馬 田，郭 妍，蘆 娟，趙瑞利，LIM ANNA，石學(xué)敏，郭長(zhǎng)青*

（ 1.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

原發(fā)性高血壓?。‥H）的主要臨床表現(xiàn)為血壓升高，常伴發(fā)心、腦、腎等靶器官功能性和（或）器質(zhì)性病變[1]，近年來其患病率、致殘率、致死率居高不下，且絕對(duì)和相對(duì)發(fā)病率均有增多的趨勢(shì)[2]。EH的發(fā)生發(fā)展過程中靶器官損害的共同病理學(xué)基礎(chǔ)——血管重構(gòu)（VR）起著至關(guān)重要的作用。 VR既是高血壓重要的病理變化，又是高血壓維持、惡化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，隨著學(xué)者對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路（ECM-receptor interaction pathway）研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在高血壓血管重構(gòu)中起到十分重要的作用[3]。作為公認(rèn)的與人類EH最相似的動(dòng)物模型，自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）在目前EH實(shí)驗(yàn)研究中最為常用[4-5]。心血管系統(tǒng)疾病屬于與多基因位點(diǎn)變異和表達(dá)異常有關(guān)的復(fù)雜性疾病，傳統(tǒng)的單因素檢測(cè)方法已不能滿足研究需求，需要更先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)對(duì)心血管系統(tǒng)疾病的研究[6]。基因芯片技術(shù)可一次性平行分析數(shù)以萬計(jì)個(gè)基因mRNA表達(dá)情況，同時(shí)可檢測(cè)到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中多個(gè)節(jié)點(diǎn)的基因的信息表達(dá)，可更好地滿足心血管系統(tǒng)疾病研究的需求[7-9]。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 SHR 20只，Wistar Kyoto（WKY）大鼠10只，清潔級(jí)，雄性9周齡，體質(zhì)量180～200 g，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)： SCXK（京）200223。用筆在SHR尾部標(biāo)記序號(hào)，并按照 EXCEL 隨機(jī)數(shù)字表法將20只SHR隨機(jī)分為模型組、人迎組，每組10只；10只WKY大鼠作為空白組。

1.2 器材與儀器 器材：中研太和牌一次性無菌針灸針：0.16 mm × 7 mm（ 購自北京中研太和醫(yī)療器械有限公司）；手術(shù)器械、凝膠促凝管（ 購自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）；凍存管（購自北京康暉煜科技有限公司）；EP 管(購自北京健力園醫(yī)療器械有限公司）。儀器： 小動(dòng)物斷頭器（購自北京碩林苑科技有限公司），動(dòng)物無創(chuàng)血壓儀（型號(hào)：BP - 6）、電子天平（型號(hào)： ER - 182A）。

1.3 針刺穴位選取 針刺“人迎穴”?！秾?shí)驗(yàn)針灸學(xué)》教材取穴：在頸部三角區(qū)內(nèi)，當(dāng)胸骨舌骨肌與胸鎖乳突肌上緣交點(diǎn)，約為頸總動(dòng)脈分叉處，體表可觸及搏動(dòng)。參照文獻(xiàn)[10]取大鼠頸前兩側(cè)下頜骨隅突連線下8 mm，前正中線旁開3.5 mm。

1.4 針刺操作 人迎組：將大鼠束縛于自制鼠套中，露出頸部，以右手為刺手，取雙側(cè)“人迎穴”，針灸針直刺 4～5 mm。刺入后以針體微微顫動(dòng)為準(zhǔn)，行捻轉(zhuǎn)平補(bǔ)平瀉法1 min，留針19 min。每天中午12:00治療1次，每針刺6 d休息1 d，共針刺4周，所有針剌操作均由同1人完成。模型組與空白組：將大鼠束縛于自制鼠套內(nèi)20 min，不做任何干預(yù)。

1.5 血壓測(cè)量 在針刺干預(yù)第1、5、9、13、 17、21、25、28天測(cè)量各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓。每只大鼠測(cè)量3次并取平均值；動(dòng)作輕柔避免激惹引起大鼠的血壓波動(dòng)；加溫時(shí)間要控制在15 min以內(nèi)，避免高溫導(dǎo)致大鼠死亡；鼠套和尾套尺寸合適，周圍無噪聲，環(huán)境溫度恒定。應(yīng)用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。各組間差異采用單因素方差分析。P ＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 實(shí)驗(yàn)取材 各組大鼠麻醉狀態(tài)下立即處死并取材，取主動(dòng)脈弓處約2～3 mm主動(dòng)脈一段，將殘留的結(jié)締組織剝離干凈，漂洗后用濾紙吸干水分放入凍存管，將凍存管放入液氮中于- 80 ℃冰箱保存。

1.7 基因芯片檢測(cè) 將空白組、模型組和人迎組全部主動(dòng)脈弓樣本各取出100 mg，研磨均勻成粉末狀，提取總RNA；使用NanoDrop 1 000核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定總RNA濃度，使用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性；按照以下步驟制備基因芯片表達(dá)譜：制備Poly-A RNA質(zhì)控，合成第一鏈cDNA和第二鏈cDNA，再合成cRNA的體外逆轉(zhuǎn)錄，對(duì)cRNA進(jìn)行純化，隨后合成第二輪單鏈cDNA，使用RNaseH水解RNA，純化第二輪單鏈cDNA并片段化和標(biāo)記單鏈cDNA；按照以下步驟進(jìn)行芯片雜交：制備雜交反應(yīng)混合液，添加雜交反應(yīng)混合液到片段化與祿記后的單鏈cDNA，進(jìn)行雜交芯片注入；芯片雜交后進(jìn)行洗染，洗染結(jié)束后，檢查芯片表面玻璃有無氣泡，灰塵等，仔細(xì)擦拭芯片表面，然后使用Affymetrix Gene Chip 7G microarray scanner掃描芯片。

將掃描的CEL格式圖像輸入到Affymetrix Expression console software，對(duì)基因芯片圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用Robust Multichip Average 計(jì)算方法對(duì)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理之后，用熒光共聚焦顯微鏡掃讀結(jié)果進(jìn)行比較分析，得到各組基因的熒光信號(hào)強(qiáng)度，由于正確堿基互補(bǔ)雙鏈具有較高的熱力學(xué)穩(wěn)定性，因此，探針與樣品分子在某位點(diǎn)配對(duì)有差異時(shí)該位點(diǎn)的熒光強(qiáng)度就會(huì)有所不同。將空白組與模型組的基因的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較，將模型組與人迎組的基因的熒光信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較，并用Transcriptome Analysis console對(duì)比較的比值進(jìn)行分析，判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)及篩選出樣本之間的差異表達(dá)基因：兩個(gè)基因比值的fold change≥ 1.5為表達(dá)上調(diào)，fold change≤-1.5為表達(dá)下調(diào)，-1.5～1.5之間為不存在顯著表達(dá)差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓比較 28 d后，模型組大鼠收縮壓由（165.5±14）mmHg上 升 至（187.6±1） mmHg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與空白組相比，人迎組大鼠收縮壓在針刺第1、5、9、13、17、21、25、28天均呈上升趨勢(shì)（P＜0.01）；與模型組相比，人迎組大鼠收縮壓第9天（P＜0.01）和13、17、21、25、28天（P＜0.05） 明顯下降（P＜0.05），說明針刺人迎穴對(duì)于降低SHR的血壓具有較好的短期效應(yīng)。見圖1。

圖1 各組大鼠收縮壓測(cè)量值

2.2 基因芯片篩查結(jié)果 模型組和空白組比較： 452個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，245個(gè)基因表達(dá)下調(diào)； 針刺干預(yù)后人迎組和模型組比較： 261個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，986個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，有 102個(gè)基因在模型組和人迎組均發(fā)生顯著性表達(dá)差異，其中有86個(gè)基因表達(dá)在模型組中升高，在人迎組中降低，有16個(gè)基因表達(dá)在模型組中降低，在人迎組中升高（Fold Change≥ 1.5或≤-1.5，P＜0.05）。

2.3 KEGG信號(hào)通路分析 如表1所示：與空白組相比，模型組有12條通路被激活，與模型組相比較，人迎組有10條通路被激活（P＜0.05）。其中細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路（ECM-receptor interaction）中，有12個(gè)基因在模型組VS空白組、人迎組VS模型組都出現(xiàn)差異性表達(dá)，分別為：LAMA2, CD36, LAMC3,LAMA5, COL2A1, ITGA3, LAMC1, LAMB1, SV2C,COL5A2, FN1, SPP1；且在模型組VS空白組皆表達(dá)上調(diào)，在人迎組VS模型組皆表達(dá)下調(diào)（Fold Change≥ 1.5或≤-1.5，P＜0.05）。

表1 KEGG信號(hào)通路分析顯示的被激活通路

3 討論

本實(shí)驗(yàn)顯示，針刺人迎穴能明顯地降低SHR的血壓。人迎穴屬足陽明胃經(jīng)穴，“氣?！彼鲋T戶，多條經(jīng)脈經(jīng)氣相通，有通達(dá)氣血之功[11]。根據(jù)人迎穴定位來分析，組織深部的頸動(dòng)脈竇及相關(guān)神經(jīng)、血管為降壓效應(yīng)的重要結(jié)構(gòu)。其壓力感受器接受刺激后傳入中樞，傳出作用于相應(yīng)效應(yīng)器，而產(chǎn)生降壓效果[12-13]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)出大鼠在針刺干預(yù)前后主動(dòng)脈弓基因表達(dá)的差異，提示針刺人迎穴可能通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)而產(chǎn)生降壓作用。

研究[14]表明，高血壓狀態(tài)下的VSMCs增殖—凋亡平衡失調(diào)是高血壓血管重構(gòu)的中心環(huán)節(jié)之一。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒MVS空白組轉(zhuǎn)錄翻譯LN與 FN的基因表達(dá)均上調(diào)，人迎組VS模型組的相同基因的表達(dá)均下調(diào)，提示針刺人迎穴可能通過調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路，抑制LAMA2、LAMC3、LAMA5、LAMC1、LAMB1、Fn1等基因的表達(dá)，減少LN、 FN的生成，改善主動(dòng)脈血管重構(gòu)，從而降低SHR大鼠的收縮壓和舒張壓。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光分析，以進(jìn)一步驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以及明確針刺人迎穴對(duì)于高血壓血管重構(gòu)的相關(guān)機(jī)制。

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