楊宏艷　馬淑麗　李清漪　都曉輝　韓云峰　孫輯凱　包亞男

【摘要】 目的：探討SIRT1/LC3自噬通路在五味子酚（Schisanhenol，Sal）抗H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖活力下降中的作用。方法：加入不同濃度Sal（50、10 μmol/L）處理SH-SY5Y細(xì)胞4 h后，再加入H2O2 100 μmol/L處理12 h，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，Western blot檢測(cè)SIRT1蛋白和自噬蛋白標(biāo)志物（LC3蛋白、Beclin-1蛋白）的表達(dá)水平。結(jié)果：H2O2組細(xì)胞增殖活力較對(duì)照組顯著下降（P<0.001）；Sal組不同濃度（50、10 μmol/L）干預(yù)后的細(xì)胞增殖活力均高于H2O2組（P=0.001、0.017），且隨著Sal濃度增加，細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)。H2O2組SIRT1蛋白含量較對(duì)照組明顯降低（P<0.001），Sal組不同濃度（50、10 μmol/L）的SIRT1蛋白含量均明顯高于H2O2組（P=0.001、0.014）。H2O2組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；Sal組（50 μmol/L）的Beclin-1的蛋白表達(dá)低于H2O2組，且不同濃度（50、10 μmol/L）LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)均低于H2O2組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：Sal可通過(guò)上調(diào)SIRT1蛋白表達(dá)，拮抗H2O2引起的過(guò)度自噬，從而起到拮抗H2O2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】 五味子酚； SIRT1； 過(guò)氧化氫； LC3

Study on the Inhibitory Effect of Schisanhenol Up-regulated SIRT1 Improve H2O2 on the Proliferation of SH-SY5Y Cells/YANG Hongyan，MA Shuli，LI Qingyi，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（06）：032-035

【Abstract】 Objective：To investigate the role of SIRT1/LC3 autophagy pathway in the decrease of proliferation activity of SH-SY5Y cells induced by H2O2 in Schisanhenol（Sal）.Method：SH-SY5Y cells were treated with different concentrations of Sal（50 and 10 μmol/L） for 4 h and then added H2O2 100 μmol/L for 12 h.

The cell proliferation activity was detected by MTT，and the expressions of SIRT1 protein and autophagic protein markers（LC3 protein，Beclin-1 protein） were detected by Western blot.Result：The cell proliferation activity of H2O2 group was significantly lower than that of control group（P<0.001），the proliferative activity of Sal group at different concentrations（50，10 μmol/L） was higher than that of H2O2 group（P=0.001，0.017），and the cell proliferation activity increased with the increase of Sal concentration.The content of SIRT1 protein in H2O2 group was significantly lower than that of control group（P<0.001），and the content of SIRT1 protein in Sal group at different concentrations（50，10 μmol/L） was significantly higher than that of H2O2 group（P=0.001，0.014）.The expressions of Beclin-1 and LC3-Ⅱ proteins in group H2O2 were higher than those of control group，the differences were statistically significant（P<0.001），the protein expression of Beclin-1 in Sal group（50 μmol/L） was lower than that of H2O2 group，and the expression of LC3-Ⅱ protein in different concentrations（50，10 μmol/L） was lower than that in H2O2 group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Sal can attenuate the excessive autophagy induced by H2O2 by up regulation of the expression of SIRT1 protein，thus antagonizing the inhibitory effect of H2O2 on the proliferation of SH-SY5Y cells.

【Key words】 Schisanhenol； SIRT1； Hydrogen peroxide； LC3

First-authors address：Qiqihar Medical University，Qiqihar 161006，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.06.009

五味子酚（schisanhenol，Sal）是從傳統(tǒng)中藥五味子果仁中提取的木脂素類成分之一。藥理實(shí)驗(yàn)表明，Sal具有顯著的抗氧化活性，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用[1-3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依賴的賴氨酸脫乙酰酶，可促進(jìn)賴氨酸殘基的乙?；牧呀?。SIRT1與細(xì)胞增殖、分化、衰老、凋亡和代謝密切相關(guān)，在氧化應(yīng)激中起重要作用[4-6]。過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）是一種常見的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑，經(jīng)過(guò)H2O2處理的細(xì)胞能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[7]。本研究以體外培養(yǎng)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤（SH-SY5Y）為研究對(duì)象，建立H2O2神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，探討SIRT1/LC3自噬通路在Sal神經(jīng)細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究Sal的神經(jīng)保護(hù)作用提供基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 Sal由成都普思生物科技有限公司提供。30% H2O2購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DMEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；MTT購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；DMSO、RIPA購(gòu)自北京Solarbio公司；SIRT1抗體和Beclin-1抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；LC3抗體購(gòu)自美國(guó)Medical & Biological Lans公司；β-Actin抗體購(gòu)自北京中山金橋生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所。細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基（含10% FBS）中，每2～3天換液1次。本研究分為對(duì)照組、H2O2組和Sal組。H2O2組：加入H2O2溶液100 μmol/L處理12 h。Sal組：分別加入不同濃度Sal（50、10 μmol/L）處理4 h后，再加入H2O2溶液100 μmol/L處理12 h。對(duì)照組加入0.1% DMSO培養(yǎng)12 h。

1.2.2 細(xì)胞增殖活性測(cè)定 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞，各組按照1×106個(gè)/mL接種于96孔板內(nèi)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。接種24 h后，分別加入各組的處理因素，培養(yǎng)12 h后加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，每孔加入DMSO150 μL，37 ℃溫箱孵育10 min后，酶標(biāo)儀測(cè)量各孔在570 nm的光密度值（OD570）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞處理結(jié)束后，PBS洗2次，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞上清。BSA蛋白定量測(cè)定各組樣品中蛋白濃度。配制10%分離膠和5%濃縮膠，加入等量蛋白樣品（30 μg/lane）電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%的脫脂奶粉封閉1 h后，一抗孵育：SIRT1、LC3、Beclin-1（1∶1 000稀釋），4 ℃過(guò)夜。TBST緩沖溶液洗膜3次后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育1 h后，TBST緩沖溶液洗3次，化學(xué)發(fā)光液顯影成像。用Quantity-One軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組SH-SY5Y細(xì)胞增殖活力比較 H2O2組細(xì)胞增殖活力為（70.15±5.21）%，較對(duì)照組100%顯著下降，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；Sal組不同濃度（50、10 μmol/L）干預(yù)后的細(xì)胞增殖活力為（89.35±6.60）%和（81.90±5.17）%，均高于H2O2組（P=0.001、0.017），且隨著Sal濃度增加，細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)。見圖1。

2.2 各組SH-SY5Y細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)的比較 利用Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組100%相比，H2O2組SIRT1蛋白含量（65.58±5.34）%明顯降低（P<0.001），Sal組不同濃度（50、10 μmol/L）作用12 h后SIRT1蛋白含量為（80.10±5.56）%、（74.98±6.28）%，均明顯高于H2O2組（P=0.001、0.014）。見圖2。

2.3 各組SH-SY5Y細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白LC3和Beclin-1表達(dá)比較 Western blot結(jié)果顯示，H2O2組Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)分別為（189.20±11.27）%、（160.02±12.15）%，均高于對(duì)照組100%，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。Sal組（50 μmol/L）的Beclin-1的蛋白表達(dá)為（136.86±10.12）%，低于H2O2組（P=0.003），Sal組不同濃度（50、10 μmol/L）LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)分別為（113.52±10.10）%、（140.68±13.54）%，均可明顯降低H2O2引起的LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)（P=0.002、0.015）。見圖3。

3 討論

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致多種神經(jīng)性疾病細(xì)胞損傷的主要原因[8-11]，因此，清除過(guò)度ROS或抑制ROS生成可能有效地防止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。Sal是從中藥五味子中提取的抗氧化活性物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)，Sal對(duì)腦細(xì)胞和動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞具有明顯神經(jīng)保護(hù)作用[1-3]，并能顯著提高癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[12]。自噬稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有重要作用[13]。然而過(guò)度的自噬可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究以SH-SY5Y為研究對(duì)象，建立H2O2損傷的氧化應(yīng)激模型，觀察Sal對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，H2O2作用SH-SY5Y細(xì)胞12 h后，細(xì)胞增殖活力較對(duì)照組顯著下降（P<0.05）；Sal干預(yù)后能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖活力下降（P<0.05），且隨著Sal濃度增加，細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)。說(shuō)明Sal具有細(xì)胞保護(hù)作用。SIRT1是NAD+依賴的組蛋白去乙?；福纱龠M(jìn)賴氨酸殘基的乙?；牧呀?，參與衰老、能量代謝、壓力反應(yīng)等多個(gè)生理過(guò)程。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2組SIRT1蛋白含量較對(duì)照組明顯降低（P<0.05），Sal組SIRT1蛋白含量均明顯高于H2O2組，提示Sal作用SH-SY5Y后能夠顯著提高SIRT1蛋白的表達(dá)。而Sal通過(guò)提高SIRT1蛋白含量，促進(jìn)抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄，提高細(xì)胞抗氧化能力，減輕H2O2對(duì)SH-SY5Y的氧化損傷。

Beclin-1和LC3作為自噬相關(guān)蛋白，可在一定程度上反映自噬表達(dá)與強(qiáng)烈程度[14-15]。LC3自噬蛋白定位于前自噬泡和自噬膜表面，參與自噬體的形成，是檢測(cè)自噬活性的一個(gè)標(biāo)志性蛋白[16-17]。LC3有Ⅰ型和Ⅱ型之分，在未發(fā)生自噬時(shí)，細(xì)胞內(nèi)合成的LC3經(jīng)過(guò)加工，形成胞漿可溶性的LC3-Ⅰ而進(jìn)行常規(guī)表達(dá)。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3-Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾過(guò)程形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ結(jié)合到胞內(nèi)自噬體的膜上，其含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少成正比，因此LC3-Ⅱ或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)強(qiáng)度與自噬活性密切相關(guān)。本研究中LC3在對(duì)照組中低表達(dá)，主要以LC3-Ⅰ的形式存在。H2O2組LC3-Ⅱ蛋白含量明顯高于對(duì)照組（P<0.05），且主要以LC3-Ⅱ形式存在，表明H2O2誘導(dǎo)了自噬蛋白的產(chǎn)生，這與文獻(xiàn)[18-19]報(bào)道一致。Sal干預(yù)后，自噬蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)明顯下降（P<0.05）。Beclin-1是自噬體形成過(guò)程中的一個(gè)重要分子，其能夠介導(dǎo)吞噬泡的形成與自噬蛋白定位，從而調(diào)控哺乳動(dòng)物自噬體的形成與成熟。在自噬發(fā)生過(guò)程中Beclin-1的表達(dá)水平隨之上升，Beclin-1的表達(dá)與自噬體的數(shù)量有密切的關(guān)系[20]。本研究結(jié)果顯示，H2O2組Beclin-1蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P<0.05），與LC3表達(dá)一致，說(shuō)明H2O2處理后誘發(fā)SH-SY5Y出現(xiàn)自噬。過(guò)高水平的自噬可使細(xì)胞內(nèi)容物被溶酶體大量降解，會(huì)導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡，Sal組（50 μmol/L）的Beclin-1的蛋白表達(dá)低于H2O2組（P<0.05），提示Sal降低LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白的水平，抑制H2O2引起的過(guò)度自噬，提高細(xì)胞的增殖活力。

綜上所述，Sal可通過(guò)上調(diào)SIRT1蛋白表達(dá)，拮抗H2O2引起的過(guò)度自噬，從而起到拮抗H2O2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的抑制作用。

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（收稿日期：2017-12-07） （本文編輯：董悅）