉后，分別加入兔抗人p-Histone H2A.x、PI3K p110、mTOR和GAPDH一抗4℃孵育過夜，洗滌后熒光二抗孵育1 h，LI-COR公司odyssey檢測(cè)并分析結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 左旋含羞草堿可以顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖

CCK-8檢測(cè)結(jié)果（見圖1-2，彩圖見插頁）顯示，相比于對(duì)照組，左旋含羞草堿組的OD值隨著作用時(shí)間及濃度的增加而明顯下降，并呈劑量依賴性，且當(dāng)作用時(shí)間為72 h，左旋含羞草堿濃度為400 M時(shí)，MG-63及U2-OS細(xì)胞的增殖抑制率分別達(dá)到81.1%±1.6%和76.7%±2.1%，而在此濃度條件下，加入100mg/mL的FAC后左旋含羞草堿對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的抑制率明顯下降，分別為 13.8%±2.3%和7.5%±1.1%，與400 M左旋含羞草堿組相比，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。

圖1，左旋含羞草堿處理后MG-63細(xì)胞增殖曲線。

圖2，左旋含羞草堿處理后U2-OS細(xì)胞增殖曲線。

2.2 左旋含羞草堿可以有效誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（見圖3，彩圖見插頁）發(fā)現(xiàn)，各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，相比于對(duì)照組，左旋含羞草堿組的細(xì)胞凋亡率顯著增高，并隨著左旋含羞草堿濃度的增加而明顯上升，并呈劑量依賴性，且當(dāng)左旋含羞草堿濃度達(dá)到 400 M 時(shí)，MG-63及 U2-OS細(xì)胞的凋亡率分別為 54.1%±12.6%和46.2%±14.7%，而在此濃度條件下，加入100 mg/mL的 FAC后，MG-63及 U2-OS細(xì)胞的凋亡率顯著降低，分別為10.1%±2.4%和7.5%±1.9%，與400 M 左旋含羞草堿組相比，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。不僅如此，在各個(gè)濃度條件下的左旋含羞草堿均未對(duì)hFOB-1.19造成顯著的細(xì)胞凋亡。

圖3，左旋含羞草堿處理后MG-63，U2-OS及hFOB-1.19細(xì)胞凋亡率。

2.3 左旋含羞草堿可以顯著誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞細(xì)胞核固縮

Hoechst染色結(jié)果（見圖4，彩圖見插頁）顯示，相比于對(duì)照組，400 M左旋含羞草堿組細(xì)胞核固縮比例顯著增高，MG-63及U2-OS細(xì)胞的細(xì)胞核固縮比例分別為53.8%±10.6%、49.2%+8.3%，而在此濃度條件下，加入100 mg/mL的 FAC后，MG-63及U2-OS細(xì)胞的細(xì)胞核固縮比例明顯減少，分別為11.5%±2.0%和13.6%±1.3%，與400 M左旋含羞草堿組相比，均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。

圖4，左旋含羞草堿處理后MG-63及U2-OS細(xì)胞Hoechst染色結(jié)果。

2.4 左旋含羞草堿調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)

蛋白印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，各個(gè)培養(yǎng)條件下，相比于對(duì)照組，左旋含羞草堿組 MG-63細(xì)胞的 DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著改變，細(xì)胞DNA損傷標(biāo)記物p-Histone H2A.x表達(dá)水平顯著增高，PI3K p110及mTOR蛋白表達(dá)水平顯著降低，而加入FAC后，與左旋含羞草堿組相比，p-Histone H2A.x表達(dá)水平顯著降低，而PI3K p110及mTOR蛋白表達(dá)水平顯著增高。

圖5，左旋含羞草堿處理后MG-63細(xì)胞蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果。

3 討論

左旋含羞草堿是從含羞草或銀合歡中提取的生物活性物質(zhì)，它的生物學(xué)活性作用近些年受到較多的研究，具有顯著的抗腫瘤作用，包括前列腺癌、肝癌等[11,12]，其在骨肉瘤中的作用目前尚無研究報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)左旋含羞草堿可以有效抑制骨肉瘤MG-63及U2-OS細(xì)胞系的細(xì)胞增殖，顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞核固縮，并明顯調(diào)節(jié)與骨肉瘤MG-63細(xì)胞DNA損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白表達(dá)。

調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)過程是藥物治療腫瘤的分子機(jī)制之一，p-Histone H2A.x是細(xì)胞出現(xiàn)DNA損傷的標(biāo)記物之一[13]，本研究發(fā)現(xiàn)左旋含羞草堿處理后，骨肉瘤MG-63細(xì)胞中p-Histone H2A.X蛋白表達(dá)顯著增高，進(jìn)而表明左旋含羞草堿可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞出現(xiàn)顯著的DNA損傷，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。PI3K-mTOR信號(hào)通路在 DNA損傷及修復(fù)過程中發(fā)揮了重要的作用，Davis等的研究表明細(xì)胞出現(xiàn) DNA損傷后，PI3K-mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白會(huì)發(fā)生顯著改變，有利于DNA損傷修復(fù)[14]，本研究也發(fā)現(xiàn)左旋含羞草堿處理后，骨肉瘤細(xì)胞PI3K-mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白mTOR及PI3KP110的表達(dá)也發(fā)生了顯著下調(diào)，但是仍不能代償其對(duì)DNA損傷的效應(yīng)，進(jìn)而發(fā)生顯著的細(xì)胞凋亡。

有研究表明，左旋含羞草堿是一種鐵螯合劑，可以螯合細(xì)胞內(nèi)的二價(jià)鐵離子，鐵離子是細(xì)胞維持正常生物學(xué)功能的重要元素之一[15,16]。左旋含羞草堿誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的生物學(xué)作用是否與這種生物學(xué)功能有關(guān)需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)，本研究的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在給予左旋含羞草堿處理同時(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)充富含三價(jià)鐵離子的檸檬酸鐵胺，可以顯著減弱左旋含羞草堿抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，骨肉瘤細(xì)胞的DNA損傷標(biāo)記物p-Histone H2A.X水平顯著降低，PI3K-mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平趨于正常，表明左旋含羞草堿誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63及U2-OS細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡與左旋含羞草堿的鐵螯合作用密切相關(guān)，這種效應(yīng)的機(jī)制可能是左旋含羞草堿螯合了骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)的二價(jià)鐵離子，導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)受阻，從而引起DNA損傷而誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡等下一步的生物學(xué)過程。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，左旋含羞草堿可以有效抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，其生物機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞核固縮和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)有密切關(guān)系。因此，對(duì)左旋含羞草堿在生物體內(nèi)的抗腫瘤作用、毒副作用及生物安全性需要做進(jìn)一步的深入研究，從而為其今后臨床治療骨肉瘤提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，爭(zhēng)取為臨床治療骨肉瘤開辟一條新的道路。

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