王媛 尤宏釗 任璐 馬友才 王綠婭 王雪 杜杰

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是心血管病中危重的急性事件，近年來發(fā)病率有上升趨勢[1］。大量研究證明，急性心肌梗死會導(dǎo)致心室結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)改變，包括心肌細(xì)胞凋亡、膠原沉積、肥大等，這些改變的機制尚未明確[2］。動物模型在研究急性心肌梗死中起到橋梁作用。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠心肌梗死建模后14d所在分期對應(yīng)急性心肌梗死后重構(gòu)期，并且認(rèn)為重構(gòu)期在急性心肌梗死后的心臟修復(fù)中起到重要作用[3］。但是，既往研究較多關(guān)注在急性心肌梗死早期病理變化情況，而對心肌梗死損傷重構(gòu)期分子表達(dá)水平，特別是是重構(gòu)期心臟組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究甚少[4］。準(zhǔn)確描述急性心肌梗死后重構(gòu)期蛋白譜的變化，不僅對探究病理生理學(xué)過程尤為重要，還可為篩選潛在的藥物治療靶點提供分子學(xué)信息。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是研究某類組織中所有蛋白質(zhì)組成和功能的科學(xué)。傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)通常用雙向凝膠電泳圖譜分析(2-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2DPAGE)技術(shù)進(jìn)行研究[5］，這種方法鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量有限且不能精確定量，介于上述缺陷，我們采用新近報道的同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)[6］，本技術(shù)優(yōu)點在于吞吐量高，穩(wěn)定性高，不受樣本屬性限制[7］。研究應(yīng)用iTRAQ技術(shù)對急性心肌梗死重構(gòu)期心臟組織蛋白進(jìn)行定量分析，在結(jié)合生物信息學(xué)的基礎(chǔ)上，分析差異蛋白所涉及的生物學(xué)進(jìn)程，并探討涉及的信號通路。

材料與方法

1.動物選擇及分組 健康雄性，C57小鼠，18只，體質(zhì)量18～20g，由北京安貞醫(yī)院動物實驗中心提供。所有小鼠術(shù)前禁食6h。本實驗利用隨機數(shù)字表法將18只小鼠分為兩組(n=9)：分別為對照組(Sham組)，心肌梗死組(MI 14d組)。

2.材料及試劑 Q-Exactive質(zhì)譜儀購自Thermo Finnigan(美國)。安捷倫常規(guī)液相，戴安納升液相，布魯克Ultraflex，蛋白濃度測定試劑盒購自 ThermoFisher(美國)。胰蛋白酶、SiTRAQ-plex標(biāo)記試劑盒及緩沖液購自Applied Biosystems(美國)。

3.方法 (1)心肌梗死動物模型制備過程如本研究室前文所述[8］。將各組小鼠放入氣體麻醉機chamber中麻醉后固定在鼠板上，迅速打開左前胸暴露心臟，用6-0proline絲線結(jié)扎冠脈，進(jìn)針深度約1mm，觀察左心室前壁顏色由鮮紅變暗紫至蒼白色，快速將心臟推入胸腔。擠出胸內(nèi)氣體，迅速縫合關(guān)胸。SHAM組穿線不結(jié)扎動脈，余步驟同MI組。兩組術(shù)后均給予正常飼料飲水，兩組小鼠術(shù)后14d后處死并檢測蛋白表達(dá)水平。(2)小鼠心臟組織制備：各組取3只小鼠，MI組取小鼠左心室結(jié)扎線以下組織，Sham組正常摘取心臟，用液氮迅速冰凍并放入-80℃冰箱保存。(3)酶解及肽段定量標(biāo)記：各取200μg樣品分別加入DTT至終濃度為100mM，沸水浴5min，冷卻至室溫，加200μL UA buffer(8M Urea，150mM TrisHCl pH8.0)混勻，轉(zhuǎn)入 10kd超濾離心管，之后進(jìn)行梯度離心。各組樣品肽段分別去約100μg，按照 AB公司試劑盒：iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit(AB SCIEX)說明書進(jìn)行標(biāo)記。

4.質(zhì)譜分析 質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)用軟件Proteome Discoverer 1.3進(jìn)行查庫鑒定及定量分析，采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)用(Proteome Discoverer 1.3，Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)庫為Swissprot_mus庫，采用mascot進(jìn)行檢索，檢索的肽段和譜圖匹配(PSM)，q值＜1%(1%的FDR)。檢索后的肽段利用嚴(yán)格的最大簡約原則合并成蛋白。

5.生物信息學(xué)分析分析 結(jié)果如本研究室前文所述[9］。為了降低物種間蛋白質(zhì)異質(zhì)性，所有差異蛋白首先利用Uniprot比對了人和小鼠中表達(dá)量的差異(www.uniprot.org)，使用AgriGO進(jìn)行g(shù)ene ontology(GO)注釋和富集分析。GO項目描述了蛋白質(zhì)在三個領(lǐng)域中的作用：生物過程，細(xì)胞成分和分子功能。在注釋和注解增加之后，在“Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes”(KEGG，http：//www.genome.p/kegg/)中依次將酶映射到注釋序列和代謝途徑[10］。

6.統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗或采用秩和檢驗。計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.蛋白質(zhì)的鑒定和定量結(jié)果 基于iTRAQ的定量蛋白質(zhì)組學(xué)，本研究解釋了心肌梗死過程中心肌重構(gòu)期差異表達(dá)的蛋白。利用質(zhì)譜技術(shù)，共鑒定了10 324種獨特的肽，對應(yīng)1 551種蛋白質(zhì)。

2.重構(gòu)期心肌梗死蛋白表達(dá)譜 為了篩選與正常對照組有差異的蛋白，我們定義兩組之間差異倍數(shù)＞1.2，或0.8，P＜0.05為差異蛋白，并且同時應(yīng)滿足所選肽鏈＞1、置信區(qū)間＞95%[11］。在鑒定到的蛋白中，MI組/SHAM組共有383個蛋白上調(diào)，有309個蛋白下調(diào)。進(jìn)一步取差異蛋白的交集，我們繪制了上下調(diào)蛋白中前20的顯著差異表達(dá)譜(圖1)。

圖1 前20上下調(diào)蛋白顯著差異表達(dá)譜

3.差異蛋白的生物信息學(xué)分析和信號通路 為研究差異蛋白的總體趨勢和功能學(xué)分類，我們用Gene Ontology(GO)對不同組別的差異表達(dá)蛋白共計692個進(jìn)行了富集分析。差異蛋白的GO分析由生物過程(BP)、細(xì)胞組成(CC)和分子功能(MF)三個部分組成。主要結(jié)果分別呈現(xiàn)在圖2～3中。

在生物過程中，MI組與Sham組相比，差異表達(dá)蛋白中上調(diào)蛋白主要涉及到通路集中在補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)、免疫調(diào)控和炎癥反應(yīng)上(圖2 A)，差異表達(dá)蛋白中下調(diào)蛋白主要涉及葡萄糖代謝、己糖分解代謝及氧化還原反應(yīng)(圖3A)。在細(xì)胞成分上，上調(diào)差異蛋白主要集中在細(xì)胞外區(qū)域及細(xì)胞內(nèi)無膜結(jié)構(gòu)，下調(diào)差異蛋白主要集中在線粒體和肌凝蛋白復(fù)合體等細(xì)胞成分(圖2 B、圖3 B)。在分子功能上，兩組之間的差異表達(dá)蛋白主要涉及在肌動蛋白結(jié)合、細(xì)胞骨架連接、軸因子結(jié)合和運動活性上。

4.差異蛋白所涉及的信號通路研究 為探究所涉及的信號通路，我們采用KEGG分析鑒定了差異蛋白，心肌梗死后14d的心臟組織的蛋白表達(dá)主要涉及的信號通路是免疫反應(yīng)和糖代謝通路。

討 論

急性心肌梗死起病急，恢復(fù)慢且病死率高。在減少心肌壞死的基礎(chǔ)上對心肌梗死后的心臟進(jìn)修復(fù)可有效改善預(yù)后，提高生存質(zhì)量[11］。重構(gòu)期作為心肌梗死后心臟重構(gòu)的關(guān)鍵時期，了解蛋白變化及機制對疾病的干預(yù)治療有重要意義[12］。目前有關(guān)MI研究主要集中在急性期蛋白表達(dá)情況，對于心肌重構(gòu)期蛋白譜的變化研究相對較少。為了探究重構(gòu)期所涉及的蛋白變化，我們運用iTRAQ技術(shù)首次定量檢測心肌梗死重構(gòu)期差異表達(dá)的蛋白，結(jié)合生物信息學(xué)和公共數(shù)據(jù)庫，描繪差異蛋白譜，發(fā)現(xiàn)其中主要涉及的病理過程是免疫反應(yīng)和糖類代謝。

圖2 急性心肌梗死重構(gòu)期差異表達(dá)上調(diào)的蛋白生物信息學(xué)分析 A：SHAM/MI 14天組上調(diào)蛋白生物進(jìn)程分析；B：SHAM/MI 14天組上調(diào)蛋白細(xì)胞成分預(yù)測；C：SHAM/MI 14天組上調(diào)蛋白分子功能預(yù)測；D：SHAM/MI 14天組上調(diào)蛋白信號通路分析

圖3 急性心肌梗死重構(gòu)期差異表達(dá)上調(diào)的蛋白生物信息學(xué)分析 A：SHAM/MI 14天組下調(diào)蛋白生物進(jìn)程分析；B：SHAM/MI 14天組下調(diào)蛋白細(xì)胞成分預(yù)測；C：SHAM/MI 14天組下調(diào)蛋白分子功能預(yù)測；D：SHAM/MI 14天組下調(diào)蛋白信號通路分析

早期研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠心肌梗死模型中，心肌損傷可激活補體級聯(lián)反應(yīng)，富含線粒體的亞細(xì)胞成分釋放觸發(fā)級聯(lián)早期作用成分C1～C4的釋出[13-14］。補體系統(tǒng)在活化過程中產(chǎn)生具有生物活性的蛋白片段，在中期持續(xù)升高會影響心肌梗死的恢復(fù)[12］。C4d、Bb分別是補體的經(jīng)典和替代激活途徑的產(chǎn)物。本項研究中發(fā)現(xiàn)心肌梗死重構(gòu)期補體C5的水平顯著升高，這與既往研究結(jié)果一致。C5b-9組成攻膜復(fù)合物(membrane attack complex，MAC)，具有溶細(xì)胞作用[15］，在AMI患者血漿中MAC升高導(dǎo)致死亡率和心血管事件發(fā)生率升高[16］。既往動物研究中發(fā)現(xiàn)，利用抗-C5補體Pexelizumab輔助治療可減少急性心肌梗塞后再灌注損傷，并在II期臨床研究中證實了在急性冠脈綜合征患者中獲益[17］。此外，國內(nèi)外的研究中也表明采用補體抑制劑抑制補體系統(tǒng)，可有效減輕心肌的缺血性損傷，縮小梗死面積。其次，缺血心肌細(xì)胞在調(diào)節(jié)因子的作用下產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[18］。大量實驗表明熱休克蛋白、ATP、線粒體在心肌受損后刺激炎癥級聯(lián)反應(yīng)，這些危險信號通過刺激Toll樣受體家族成員發(fā)揮抗炎作用[19］。細(xì)胞基質(zhì)蛋白凝血酶敏感蛋白(TSP)-1作為縮血管蛋白，在缺血過程中從內(nèi)皮和心肌細(xì)胞中釋放，促進(jìn)血小板在動脈粥樣硬化病變的內(nèi)皮下層粘附聚集，在心肌缺血過程中，TSP-1通過激活CD47和CD36破壞NO信號通路和VEGF信號通路，干擾局部微循環(huán)，最終導(dǎo)致梗死后的過度纖維化。研究表明，TSP-1在心肌梗死后恢復(fù)有抑制作用[20］。

蛋白和糖代謝正常心臟可以利用多種底物產(chǎn)生能量，如脂肪酸、酮體、葡萄糖等[21］。心肌缺血時，心肌供氧不足，抑制脂肪酸的有氧氧化，無氧糖酵解增加，此時葡萄糖成為心肌主要能量來源[22］。有研究發(fā)現(xiàn)：能量代謝障礙發(fā)生后心肌細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)均受到影響，且心肌細(xì)胞內(nèi)ATP水平與其凋亡壞死密切相關(guān)[23］。在心肌細(xì)胞中，線粒體作為最復(fù)雜的細(xì)胞器之一，承擔(dān)有眾多細(xì)胞功能包括脂肪酸代謝、能量產(chǎn)生和糖代謝等，前人研究證明在MI中心肌細(xì)胞線粒體活性與正常心肌相比下降嚴(yán)重[24］，這也從側(cè)面印證了我們的研究結(jié)果。更為重要的是，既往研究發(fā)現(xiàn)及時糾正代謝異?？梢杂行У販p少MI范圍，我們的研究為進(jìn)一步揭示了糖代謝在心肌梗死重構(gòu)期的作用機制及尋找潛在的干預(yù)靶點提供了組學(xué)數(shù)據(jù)。

本研究首次利用相對定量的方法，探究了與正常心臟相比，心肌梗死14d后小鼠心臟組織蛋白表達(dá)的差異，并結(jié)合生物信息學(xué)，對差異蛋白進(jìn)行了GO分析和通路分析，為探究蛋白表達(dá)水平在急性MI重構(gòu)期的變化以及尋找潛在治療靶點提供了結(jié)果支持。研究仍存在局限，iTRAQ實驗在蛋白定量過程中并不是鑒定到的所有肽段均參與蛋白定量過程，可能在篩選過程中會出現(xiàn)遺漏情況；雖然在公共數(shù)據(jù)庫中比對了人和鼠間差異，但仍做不到全部排除不同物種間異質(zhì)性。

綜上所述，定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可用于組織蛋白鑒定和相對定量，利于更全面的了解蛋白與MI重構(gòu)期的病理變化關(guān)系。本項研究的結(jié)果為探究急性MI重構(gòu)期心臟組織蛋白所涉及的病理過程和潛在的治療靶點提供了新的觀點和證據(jù)。