常洪濤 ， 李永濤 ， 黃慧敏 ， 張 靈 ， 侯曉礁 ， 王秀敏 ， 王川慶 ， 劉慧敏

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002 ； 2.北京市中獸藥工程技術(shù)研究中心 ， 北京 昌平 102206 ；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ， 河南 鄭州 450002)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒引起豬的一種以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和對(duì)哺乳仔豬高致死率為主要臨床特征的腸道傳染病[1]。1978年英國、比利時(shí)首次發(fā)現(xiàn)該病[2]，隨后各主要養(yǎng)豬國家相繼報(bào)道，國內(nèi)于1984年證實(shí)存在,多年來一直嚴(yán)重影響我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[3]。2010年11月至今，以PEDV為主要致病因素的新生仔豬急性腹瀉疫情在全國范圍內(nèi)大暴發(fā)[4-5]，發(fā)病率和死亡率均高達(dá)90%以上，目前仍尚無有效的防控措施，抗生素治療僅能防止繼發(fā)感染[6]。已有研究表明，當(dāng)前PEDV新流行毒株較疫苗毒株CV777相比已發(fā)生較大變異，使得現(xiàn)有商品化疫苗的免疫保護(hù)效果均不理想[7]，同時(shí)新流行毒株卻又難以分離、馴化并加以應(yīng)用。以消毒為核心的生物安全措施是防控動(dòng)物傳染病的最主要措施之一[8]，而選擇理想的消毒劑至關(guān)重要。當(dāng)前在養(yǎng)豬生產(chǎn)中應(yīng)用最為普遍的是醛類、含碘類、過氧化物類和表面活性劑類等化學(xué)消毒劑，它們產(chǎn)生作用迅速，消毒譜廣，對(duì)病原微生物的殺滅作用很強(qiáng)，但都不同程度地存在環(huán)境污染、藥物殘留、具有毒性和刺激性等副作用，并不能完全滿足疫病防控中的消毒需要。與此同時(shí)一些以中藥消毒劑為代表的新型環(huán)保消毒劑的研究逐漸展開和深入。香連溶液是一種純天然植物消毒劑，由黃連、苦參、香薷和艾葉等多味中藥提取、加工精制而成，具有殺滅病原、清新辟穢和解毒消瘡的功效，可用于動(dòng)物體、環(huán)境及飲水消毒。本研究擬選用香連溶液對(duì)PEDV傳播途徑的阻斷效果進(jìn)行探討，以期為有效防控PED提供一種優(yōu)質(zhì)的消毒劑。

1 材料與方法

1.1 消毒劑、疫苗和試驗(yàn)動(dòng)物 香連溶液由北京生泰爾科技股份有限公司提供；過硫酸氫鉀三鹽復(fù)合物消毒劑為江蘇省某生物工程有限公司產(chǎn)品；豬傳染性胃腸炎(TGE)-PED二聯(lián)滅活疫苗由四川某生物制品廠提供。25頭1～3日齡新生仔豬由西平縣某種豬場提供，經(jīng)檢測PED抗體為陰性；135頭臨產(chǎn)母豬由鶴壁市某正在發(fā)生PED疫情的豬場提供；隨機(jī)選擇規(guī)模化豬場、中小型豬場和養(yǎng)豬專業(yè)戶各3個(gè)，每個(gè)豬場選擇20頭待產(chǎn)母豬備用，在其發(fā)生PED疫情時(shí)開展試驗(yàn)。

1.2 病毒、細(xì)胞和檢測相關(guān)試劑 PEDV YM13株由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存；Vero細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)和PEDV RT-PCR檢測[9]的相關(guān)試劑均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室提供；PED抗原快速檢測卡，購自韓國BIONOTE公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 香連溶液對(duì)細(xì)胞安全濃度的測定 將香蓮溶液用DMEM分別稀釋成原液、2倍、5倍、20倍和50倍等5個(gè)稀釋度，分別接入已鋪滿單層Vero細(xì)胞的細(xì)胞板，每個(gè)濃度做2個(gè)重復(fù)，作用30 min觀察，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照。

1.3.2 香連溶液對(duì)PEDV增殖的抑制作用測定 將香連溶液用DMEM分別稀釋成25倍、50倍、500倍和1 000倍后，與YM13株病毒培養(yǎng)液等劑量混勻，使其藥物終濃度分別為50倍、100倍、1 000倍和2 000倍，室溫作用30 min后，再接種Vero細(xì)胞，孵育1 h，3 d后觀察并篩選最佳抑制濃度，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照。

1.3.3 香連溶液對(duì)PEDV感染仔豬的防治試驗(yàn) 將香連溶液作50倍稀釋，YM13株病毒培養(yǎng)液作10-3稀釋后備用。將25頭1～3日齡健康仔豬隨機(jī)分為5組，隔離飼養(yǎng)，具體試驗(yàn)操作見表1。

表1 仔豬分組及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4 香連溶液對(duì)PEDV傳播途徑的阻斷試驗(yàn) 選擇1個(gè)正在發(fā)生PED疫情的規(guī)模化豬場，篩選待產(chǎn)母豬100頭，隨機(jī)分為10組，每組10頭，各組每日的乳頭消毒次數(shù)分別為12、10、8、6、5、4、3、2、1次和0次。同時(shí)篩選10頭設(shè)立為過硫酸氫鉀三鹽復(fù)合物對(duì)照組，消毒次數(shù)為6次/d。各試驗(yàn)組均于分娩后首日應(yīng)用香連溶液進(jìn)行乳頭擦拭消毒，持續(xù)7 d，同時(shí)篩選最佳消毒次數(shù)，并于每次消毒30 min、60 min和120 min后，隨機(jī)選擇母豬乳頭用細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗，用于PEDV的分離和鑒定。再篩選待產(chǎn)母豬25頭，隔離飼養(yǎng)，TGE-PED二聯(lián)滅活疫苗均于產(chǎn)前40 d、20 d各免疫1次，分娩后再按篩選的最佳消毒次數(shù)進(jìn)行乳頭消毒，持續(xù)7 d，具體操作見表2。

表2 母豬分組及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.5 香連溶液對(duì)PEDV傳播途徑阻斷的臨床推廣 隨機(jī)選擇規(guī)?；i場、中小型豬場和養(yǎng)豬專業(yè)戶各3個(gè)，每個(gè)豬場選擇20頭待產(chǎn)母豬，隔離飼養(yǎng)，TGE-PED二聯(lián)滅活疫苗均為產(chǎn)前40、20 d各免疫1次，在其發(fā)生PED疫情時(shí)開展試驗(yàn)。分娩后按篩選的最佳消毒次數(shù)使用香連溶液進(jìn)行乳頭消毒，共持續(xù)7 d，具體操作見表3。

表3 不同規(guī)模豬場的試驗(yàn)分組及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 香連溶液對(duì)Vero細(xì)胞安全濃度的測定結(jié)果 將不同稀釋度的香連溶液分別與Vero細(xì)胞作用30 min后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在原液和2倍稀釋時(shí)均皺縮、貼到底部，5倍稀釋時(shí)整塊漂落，20倍稀釋時(shí)有零星變圓、漂起，50倍稀釋時(shí)為正常狀態(tài)，與空白對(duì)照組相比無明顯區(qū)別(中插彩版圖1)。

2.2 香連溶液抑制病毒作用測定結(jié)果 不同稀釋度的香連溶液分別與YM13株作用后，經(jīng)計(jì)算測定其蝕斑形成單位(PFU/mL)分別為8.4×104、1.96×105、5.36×105和6.0×105，對(duì)照組為6.44×105(中插彩版圖2)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，50倍和100倍稀釋時(shí)對(duì)病毒有明顯的抑制作用，1 000倍稀釋時(shí)抑制作用不明顯，2 000倍稀釋對(duì)病毒增殖基本沒有影響，從而推斷將香連溶液作50～100倍稀釋時(shí)，可有效抑制PEDV的增殖。

2.3 香連溶液對(duì)PEDV感染仔豬的防治試驗(yàn)結(jié)果 3組試驗(yàn)豬分別于3 h、8 h和6 h時(shí)開始嘔吐灰紅色液體，均于24 h時(shí)發(fā)生水瀉，分別于72 h、30 h和36 h時(shí)全部脫水、死亡；過硫酸氫鉀三鹽復(fù)合物組均于6 h時(shí)出現(xiàn)嘔吐，12 h時(shí)發(fā)生腹瀉和脫水，24 h時(shí)全部死亡；空白對(duì)照組均于6 h時(shí)出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和嚴(yán)重脫水，24 h時(shí)全部死亡。所有試驗(yàn)豬經(jīng)RT-PCR和PED抗原快速檢測卡檢測后，均為PEDV陽性(圖3、中插彩版圖4)，證實(shí)通過對(duì)初生仔豬灌服香連溶液和其他消毒劑的措施無法阻止PEDV感染和發(fā)病，但先灌服香連溶液組的病程有所延長。

圖3 PEDV RT-PCR檢測結(jié)果

2.4 傳播途徑阻斷試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)?zāi)肛i均于分娩后首日應(yīng)用香連溶液進(jìn)行乳頭擦拭消毒試驗(yàn)，共持續(xù)7 d。結(jié)果表明，各組的發(fā)病率依次為25.0%、26.3%、28.3%、29.2%、48.7%、57.5%、61.8%、87.5%、93.2%和99.5%，過硫酸氫鉀三鹽復(fù)合物組的發(fā)病率為68.3%，表明每日使用香連溶液進(jìn)行6次以上乳頭消毒時(shí)，發(fā)病率均維持在30%以內(nèi)，且差異不顯著(P>0.05)，隨著消毒次數(shù)逐步減少，發(fā)病率也隨之大幅提高，因此，最佳消毒次數(shù)篩選為6次/d。各試驗(yàn)組于每次消毒30 min和60 min后，均未分離到PEDV(中插彩版圖5)，消毒120 min后，均可分離到PEDV(中插彩版圖6)，RT-PCR檢測結(jié)果全部為陽性(圖8)。過硫酸氫鉀三鹽復(fù)合物組于每次消毒30 min后均未分離到PEDV，60 min后均能分離到PEDV(中插彩版圖7)，RT-PCR檢測結(jié)果全部為陽性(圖8)。免疫疫苗同時(shí)配合乳頭消毒試驗(yàn)組的發(fā)病率最低，為2.8%，只免疫疫苗未進(jìn)行乳頭消毒試驗(yàn)組為11.4%，未免疫疫苗只進(jìn)行乳頭消毒試驗(yàn)組為29.1%，過硫酸氫鉀三鹽復(fù)合物和空白對(duì)照組分別為66.7%和97.3%。

2.5 臨床推廣結(jié)果 不同規(guī)模豬場的各組母豬均于分娩后首日使用香連溶液進(jìn)行乳頭擦拭消毒試驗(yàn)，持續(xù)7 d。結(jié)果表明，規(guī)模化豬場、中小型豬場與養(yǎng)豬專業(yè)戶免疫疫苗組和未免疫疫苗組的平均發(fā)病率分別為8.2%和29.2%、5.7%和27.6%、4.1%和26.3%。

圖8 PEDV RT-PCR檢測結(jié)果

3 討論

動(dòng)物傳染病必須同時(shí)具備傳染源、傳播途徑和易感動(dòng)物等3個(gè)基本環(huán)節(jié)，方能構(gòu)成流行[10]。PEDV感染后以7日齡內(nèi)仔豬死亡率最高，隨年齡增加逐步降低，應(yīng)及時(shí)淘汰發(fā)病仔豬，清除傳染源。當(dāng)前PEDV流行毒株的變異使得商品化疫苗無法產(chǎn)生有效保護(hù)，“返飼”具有一定臨床效果，但存在嚴(yán)重散毒風(fēng)險(xiǎn)，因此僅依賴疫苗免疫來保護(hù)易感豬的策略在較長一段時(shí)間內(nèi)難以實(shí)現(xiàn)。將吮乳仔豬寄養(yǎng)給健康母豬或人工哺乳，發(fā)病率和死亡率均顯著降低，說明通過技術(shù)隔離切斷其傳播途徑，可有效降低PED的臨床危害[11]。由于PEDV的抵抗力較弱，2%氫氧化鈉、1%福爾馬林和1%碘仿等傳統(tǒng)消毒劑都可將其殺滅，但均具有作用時(shí)間短和對(duì)皮膚及黏膜有強(qiáng)刺激性等缺點(diǎn)。香連溶液則是一種純天然中藥消毒劑，具有較強(qiáng)的抗病原體作用，且氣味清香，刺激性小、無毒和無腐蝕作用。本試驗(yàn)中，將香連溶液作50倍稀釋時(shí)，對(duì)Vero細(xì)胞的生長沒有明顯影響，提示對(duì)母豬使用時(shí)較為安全，50～100倍稀釋時(shí)，對(duì)PEDV有明顯的抑制作用，因此建議在豬場進(jìn)行消毒時(shí)，可將香連溶液作50～100倍稀釋后使用。對(duì)初生仔豬灌服香連溶液和其他消毒劑后，全部發(fā)病死亡，證實(shí)該措施無法阻止PEDV感染，其原因應(yīng)為PEDV的感染劑量極低，但先灌服香連溶液后可使其病程有所延長，也有力的佐證了香連溶液可抑制PEDV增殖這一結(jié)論。

母豬乳房的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使其形成明顯的“定期放乳”這一獨(dú)特泌乳方式[12]，在產(chǎn)后最初幾天內(nèi)，一晝夜放乳次數(shù)約為24～25次。PEDV隨病豬和帶毒豬的糞便排出，主要污染母豬乳頭通過“糞-口途徑”感染[13]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)香連溶液的消毒時(shí)效性為2 h內(nèi)，應(yīng)為每晝夜消毒12次，但工作量巨大，產(chǎn)房護(hù)理人員難以承受。鑒于此，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，每晝夜消毒6次，同時(shí)通過及時(shí)清除糞便和產(chǎn)床噴霧消毒5～6次，可使PED的發(fā)病率控制至30%以內(nèi)。另外，免疫疫苗同時(shí)配合乳頭消毒試驗(yàn)組的發(fā)病率僅為2.8%，提示該模式是當(dāng)前國內(nèi)豬場有效防控PEDV感染的最有效措施。臨床推廣試驗(yàn)結(jié)果表明，不同規(guī)模的豬場應(yīng)用該模式均可有效阻斷PEDV的大面積感染，其中，規(guī)?；i場和中小型豬場平均發(fā)病率均略高于養(yǎng)豬專業(yè)戶，這應(yīng)與后者多為家庭式豬場，操作者責(zé)任心較強(qiáng)，乳頭消毒措施實(shí)施到位有一定關(guān)系。

綜上所述，本研究所構(gòu)建的“母豬產(chǎn)前免疫PED疫苗配合產(chǎn)后使用香連溶液擦拭乳頭消毒”模式不僅可以有效阻斷PEDV的大面積感染，降低發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，提高豬場經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)有利于我國綠色食品的發(fā)展，逐漸杜絕含抗生素和化學(xué)消毒劑殘留的食品上市銷售，并可進(jìn)一步擴(kuò)大其技術(shù)應(yīng)用范圍，為豬腹瀉性疫病的綜合防控工作探索出一條行之有效的技術(shù)思路。

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