王 雯 姚作嬌 陸 巍 沃春新 姚 旌 張忠杰 王 林△

（1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科，貴陽(yáng)550004；2黔西南州人民醫(yī)院麻醉科，貴州黔西南562400）

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是老年人最常見關(guān)節(jié)疾病之一，其病理改變主要是關(guān)節(jié)軟骨退變，軟骨下骨贅形成，滑膜慢性炎癥，關(guān)節(jié)周圍韌帶損傷等，該病伴隨關(guān)節(jié)僵硬，關(guān)節(jié)腫脹，晚期有一定的致殘率[1]，本病發(fā)病多與肥胖、關(guān)節(jié)過度使用、衰老、遺傳因素等多因素相關(guān)。發(fā)病機(jī)制也不完全清楚，該病發(fā)病率逐年上升，發(fā)病年齡年輕化，成為近年來骨科及相關(guān)科室就診率極高的病種，傳統(tǒng)治療多于晚期出現(xiàn)關(guān)節(jié)腔嚴(yán)重病變，出現(xiàn)關(guān)節(jié)腔病變后給予治療，效果往往不盡如人意。故近年來，探索OA發(fā)病機(jī)制、早期阻斷炎性介質(zhì)的釋放信號(hào)通路，尋找OA治療靶點(diǎn)成為國(guó)內(nèi)外研究的方向。下游表達(dá)的炎性細(xì)胞因子公認(rèn)參與了OA的發(fā)生發(fā)展[2]。TWEAK作為腫瘤壞死因子超體家族的新成員之一倍受關(guān)注。而Fnl4是近年來研究較多的特異性受體，它廣泛存在于TWEAK高敏感性器官和組織。TWEAK/Fnl4發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)可以通過激活激活NF-κB、ERIC、JNK及MARK等信號(hào)途徑發(fā)揮。有研究認(rèn)為TWEAK及其配體Fn14也參與了骨性關(guān)節(jié)炎的病理過程[3]。但就TWEAK抗體干預(yù)和治療OA的動(dòng)物模型的研究現(xiàn)國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)[4]，在大鼠OA模型中，TWEAK及其受體Fn14的mRNA和蛋白表達(dá)在滑膜及軟骨中均有明顯增加，但對(duì)于阻斷TWEAK及其受體Fn14的表達(dá)是否影響OA的發(fā)生及發(fā)展，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究較少。本實(shí)驗(yàn)擬通過建立OA動(dòng)物模型，通過建模前對(duì)TWEAK通路進(jìn)行阻斷，觀察OA與TWEAK/Fn14關(guān)系以及其可能激活的下游炎性因子IL-1β、TNF-α改變，探討TWEAK/Fn14激活是否在OA發(fā)生發(fā)展中起重要作用。以期進(jìn)一步闡明OA的發(fā)病機(jī)制，并為探尋防治OA有效的新靶點(diǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

24只健康2～3月齡SD大鼠(雌雄各半)（貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供），體重200～250 g（實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》），隨機(jī)分為3組，即正常組、模型組及TWEAK抗體組，每組8只。

2.主要試劑和儀器

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒（北京天根生化科技有限公司）、引物（英灘基捷（上海）貿(mào)易有限公司）、兔抗鼠TWEAK單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司）、核酸蛋白分析儀 Beckman Coulter DU640型 、PCR 擴(kuò)增儀 PE 2400型、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 PE 5700型、ⅡaB型臭氧發(fā)生儀（德國(guó)Herrmann Apparatebau GmbH）。

3.動(dòng)物模型制作

正常組不做任何處理，其余兩組分別在1、4、7天于左膝關(guān)節(jié)腔注射4%木瓜蛋白酶進(jìn)行骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型復(fù)制[5]。TWEAK抗體組大鼠在造模前1小時(shí)將大鼠固定后，用10%水合氯醛對(duì)大鼠腹腔注射(0.06 ml/10 g)進(jìn)行麻醉，經(jīng)鼠尾靜脈注射TWEAK單克隆抗體(225 μg/kg)[6]。在實(shí)驗(yàn)完成后一周，麻醉后用頸椎脫臼法處死大鼠，取膝關(guān)節(jié)滑膜組織，部分標(biāo)本立即置于10%中性甲醛液固定24 h分組標(biāo)記,石蠟包埋。部分組織保存于-80℃冰箱中，作為real-time PCR組織標(biāo)本。

4.關(guān)節(jié)滑膜實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TWEAK和Fnl4的表達(dá)

（1）RNA提取：將滑膜組織加入研缽中，加用少量液氮，簡(jiǎn)單研磨。加入Trizol液1 ml，研磨成液體。加入200 μl氯仿，適度搖勻15秒，室溫下放置2～3 min。高速冰凍離心 4 ℃ 12 000轉(zhuǎn)，15 min。取上清約 400 μl,加入異丙醇 400 μl,上下顛倒混勻，室溫下靜置10 min，高速冰凍離心 4 ℃12 000轉(zhuǎn)，10 min，棄上清。70%乙醇1 ml（DEPC水配制）洗滌1次，高速冰凍離心 4 ℃ 7 500轉(zhuǎn)，5 min。棄上清，干燥10 min。加入30 μlDEPC水充分溶解備用。

（2）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA：根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄FastQuant RT Kit試劑盒說明書操作，反應(yīng)體系（20 μl）；5×gDNA Buffer 2 μl；10×Fast RT Buffer 2 μl；RT Enzyme Mix1μl；FQ-RT Primer Mix 2 μl；RNase-Free ddH2O根據(jù)實(shí)際情況補(bǔ)足至20 μl。將上述混勻，放入PCR擴(kuò)增儀中42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min之后放置冰上，得到的cDNA用于后續(xù)試驗(yàn)，保存于-20 ℃冰箱。

（3）熒光實(shí)時(shí)測(cè)定PCR：根據(jù) RT-PCR試劑盒進(jìn)行操作：根據(jù)TWEAK及FN14基因序列設(shè)計(jì)并合成PCR引物：

TWEAK引物 (F)5'-AGGTGTCTGGGCTGTTGC-3' (R)5' -TAGAGGGTGGAGGAGTGGG-3' Fn14引物 (F)5' -AGCAAGCACCAGGCAACG-3' (R)5' -CGCATCCCAGGCAGAAGT-3' GAPDH引物(F)5'-TATCGGACGCCTGGTTAC-3 (R)5'-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3'

完全融化cDNA，特異性引物，2×Super-Real PreMix Plus，50×ROX Reference Dye△ ,RNase-free ddH2O,短暫離心后置于冰上。2×Super-Real PreMix Plus 10 μl；50×ROX Reference Dye △2 μl；上、下游特異性引物各 0.6 μl；cDNA 模板 3 μl；RNase-Free ddH2O根據(jù)實(shí)際情況補(bǔ)足至20 μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃，5 min；95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性 10 s，60 ℃退火 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件分析(ABI Prism 7500 SDS Software)，用△△Ct法進(jìn)行各基因表達(dá)的相對(duì)定量。

5.免疫組化法檢測(cè)IL-1β,TNF-α在滑膜中的表達(dá)

切片用DAB染色的陽(yáng)性結(jié)果為軟骨細(xì)胞胞漿/胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒,淡黃色為弱陽(yáng)性，黃色為陽(yáng)性，棕黃色為中度陽(yáng)性，棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性。鏡下（× 200）隨機(jī)觀察不重疊的五個(gè)視野，計(jì)數(shù)各因子胞漿陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

6.統(tǒng)計(jì)分析

所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為定量資料，采用excel建立數(shù)據(jù)庫(kù)。使用SPSS V 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，組間比較先確定樣本是否符合正態(tài)分布，若比較結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，繼續(xù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.滑膜組織HE染色光鏡觀察

①正常組：滑膜上皮細(xì)胞為單層、扁平樣分布，滑膜組織結(jié)構(gòu)正常（見圖1）。②模型組：滑膜上皮細(xì)胞表現(xiàn)為明顯增生，細(xì)胞層次明顯增多，排列不均，可見部分滑膜組織結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)組織水腫、變性及壞死，部分區(qū)域伴有血管擴(kuò)張充血，部分區(qū)域甚至出現(xiàn)炎性肉芽組織及纖維組織增生（見圖1）。③TWEAK抗體組：滑膜上皮出現(xiàn)局部增生，細(xì)胞層次增多。未見明顯纖維增生及血管增生（見圖1）。

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)滑膜中TWEAK mRNA表達(dá)

TWEAK mRNA表達(dá)：模型組、TWEAK抗體組與正常組比較均有明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；TWEAK抗體組和模型組比較表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，見表1）。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)滑膜中Fnl4 mRNA表達(dá)

Fn14 mRNA的表達(dá)：模型組、TWEAK抗體組與正常組比較均有明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜ 0.05）；TWEAK抗體組和模型組比較表達(dá)降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜ 0.05，見表1）。

4.免疫組化檢測(cè)IL-1β的表達(dá)

與正常組相比，模型組細(xì)胞陽(yáng)性率顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，見表2）；與模型組相比，TWEAK抗體組細(xì)胞陽(yáng)性率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，見表2、圖2）。

5.免疫組化檢測(cè)TNF-α的表達(dá)

與正常組相比，模型組細(xì)胞陽(yáng)性率顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，見表2）；與模型組相比，TWEAK組細(xì)胞陽(yáng)性率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05，見表2、圖3）。

討 論

OA是一種常見的關(guān)節(jié)慢性病變，是力學(xué)和生物學(xué)共同作用下造成的老年性疾病[7]。有研究認(rèn)為滑膜炎性病變?cè)诠顷P(guān)節(jié)炎的發(fā)生中并不是旁觀者，而是關(guān)節(jié)破壞的直接參與者，促進(jìn)了骨關(guān)節(jié)炎的病程進(jìn)展[8]。

本研究結(jié)果顯示，模型組滑膜上皮細(xì)胞明顯增生，細(xì)胞層次明顯增多，排列不均，可見部分滑膜組織結(jié)構(gòu)破壞、組織水腫、變性及壞死，部分區(qū)域伴有血管擴(kuò)張充血，甚至出現(xiàn)炎性肉芽組織及纖維組織增生。同時(shí)滑膜組織IL-1β及TNF-α的表達(dá)增高，進(jìn)一步證實(shí)了炎性細(xì)胞因子參與了OA的發(fā)生發(fā)展[9]。滑膜是被覆關(guān)節(jié)腔內(nèi)面的纖維結(jié)締組織，可以分為靠近關(guān)節(jié)腔的滑膜內(nèi)層(滑膜襯里層或滑膜細(xì)胞層)及其滑膜下層 (滑膜襯里下層)。滑膜出現(xiàn)炎癥后，滑膜細(xì)胞[10～12]不僅會(huì)喪失許多生理功能，而且還分泌過多的IL-1,TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)蛋白溶解酶合成，這些炎性成分又可作用于軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞及其周圍組織進(jìn)一步促進(jìn)致炎因子的產(chǎn)生，加速軟骨基質(zhì)降解，終至出現(xiàn)軟骨破壞。此外，因炎癥而變形的滑膜皺璧可伸入關(guān)節(jié)間隙，與關(guān)節(jié)軟骨面相互擠壓摩擦，加重對(duì)軟骨的物理?yè)p傷。因此有學(xué)者認(rèn)為滑膜炎癥可能為OA病理演變中重要的“啟動(dòng)子”并貫穿整個(gè)病理過程[13]。

表1 不同組大鼠滑膜組織中TWEAK / Fnl4 mRNA表達(dá)(n = 8,±SD)Table1 The expressions of TWEAK/ Fnl4 mRNA in synovial of rats in different groups (n = 8,±SD)

表1 不同組大鼠滑膜組織中TWEAK / Fnl4 mRNA表達(dá)(n = 8,±SD)Table1 The expressions of TWEAK/ Fnl4 mRNA in synovial of rats in different groups (n = 8,±SD)

*P ＜ 0.05，與正常組相比，compared with the normal group； #P ＜ 0.05，與模型組相比，compared with the model group.

TWEAK抗體組TWEAK antibody group TWEAK mRNA 0.21±0.15 0.79±0.21* 0.41±0.17*#Fn14mRNA 0.18±0.17 0.63±0.24* 0.38±0.24*#組別Group正常組Normal group模型組Model group

表2 不同組大鼠滑膜組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)(n = 8,±SD)Table 2 The expressions of IL-1β and TNF-α in synovial of rats in different groups (n = 8,±SD)

表2 不同組大鼠滑膜組織中IL-1β、TNF-α表達(dá)(n = 8,±SD)Table 2 The expressions of IL-1β and TNF-α in synovial of rats in different groups (n = 8,±SD)

*P ＜ 0.05，與正常組相比，compared with the normal group； #P ＜ 0.05，與模型組相比，compared with the model group.

TWEAK抗體組TWEAK antibody group IL-1β 15.24±2.64 52.35±4.23* 32.72±4.57*#TNF-α 12.34±3.21 47.56±3.45* 34.24±3.27*#組別Group正常組Normal group模型組Model group

圖1 滑膜 HE (A) 正常組(B)模型組(C) TWEAK抗體組 (Scale bar = 200 μm)Fig.1 HE staining of synovial in normal (A) model (B) and TWEAK antibody group (C) (Scale bar = 200 μm)

圖2 滑膜 IL-1β表達(dá)(A)正常組(B)模型組(C) TWEAK抗體組(Scale bar = 200 μm)Fig. 2 The expressions of IL-1β in synovial of rats in normal (A) model (B) and TWEAK antibody group (C) (Scale bar = 200 μm)

圖3 滑膜 TNF-α表達(dá)(A)正常組(B) 模型組(C) TWEAK抗體組( Scale bar = 200 μm)Fig.3 The expressions of TNF-α in synovial of rats in normal (A) model (B) and TWEAK antibody group (C) (Scale bar = 200 μm)

腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導(dǎo)劑 (tumor necrosis factor. like weak inducer of apoptosis, TWEAK) 作為腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor, TNF) 超體家族的新成員之一倍受關(guān)注[14]。而Fnl4是近年來研究較多的、TWEAK的特異性受體，它廣泛存在于TWEAK高敏感性器官和組織。TWEAK/Fnl4發(fā)揮生物學(xué)作用可以通過激活多條信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其中包括激活NF-κB、ERIC、JNK及MARK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可以引起一系列的相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)[15]，NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認(rèn)為有著重要的作用。TWEAK/Fnl4與TRAF分子結(jié)合可以激活兩條NF-κB相關(guān)信號(hào)通路：P100程序化和IκBα磷酸化[16]。已有研究證實(shí)NF-κB的表達(dá)在OA關(guān)節(jié)液及軟骨中明顯增高[17]。NF-κB活化后可以進(jìn)入細(xì)胞核，與許多免疫調(diào)節(jié)因子或促炎因子結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，生成誘導(dǎo)型酶類 (如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶、磷脂酶A)、急相蛋白、細(xì)胞因子、黏附分子等。而這些由NF-κB所激活的細(xì)胞因子包括了 MMP-9, MMP-13, IL-1β, TNF-α等，這些細(xì)胞因子在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起到了重要作用。有學(xué)者證實(shí)[18]TWEAK/Fn14不僅僅參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性腎臟損傷、多發(fā)性硬化等免疫風(fēng)濕性疾病，而且高表達(dá)于腦卒中、哮喘及心肌梗塞等疾病。動(dòng)脈粥樣硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡將TWEAK作為早期的診斷和療效的生物標(biāo)記[19]。研究表明在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)病人血液中NF-κB的表達(dá)也有明顯增高，TWEAK作為NF-κB的上游激活劑，有研究認(rèn)為TWEAK及Fn14也參與了骨性關(guān)節(jié)炎的病理過程[20]。但就TWEAK抗體干預(yù)和治療OA的動(dòng)物模型的研究現(xiàn)國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠OA造模成功后，模型組大鼠OA滑膜的TWEAK及Fn14較正常組均出現(xiàn)明顯的增高，同時(shí)滑膜組織IL-1β及TNF-α的表達(dá)也增高，而TWEAK抗體組大鼠OA滑膜的TWEAK及 Fn14表達(dá)則降低 (P＜ 0.05)，IL-1β及 TNF-α 的表達(dá)也同時(shí)降低 (P＜ 0.05)，滑膜組織病理變化程度較模型組改善，提示TWEAK及Fn14參與了OA的發(fā)生發(fā)展，鑒于于TWEAK具有趨化因子分泌、細(xì)胞增生促進(jìn)炎性細(xì)胞因子等生物學(xué)效應(yīng)，因此推測(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織中TWEAK及Fn14 mRNA表達(dá)的增加可能是OA疾病啟動(dòng)因素之一。然而，TWEAK抗體組大鼠OA滑膜的TWEAK及Fn14表達(dá)、IL-1β及TNF-α的表達(dá)均未降至正常水平，本次研究中所用的為TWEAK多克隆抗體，且給藥途徑為經(jīng)鼠尾靜脈給藥，給藥的劑量也為相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究的給藥劑量下限，故推測(cè)是否與TWEAK抗體劑量、給與的時(shí)機(jī)以及抗體給藥方式有關(guān)有待進(jìn)一步研究探明。

綜上所述，大鼠膝關(guān)節(jié)OA滑膜組織中TWEAK及Fn14 mRNA表達(dá)的增加可能是OA疾病啟動(dòng)因素之一，參與了OA的發(fā)生發(fā)展，為臨床上OA的治療提供新的思路及治療靶點(diǎn)。

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