沈凱凱綜述，呂鏜烽審校

0 引 言

肺癌作為當(dāng)今世界中高度致死性的惡性腫瘤，盡管人們對(duì)生物醫(yī)學(xué)知識(shí)的認(rèn)識(shí)日益增加，但晚期肺癌患者的臨床預(yù)后仍然不盡人意，其五年生存率低于15%[1-2]。事實(shí)上，腫瘤患者的生存率從早期到晚期在急劇下降。在一些肺癌患者中，往往由于腫瘤組織的可及性及其低表達(dá)的狀態(tài)而導(dǎo)致其診斷的延誤[3-4]。

液體活檢技術(shù)是一種微創(chuàng)的檢測方法，可以檢測腫瘤患者外周血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCS)和腫瘤衍生核酸，如循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumour DNA,ctDNA)和miRNAs。最近有研究表明細(xì)胞外囊泡和腫瘤起源的血小板也可作為替代腫瘤細(xì)胞來源的遺傳物質(zhì)，尤其是細(xì)胞外分泌的囊泡(extracellular vesicles,EVS)，被命名為外泌體，其在腫瘤的診斷和監(jiān)測治療效果中發(fā)揮著潛在的巨大潛力[5-6]。外泌體是細(xì)胞起源的一種囊泡，包括眾多分子，如核酸(DNA,RNA,mRNA和miRNA)、脂類和蛋白質(zhì)[7]。目前越來越多的證據(jù)表明，外泌體可在細(xì)胞間傳遞DNA、RNA和蛋白質(zhì)調(diào)控許多生理和病理過程的發(fā)生和發(fā)展，其中包括著肺癌。外泌體內(nèi)部含有免受酶類的降解的細(xì)胞分子，以及其單純的腫瘤來源，目前被發(fā)現(xiàn)廣泛存在各種體液中。因此這些特有的功能，使其作為治療藥物的載體和理想的生物標(biāo)志物，為臨床應(yīng)用和在納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域開辟了新的視角[8]。

1 外泌體的概述

活細(xì)胞釋放不同類型細(xì)胞外囊泡進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境進(jìn)行細(xì)胞間通訊，根據(jù)其生物學(xué)表型主要分為3種類型的細(xì)胞外囊泡：微泡、凋亡小體和外泌體。微泡是由直接向外的細(xì)胞膜出芽形成，凋亡小體是由凋亡細(xì)胞膜裂解的碎片形成，而外泌體最初則起源于細(xì)胞的內(nèi)吞過程[9]。

外泌體最早可追溯到1983年，由Johnstone等[10]在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞分化形成成熟紅細(xì)胞的過程中提出，成熟的紅細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)含有大量的膜泡，大小均勻，直徑均在40～100 nm，參與網(wǎng)織紅細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的移除，提示這些膜泡在紅細(xì)胞成熟過程的潛在作用，并于1987年在超速離心下正式獲得到這種囊泡，命名為外泌體。生理和病理狀況下幾乎任何細(xì)胞都可以以胞吐的方式分泌外泌體，并且其廣泛分布在尿液、唾液、羊水、血液、乳汁、精液、腦脊液以及病理性的腹水等各種體液中，同時(shí)由于外泌體與親代細(xì)胞的同源性，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體有望作為一種全新的非侵入性檢查替代以往的組織活檢技術(shù)[11-12]。

外泌體組成成分多而復(fù)雜，其內(nèi)部含有眾多的生物學(xué)大分子物質(zhì)，如單鏈RNA、長非編碼RNA、微小RNA(microRNA，miRNA)、蛋白質(zhì)以及脂類。據(jù)統(tǒng)計(jì)，已確定有1100種脂質(zhì)、19000種mRNA和2838種miRNA存在于不同組織和細(xì)胞來源的外泌體中。最近雙鏈DNA也被發(fā)現(xiàn)存在其內(nèi)部，從而使外泌體作為一種全新的診斷工具應(yīng)用于液體活檢中[13]。此外，Valadi等[14]首次闡述了miRNA存在于外泌體，而且miRNAs作為短單鏈和非編碼RNA分子，調(diào)節(jié)致癌基因或抑癌基因的表達(dá)功能，參與著細(xì)胞分化，細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。與此同時(shí)，外泌體可通過旁分泌的方式由臨近細(xì)胞捕獲或者分泌到血液中從而流向遠(yuǎn)處的器官，內(nèi)部攜帶的蛋白質(zhì)和核酸也隨著外泌體的流動(dòng)到達(dá)臨近和遠(yuǎn)處細(xì)胞，從而對(duì)受體細(xì)胞產(chǎn)生生理或病理性的影響[7]。

由于外泌體領(lǐng)域關(guān)注度日益上升，因此從體液或細(xì)胞上清液中分離出外泌體刻不容緩。目前分離外泌體的方法有3種：物理方法(差速離心法、超濾法、分子排阻色譜法)，化學(xué)方法(聚合物沉淀法)以及生物方法(免疫親合法)[15]。目前分離外泌體的金標(biāo)準(zhǔn)仍為超速離心法。

2 外泌體與肺癌

腫瘤細(xì)胞常通過外泌體與細(xì)胞外環(huán)境及遠(yuǎn)處細(xì)胞相互溝通，這與腫瘤的增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。首個(gè)關(guān)于外泌體與肺癌關(guān)系的研究可以追溯到2004年，Hegmans等[17]在研究肺腺癌和間皮瘤患者的胸腔積液中外泌體蛋白組學(xué)表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子、熱休克蛋白以及沒有在外泌體中檢測到的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)分子包括色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)、B細(xì)胞易位基因1(B cell translocation gene 1, BTG1) 以及排序連接蛋白(sorting-nexin protein, SNX)，其研究發(fā)現(xiàn)PEDF、BTG1與細(xì)胞生長有關(guān)，而SNX則與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)的內(nèi)化相關(guān)，該發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明外泌體在肺癌發(fā)展過程中的潛在作用。與此同時(shí)，外泌體中表達(dá)的異常蛋白質(zhì)與原始腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出高度一致性，這些異常蛋白質(zhì)包括EGFR、K-ras、claudins以及其他蛋白質(zhì)[18]。最近ALK-EML4易位也被發(fā)現(xiàn)在外泌體中[19]。 Al-Nedaw等[20]研究表明外泌體攜帶EGFR能夠與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，從而激活MAPK和Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)與腫瘤血管的擴(kuò)張。Rahman等[21]研究表明，從高轉(zhuǎn)移人肺癌細(xì)胞株和肺癌患者血清中分離的外泌體可以促進(jìn)人支氣管上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而進(jìn)一步增加其遷移、侵襲和增殖。進(jìn)一步闡明外泌體在肺癌轉(zhuǎn)移和傳播過程的重要作用。

2.1外泌體miRNAs在肺癌中的作用目前非編碼RNA(non-coding RNAs, ncRNA)被普遍發(fā)現(xiàn)存在非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者外泌體中，參與腫瘤的形成和演化過程，在NSCLC患者的診斷和預(yù)后發(fā)揮著重大作用[22-23]。

2.1.1外泌體miRNAs在肺癌診斷中的應(yīng)用由于低劑量CT(low-dose computed tomography,LDCT)的普及，使得早期肺癌在高危人群的篩查取得了一定的成就，然而目前仍缺乏早期篩查的精準(zhǔn)手段，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期階段[24]。目前借助二代測序(Next Generation Sequencing,NGS)和基因芯片等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源的外泌體miRNA對(duì)NSCLC的診斷存在重大價(jià)值。Rabinowits等[25]首次把外泌體作為遺傳物質(zhì)，分析了正常人血清中外泌體miRNA與NSCLC患者血清中miRNA的差異，這項(xiàng)研究雖然在兩者中并未發(fā)現(xiàn)有明顯的差異，但為以后研究從腫瘤分子水平的鑒定奠定了基礎(chǔ)。Cazzoli等[26]在肺腺癌患者的外周血液中發(fā)現(xiàn)miR-378、miR-502-5p、miR-629、miR-200b-5p和miR-100水平較肺部肉芽腫和健康患者明顯升高。有研究發(fā)現(xiàn)血液中hsa-miR-21的水平在早期鱗癌患者中顯著上調(diào)[27]。此外，Carina 等[28]發(fā)現(xiàn)血液中低水平miR-625和miR-361-3p有助于在肺部良性病變中識(shí)別惡性腫瘤，而且Rodríguez等[29]也觀察到肺癌患者外周血液外泌體miR-122-5p水平顯著高于非腫瘤患者水平。以上各項(xiàng)研究說明腫瘤細(xì)胞來源外泌體miRNA在NSCLC診斷發(fā)揮著重大價(jià)值，為探索肺癌早期診斷的分子標(biāo)記物提供理論依據(jù)。

2.1.2外泌體miRNAs在肺癌預(yù)后中的應(yīng)用晚期肺癌的預(yù)后一直是患者和醫(yī)務(wù)人員所共同關(guān)心的問題，目前一些外泌體miRNA已被確定為影響預(yù)后的可能生物標(biāo)志物。通過miRNA表達(dá)芯片方法發(fā)現(xiàn)NSCLC中外泌體miRNA表達(dá)譜和正常組織存在顯著差異，其中一些miRNA表達(dá)下調(diào)，一些則表達(dá)上調(diào)。

Silva等[30]利用TaqMan低密度芯片的方法系統(tǒng)分析了28位NSCLC患者體內(nèi)的365種miRNA，其中外泌體中l(wèi)et-7f、miR-30e-3p和miR-20b表達(dá)均下調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)let-7f和miR-30e-3p水平可區(qū)分早期和晚期NSCLC患者，高水平let-7f和miR-30e-3p與不良預(yù)后密切相關(guān)，同時(shí)研究者指出在晚期肺癌患者以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血漿中miR-20b水平較高。Rolfo等[31]在研究NSCLC患者和正常人血清中外泌體時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-30b和miR-30c水平升高與EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)，可進(jìn)一步用來指導(dǎo)靶向藥物治療的敏感性，同時(shí)miR-221-3p和miR-222-3p過度表達(dá)的患者都與其EGFR突變狀態(tài)相關(guān)，在應(yīng)用AZD9291治療的過程中都取得了良好的效果[32]。miRNA-373和miRNA-512在腫瘤中處于沉默狀態(tài)，因此也被稱之為腫瘤抑制miRNA，其激活狀態(tài)可以對(duì)腫瘤的生長和侵襲產(chǎn)生抑制作用，研究表明這兩種miRNAs水平的下調(diào)與NSCLC患者不良預(yù)后相關(guān)[33]。也有研究指出缺氧狀態(tài)下肺癌細(xì)胞分泌的外泌體miR-23a水平與腫瘤血管形成及血管通透性密切相關(guān)，因此促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[34]。與此同時(shí)Cui等[35]也發(fā)現(xiàn)肺腺癌細(xì)胞分泌含有miR-210外泌體可調(diào)節(jié)酪氨酸受體激酶A3水平，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤血管生成，與NSCLC患者不良預(yù)后相關(guān)。同時(shí)體外研究也發(fā)現(xiàn)外泌體miR-181c通過下調(diào)3-磷酸肌醇依懶性蛋白激酶1，進(jìn)一步降解絲切蛋白磷酸化水平的下降，導(dǎo)致活性絲切蛋白誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白的下調(diào)，同時(shí)miR-105促使血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白-1水平下調(diào)，改變血腦屏障的通透性，從而促進(jìn)肺癌患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，大大縮減NSCLC患者生存率[36-37]。miR-29a-3p和miR-150-5p的含量隨著放射治療劑量的增加而降低，因此被認(rèn)為是一種與放療劑量相關(guān)的可重復(fù)循環(huán)的生物標(biāo)記物[38]。在另一些研究中指出miR-208a和miR-1246可以通過分別與其靶點(diǎn)p21和DR5相結(jié)合，從而促進(jìn)腫瘤的生長以及對(duì)放療產(chǎn)生耐受，與此同時(shí) miR-302b也被發(fā)現(xiàn)與其靶點(diǎn)mRNA 轉(zhuǎn)化生長因子-βRII相結(jié)合從而抑制腫瘤細(xì)胞的增值和轉(zhuǎn)移[39-41]。以上研究表明，腫瘤起源外泌體miRNAs，作為潛在的生物標(biāo)記物，可能在晚期NSCLC患者的預(yù)后發(fā)揮出重大的研究價(jià)值。

2.2外泌體作為肺癌藥物治療的轉(zhuǎn)運(yùn)體化療仍然作為晚期不伴有靶向基因突變的NSCLC患者的首選治療方法，因此發(fā)現(xiàn)全新的治療方法則刻不容緩。由于幾乎所有類型的細(xì)胞以及所有的體液中都普遍存在著外泌體，而且自然的分泌蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、miRNA和DNA作用其靶細(xì)胞，因此其有可能作為一種潛在的藥物輸送系統(tǒng)。目前藥物輸送系統(tǒng)眾多，比如脂質(zhì)體和納米顆粒，但其缺點(diǎn)不一[42]。外泌體作為一種全新的藥物輸送系統(tǒng)，相比于其他的藥物輸送系統(tǒng)有以下眾多優(yōu)點(diǎn)：①低免疫原性和低毒性；②廣泛分布于各種體液之中；③相比于納米顆粒藥物輸送系統(tǒng)無誘變性；④能穿透細(xì)胞膜(包括血腦屏障)以及由于天然脂質(zhì)雙分子層的存在可以攜帶各種物質(zhì)作用于靶細(xì)胞；⑤可以通過基因工程改變其表面的肽類及配體使其被特定的靶細(xì)胞吸收。目前外泌體可作為眾多生物分子的運(yùn)載體，其中包括蛋白質(zhì)、膜受體以及核酸等，與此同時(shí)其內(nèi)部富含的遺傳物質(zhì)可與外泌體同時(shí)進(jìn)行生物合成及表達(dá)[43-44]。雖然外泌體作為藥物載體的出現(xiàn)相對(duì)于合成的生物載體更有利，但在肺癌的治療中其療效仍然處于未知狀態(tài)。

2.3外泌體作為預(yù)防肺癌的疫苗研究表明樹突狀細(xì)胞起源的外泌體(dendritic-cell-derived exosomes, DEX)、腫瘤細(xì)胞起源的外泌體(tumor-cell-derived exosomes, TEX)以及腹水細(xì)胞來源的外泌體(ascitic-cell-derived exosomes, AEX)有可能為肺癌的疫苗研制帶來曙光。其中DEX可通過增強(qiáng)抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)、抑制癌細(xì)胞增殖以及根除腫瘤細(xì)胞從而增強(qiáng)肺癌患者免疫系統(tǒng)的反應(yīng)[45-46]。目前已有兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)在評(píng)估DEX是否有希望成為肺癌患者的疫苗。第一階段的臨床試驗(yàn)可追溯到2005年，該研究利用含有腫瘤抗原自體移植的DEX治療晚期肺癌患者，并且評(píng)估其安全性、可行性以及有效性。研究表明雖然DEX治療的患者耐受性以及病情穩(wěn)定性良好，但在9例患者中只有3例患者其特異性抗原T細(xì)胞活性輕微增加[47]。與此同時(shí)，第二階段的臨床評(píng)估是在先前實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上增強(qiáng)DEX誘導(dǎo)的有限的T細(xì)胞反應(yīng)，這時(shí)發(fā)現(xiàn)晚期肺癌的患者在化療后接受 IFN-γ-DEX治療后并未發(fā)生病情進(jìn)展。由于與之前預(yù)期的50%相比只有32%的患者在治療結(jié)束后4個(gè)月病情處于穩(wěn)定狀態(tài)，而且這時(shí)并沒有發(fā)現(xiàn)存在特異性抗原T細(xì)胞的活化，因此推測患者的無進(jìn)展生存期的延長與NK細(xì)胞的活化有關(guān)，這一現(xiàn)象主要在NKp30缺失的一小部分患者中出現(xiàn)[48]。

另外在肺癌的治療當(dāng)中，外泌體(包括DEX)作為抗原提呈系統(tǒng)中一種強(qiáng)有力的工具，盡管在接種了第二代DEX的患者中，有一些患者表現(xiàn)出了對(duì)DEX良好的耐受以及促進(jìn)NK細(xì)胞的活性，但對(duì)這方面的臨床研究仍然十分有限，而且結(jié)果不盡人意。因此仍然需要進(jìn)行大量的臨床試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證外泌體作為肺癌疫苗的療效。

3 結(jié) 語

肺癌患者的診斷、預(yù)后和分子標(biāo)記物的檢測聯(lián)系越來越密切，同時(shí)液體活檢也作為目前肺癌患者的篩查、診斷以及檢測治療效果最有前景的檢測手段越來越受到重視。由于外泌體可作為生物遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定來源，有可能為以后肺癌患者的診斷以及預(yù)后帶來潛在的價(jià)值。當(dāng)腫瘤組織活檢比較困難的情況下，可以從患者血漿中分離出外泌體，檢測其表面分子的突變狀態(tài)(如EGFR)，為肺癌的篩檢開辟了新的視角。而且其含有的特定的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)也可作為其臨床預(yù)后的特定工具。最近發(fā)現(xiàn)外泌體miRNAs可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，因此對(duì)其的研究備受矚目。同時(shí)研究表明外泌體miRNAs可以反映原始細(xì)胞的狀態(tài)，從而能夠區(qū)分出健康和肺癌患者，為肺癌患者的臨床預(yù)后和治療帶來了曙光。然而目前大多數(shù)開展的關(guān)于外泌體的研究是在少數(shù)患者中進(jìn)行的，而且有的尚不可重復(fù)進(jìn)行。關(guān)于外泌體的研究是否真的可以使肺癌患者受益，目前尚存在爭議，需要開展更多有關(guān)外泌體的來源、合成以及生物學(xué)功能的研究來進(jìn)一步推動(dòng)其向臨床方向的轉(zhuǎn)化和應(yīng)用。

目前外泌體神秘面紗正一步一步的被揭開。首先外泌體作為一種遺傳物質(zhì)型的囊泡，相比于其他的循環(huán)物質(zhì)在肺癌的診斷和預(yù)后中應(yīng)用前景更廣；其次作為藥物的載體，為晚期肺癌患者提供了一種新興藥物治療策略，相信在不久的將來外泌體一定會(huì)為肺癌患者帶來新的曙光。