蘇航 田毅 朱紫薇 李珺奇 楊子鶴 常智 李全 牟甜甜 李翔 張曉麗

急性心肌梗死(acute myocardial Infarction，AMI)是心血管疾病中致死率最高的疾病之一，早期急診溶栓和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)仍是目前治療MI最有效的臨床手段[1］。然而對(duì)缺血心肌的再灌注通常會(huì)導(dǎo)致心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[2］，采取積極手段避免MIRI的發(fā)生和發(fā)展，可明顯改善AMI患者的左心室功能，最終改善患者的遠(yuǎn)期預(yù)后[3-4］。二甲雙胍(metformin，MF)是常見的降血糖藥，對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用受到廣泛的關(guān)注，其相關(guān)機(jī)制尚不明確。核醫(yī)學(xué)分子影像學(xué)技術(shù)從分子水平，動(dòng)態(tài)、在體實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)MIRI心肌的血流灌注、心肌細(xì)胞代謝和細(xì)胞活性等一系列病理生理學(xué)特點(diǎn)，輔以組織病理學(xué)檢測(cè)，深入探討MIRI的發(fā)生發(fā)展過程，為此，本研究采用18F-FDG PET/CT心肌代謝顯像，從分子影像學(xué)角度探討MF干預(yù)對(duì)大鼠MIRI的作用及其潛在的價(jià)值。

資料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用雄性，SD大鼠，16只，周齡約4～6周，體質(zhì)量約200～240g，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供。主要設(shè)備包括Inveon型Micro-PET/CT掃描儀(德國(guó) SIMENS公司)、Matrx VMR型麻醉機(jī)(美國(guó)MATRX公司)、LeicaRM2235切片機(jī)(北京中儀光科科技發(fā)展有限公司)、免疫組化顯微鏡成像系統(tǒng)(ECLIPSE50i/55i，NICON)。顯像劑18F-FDG由北京原子高科股份有限公司提供提供，放化純＞95%。

2.方法 (1)MIRI模型制備：腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，麻醉成功后行氣管插管，機(jī)械通氣，而后開胸，于左側(cè)第3肋間切口，在左心耳下緣距肺動(dòng)脈弓根部2mm處，冠狀動(dòng)脈前降支面置硅膠管與冠狀動(dòng)脈一起結(jié)扎，缺血持續(xù)30min后松開結(jié)扎線，建立缺血再灌注損傷模型。結(jié)扎成功標(biāo)志：結(jié)扎下方心肌顏色變成灰白色。復(fù)灌成功標(biāo)志：心肌顏色由灰白逐漸恢復(fù)正常。

(2)動(dòng)物分組：選取缺血再灌注損傷建模成功的12只SD大鼠(建模死亡率約為25%)，隨機(jī)分為MF干預(yù)組(n=6)及正常對(duì)照組(n=6)，其中MF干預(yù)組自建模成功后第1天開始給予50mg·kg-1·12h-1劑量MF灌胃，正常對(duì)照組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。

3.圖像采集、重建和分析 (1)分別于建模成功后第1天、第7天、第14天、第30天行18F-FDG micro PET/CT門控心肌代謝顯像。每次顯像前稱重記錄大鼠，利用異氟烷-氧氣混合氣體(1.5%)行吸入式麻醉，之后尾靜脈注射18F-FDG約37 MBq，注射30min后行micro PET/CT門控心肌代謝顯像，PET掃描參數(shù)為：層厚 0.78mm，矩陣 128mm×128mm，采集時(shí)間20min，采集能窗350～650 keV。CT掃描參數(shù)：電壓80kV，電流500A，層厚0.1mm，采集時(shí)間10min。掃描結(jié)束后，將掃描的圖像用OSEM3D迭代重建(迭代4次，子集數(shù)為8)。

(2)重建后利用西門子自帶圖像處理軟件Inveon Research Workplace勾畫感興趣容積(volume of interest，VOI)。分別大鼠心肌心尖部、心尖部周邊、下后壁不同部位手動(dòng)勾畫VOI，分別代表缺血中心區(qū)、缺血邊緣區(qū)和遠(yuǎn)端區(qū)，計(jì)算不同部位18F-FDG的標(biāo)準(zhǔn)攝取最大值(SUVmax)，SUV=局部感興趣區(qū)放射性活度(MBq/mL)/注射放射性活度(MBq)/體質(zhì)量(g)。計(jì)算中心區(qū)/遠(yuǎn)端區(qū) SUVmax比值(TBR值)。勾畫左心室心腔容積，獲得左心室整體功能參數(shù)，包括舒張末期容積(EDV，mm3)，收縮末期容積(ESV，mm3)和 LVEF(%)。

4.組織病理學(xué)分析 于第30d圖像采集后，處死大鼠，用手術(shù)剪沿腹中線剪開腹腔，取出心臟，用0.9%氯化鈉溶液沖洗，濾紙吸干水分，沿冠狀溝剪去心房，再沿室間隔剪去室間隔和右心室，獲取左心室心肌。以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后，以5μm厚度連續(xù)切片，每隔5張取一張，用于HE染色，HE染色采用常規(guī)方法進(jìn)行。

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)SUVmax值及左心室功能參數(shù)值(ˉ±s)

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)SUVmax值及左心室功能參數(shù)值(ˉ±s)

注：TBR兩組比較，*P=0.010；EDV兩組比較，**P=0.017

項(xiàng)目 第1天 第7天 第14天 第30天 F值 P值干預(yù)組中心區(qū)/遠(yuǎn)端區(qū) 0.83±0.16 0.85±0.05 0.82±0.13 0.81±0.06* 0.133 0.938 ESV/mm3 88.10±15.6 60.10±44.3 92.70±36.5 68.0±8.5 2.274 0.132 EDV/mm3 302.00±70.2 274.60±65.6 387.70±74.6 358.2±22.6** 4.272 0.029 LVEF/% 70.80±2.2 79.60±3.4 76.22±3.12 81.0±1.4 0.719 0.560對(duì)照組中心區(qū)/遠(yuǎn)端區(qū) 0.90±0.18 0.88±0.14 0.81±0.17 0.65±0.09 4.637 0.037 ESV/mm3 80.50±2.2 68.20±24.6 99.10±30.4 75.4±6.2 19.547 0.000 EDV/mm3 252.10±19.8 315.90±26.6 368.70±46.7 457.5±30.0 8.500 0.003 LVEF/% 67.90±2.3 78.40±2.5 73.10±3.0 83.6±1.1 0.251 0.859

圖1 TBR值與EDV相關(guān)性分析結(jié)果 A：MF干預(yù)組，B：正常對(duì)照組

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同時(shí)間點(diǎn)比較采用單因素ANOVA分析，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。TBR值與心功能參數(shù)之間的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.18 F-FDG microPET/CT門控心肌灌注顯像定量分析 在第1天、7天、14天、30天不同時(shí)間點(diǎn)，MF干預(yù)組及正常對(duì)照組大鼠的心肌不同部位SUV-max值、中心區(qū)/遠(yuǎn)端區(qū)SUVmax比值(TBR值)及左心室功能參數(shù)如表1所示。

在MF干預(yù)組中，中心區(qū)與遠(yuǎn)端區(qū)SUVmax比值在各時(shí)間點(diǎn)無明顯變化趨勢(shì)，與EDV無明顯相關(guān)關(guān)系(r=-0.218，P＞0.05)；而在對(duì)照組中，中心區(qū)與遠(yuǎn)端區(qū)SUVmax比值從再灌注后第1天至第30天逐漸減低，LVEDV逐漸增大，兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.732，P=0.000，圖 1)。

在缺血再灌注術(shù)后1 d，7d和14d，中心區(qū)與遠(yuǎn)端區(qū)TBR值和LVEDV，MF干預(yù)組和對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在治療30d后，中心區(qū)與遠(yuǎn)端區(qū)的TBR值，MF干預(yù)組較對(duì)照組明顯升高[(0.81±0.06)vs.(0.65±0.09)，P＜0.05］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MF干預(yù)組LVEDV較對(duì)照組明顯減小[(358.21±22.62)vs.(457.53±49.91)mm3，P＜0.05］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)，提示MF干預(yù)治療1個(gè)月后，MF減慢了左心室擴(kuò)大及缺血再灌注損傷的程度；在再灌注術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的左心室LVESV和LVEF，兩組大鼠間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 建模術(shù)后第30天，中心區(qū)與遠(yuǎn)端區(qū)的TBR值和LVEDV 注：兩組比較，P＜0.05

2.組織病理學(xué)結(jié)果 兩組大鼠缺血中心區(qū)組織切片HE染色鏡下均見心肌細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，胞漿呈顆粒狀凝集而分布不均勻，呈嗜酸性，橫紋模糊不清或者消失，其中正常對(duì)照組心肌細(xì)胞受損程度較MF干預(yù)組明顯；兩組大鼠缺血中心區(qū)組織切片均示正常心肌組織(圖3)。

圖3 兩組大鼠心肌不同部位(中心區(qū)×10、遠(yuǎn)端區(qū)×20，HE染色比較)

討 論

MF是臨床上應(yīng)用最早、最廣泛和安全有效的雙胍類降血糖口服藥，眾多的臨床及基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用，可降低心血管事件和心力衰竭的發(fā)生率[5-6］。針對(duì)MF的研究，最近一篇Meta分析包括27項(xiàng)體外(心肌組織和心臟)和在體研究(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體臨床試驗(yàn))，發(fā)現(xiàn)MF治療可以減小心肌缺血和心肌梗死面積，減輕心室重構(gòu)程度(收縮及舒張末期容積)，改善心功能，提高LVEF[7-8］。 因此，MF作為一個(gè)安全、有效和相對(duì)便宜的藥物，在治療糖尿病心力衰竭中的地位被得到廣泛認(rèn)可，并于2014年被美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)臨床指南列為糖尿病合并心力衰竭患者的首選藥物[9］。

目前大多數(shù)研究認(rèn)為MF可通過多種途徑保護(hù)心肌細(xì)胞，從而阻止和延緩心室重構(gòu)和心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展[10］。既往研究報(bào)道多采用小鼠、大鼠等MIRI在體和離體模型，評(píng)價(jià)MF對(duì)心血管的保護(hù)作用。然而，研究?jī)H在治療終點(diǎn)針對(duì)心肌組織進(jìn)行病理、免疫組化等方法評(píng)價(jià)MF療效，缺乏系統(tǒng)、連續(xù)的活體影像學(xué)研究。

本研究通過對(duì)大鼠急性灌注模型給予MF干預(yù)治療，分別在建模后急性期(1d，7d)，亞急性期(14d)，慢性期(30d)行18F-FDG microPET/CT門控心肌代謝顯像，動(dòng)態(tài)評(píng)了MF治療過程中，不同部位(缺血中心區(qū)、周邊區(qū)和遠(yuǎn)端區(qū))心肌代謝情況(SUVmax值)隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化的規(guī)律。在正常對(duì)照組中，中心區(qū)與遠(yuǎn)端區(qū)TBR比值從再灌注后第1天至第30天逐漸減低，LVEDV逐漸增大，提示無MF干預(yù)，MIRI程度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加重，左心室重構(gòu)程度不斷增加；而MF干預(yù)組中心區(qū)與遠(yuǎn)端區(qū)TBR比值未隨時(shí)間延長(zhǎng)而減低，EDV無明顯變化，提示MF延緩了缺血再灌注損傷程度和心室重構(gòu)的速度。在建模術(shù)后30d，我們發(fā)現(xiàn)MF干預(yù)組的缺血中心區(qū)與遠(yuǎn)端區(qū)TBR比值較對(duì)照組明顯升高，MF干預(yù)組LVEDV較對(duì)照組明顯減小，提示MF干預(yù)治療一個(gè)月不僅對(duì)大鼠MIRI中的心肌有保護(hù)作用，而且延緩了心室重構(gòu)。但是對(duì)于LVEF沒有明顯影響?？赡茉?，再灌注治療后時(shí)間尚短，缺血再灌注損傷尚沒有導(dǎo)致嚴(yán)重的整體收縮功能受損。

綜上所述，18F-FDG microPET/CT顯像，可以動(dòng)態(tài)評(píng)估大鼠MIRI隨時(shí)間變化的規(guī)律，MF干預(yù)對(duì)缺血再灌注損傷后大鼠心肌缺血具有一定的保護(hù)作用，減輕心肌缺血受損的程度，從而一定程度上延緩心室重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展。