張林, 周劍光, 張濤, 何力

(中國水產科學研究院長江水產研究所，農業(yè)部淡水魚類種質監(jiān)督檢驗測試中心，武漢 430072)

細鱗斜頜鲴 (Xenocyprismicrolepis)，俗稱沙姑子、黃尾刁、板黃魚、黃條、黃片等，隸屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鲴亞科(Xenocyprininae)、斜頜鲴屬(Plagiognathops)[1]。主要攝食腐殖質、有機碎屑、藍藻、綠藻、硅藻等，享有“環(huán)保魚”的美譽[2]，飼養(yǎng)簡便。在不增加飼料的情況下，能提高單位面積產量，且不與鰱、鳙等爭食，可以與其混養(yǎng)。由于其具有肉味鮮美、體型中等、生長速度快、養(yǎng)殖病害少，可改善水質等特點，近年來，許多地區(qū)開展了細鱗斜頜鲴的苗種繁育、人工養(yǎng)殖及增殖放流等工作[3-6]。目前有關細鱗斜頜鲴的報道主要集中在養(yǎng)殖技術與模式[3,7]、乳酸脫氫酶[8-9]、線粒體DNA基因[10-11]的研究。對其種質資源研究報道不多見，對長江水系細鱗斜頜鲴群體生物學性狀及生化遺傳特性分析的研究未見報道。因此，本研究采用傳統(tǒng)的可數性狀和可量性狀遺傳學方法，描述其生物學性狀，研究其細胞遺傳特性及生化遺傳特性，旨在為其種群鑒定、種質標準制定、種質資源保護及利用提供基礎資料。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

細鱗斜頜鲴(Xenocyprismicrlepis)取自湖北省丹江水庫，樣本數量為30尾，體長為23.7～29.6 cm，體重為228.84～457.94 g。

1.2　形態(tài)學數據測量

采用量魚板、游標卡尺、直尺、三角板等測量工具，精確到0.01 cm。傳統(tǒng)形態(tài)學數據的獲得，參照殷名稱方法[12]，包括可數性狀和可量性狀兩類?？蓴敌誀罘謩e為側線鱗數、側線上鱗數、側線下鱗數、左側第一鰓弓外側鰓耙數、背鰭不分支鰭條數、背鰭分支鰭條數、臀鰭不分支鰭條數和臀鰭分支鰭條數，共計8項指標。可量性狀包括全長、體長、體高、頭長、吻長、眼徑、眼間距、尾柄長和尾柄高，共計9項指標。

1.3　染色體的制備

取雌雄魚各3尾，經腹腔注射5 μg/g植物血球凝集素(PHA)，繼續(xù)飼養(yǎng)24 h后，腹腔注射2 μg/g秋水仙素，2.5 h后剪鰓放血，取出頭腎。在生理鹽水中將頭腎剪成1 mm3，靜置10 min，取上層細胞懸液1 000 g離心6 min，沉淀加入0.037 5 mol/L的KC1 5 mL，室溫低滲45 min。加少許卡諾氏固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1,V∶V)預固定2～3 min 后1 000 g離心6 min，沉淀加入預冷的卡諾氏固定液，吹打均勻后室溫下靜置30 min使其固定，然后置于離心機中以1 000 g離心6 min，離心后倒去上清液。如此重復3次后，空氣干燥法制作涂片，15%Giemsa染色。

1.4　染色體檢查與形態(tài)測量

中期分裂相用16倍目鏡和100倍油鏡在顯微鏡(Olympus CX41，日本)下觀察拍攝，選擇拍攝了100張清晰的染色體中期分裂相，進行染色體個數統(tǒng)計，確定染色體眾數。染色體大小形態(tài)用Photoshop Software 7.0測量(精度0.01 μm)。挑選具有代表性的5張有絲分裂中期相，給染色體按照著絲點分割點位置進行排號(1～48)，測量每條染色體的長臂長、短臂長和總長，計算相對長度、著絲粒指數和臂比等。每對同源染色體取短臂與長臂均值。所有的測量數據用Excel進行統(tǒng)計分析，而后按照組型歸類。

1.5　染色體配對

著絲粒指數(CI)指每對染色體短臂均值長與此對染色體總長之比。相對長度指每對染色體總長和所有染色體總長之比。根據同源染色體總長及著絲粒位置的最大相似性進行配對。臂比指長臂長與短臂長之比。按臂比及著絲粒指數將染色體分為4組：中部著絲粒染色體M組，臂比為1.00～1.70，著絲粒指數(CI)為0.375～0.500；亞中部著絲粒染色體SM組，臂比為1.71～3.00，著絲粒指數(CI)為0.250～0.375；亞端部著絲粒染色體ST組，臂比為3.01～7.00，著絲粒指數(CI)為0.125～0.250；端部著絲粒染色體T組，臂比為7.01～∞，著絲粒指數(CI)為0.000～0.125[13]。在每組內根據同源染色體長度逐漸下降的順序排列。

1.6　同工酶電泳分析

選取20尾健康魚，首先剪斷鰓絲放血，在低溫條件下迅速解剖，取出腦、心、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉和眼睛7種組織，并在玻璃勻漿器中勻漿(冰上操作)，組織和提取緩沖液質量體積比為1∶3，提取液為0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.1)，4 ℃下8 000 g離心20 min后取上清液，離心2次，置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

采用7%聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，以溴酚藍作指示劑，4 ℃條件下，當溴酚藍指示劑至凝膠底部時停止電泳。電泳結束后將凝膠板取下，在乳酸脫氫酶染色液中避光染色至帶出現，顯色至出現清晰條帶后固定[14]。

1.7　數據分析

每個可數性狀用SPSS 11.0單因素方差分析(One-way ANOVA)，然后采用Duncan法作群體間差異顯著性分析,P<0.05為差異性顯著。

2　結果分析

2.1　主要生物學特征

鲴體側扁，背鰭起點處較高，體稍厚，腹部稍圓。鰓蓋后邊緣有明顯的橘黃色斑塊。腹部從腹鰭基至肛門間有明顯腹棱。頭小，吻鈍，口下位，橫裂，略呈弧形。下頜的角質邊緣比較發(fā)達。背鰭有光滑硬刺，硬刺長度較頭長大。背部灰褐色，腹部銀白色，臀鰭淺黃色，尾鰭桔黃色，后緣黑灰色。鱗片細小，排列緊密(圖1)。有鰾管，2室。咽喉齒3行，齒式為2·4·6/6·4·2。

圖1　細鱗斜頜鲴外形圖Fig.1 The outside view of Xenocypris microlepis

側線鱗數為70～78，側線上鱗數為13～14，側線下鱗數為7～8，左側第一鰓弓外側鰓耙數為33～41，背鰭不分支鰭條數為3，背鰭分支鰭條數為7，臀鰭不分支鰭條數為3，臀鰭分支鰭條數為11～12。細鱗斜頜鲴背鰭鰭式：D.ⅲ-7；臀鰭鰭式：A.ⅲ-11～12。細鱗斜頜鲴可數性狀及可量性狀比值見表1。

2.2　細胞遺傳學性狀

在拍攝的100張染色體照片中，有90張為有絲分裂中期相屬于二倍體，染色體個數范圍為42～52，眾數為48的有72張(圖2)，占有絲分裂中期相的80%；其余10張為減數分裂期(細胞處于濃縮期)，染色體個數在23～24，而染色體個數為24的有7張(占減數分裂相的70%)；由此推斷長江水系細鱗斜頜鲴屬于二倍體，染色體個數為48, 減數分裂期時屬于單倍體；此外，未發(fā)現與性別有關的異形染色體。

挑選眾數為48的5張具有代表性的有絲分裂相，測量時取其平均值，總長度范圍為50.30～90.15 μm。有10對中部著絲粒染色體，其長臂長、短臂長和總長度范圍分別為33.05～43.4、26.45～36.65和60.80～80.05 μm；相對長度、著絲粒指數、臂比范圍分別為3.74%～4.92%、0.413～0.466和1.145～1.420。有12對亞中部著絲粒染色體，其長臂長、短臂長和總長度范圍分別為34.50～64.20、15.65～28.4和50.30～90.15 μm；相對長度、著絲粒指數和臂比范圍分別為3.09%～5.54%、0.288～0.357和1.803～2.474。有2對亞端部著絲粒染色體，其長臂長、短臂長和總長度范圍分別為12.05～15.70μm、40.9～54.45和52.95～70.15 μm；相對長度、著絲粒指數和臂比范圍分別為3.26%～4.31%、0.224～0.228和3.394～3.468(表2)，但本觀察中未見端部著絲粒染色體。

表1　30尾細鱗斜頜鲴可量性狀比值及可數性狀Tab.1　Comparatives of measurable characters and countablecharacters of 30 Xenocypris microlepis　n=30

表2　細鱗斜頜鲴染色體有絲分裂中期相核型分析相關參數Tab.2　Numeral characteristics of the karyotype of Xenocypris microlepis showing the mean values of measurements from mitotic metaphases

注：M表示中部著絲點染色體，SM表示亞中部著絲點染色體，ST表示亞端部著絲點染色體。

每組中的同源染色體按總長逐漸減小的順序排列，細鱗斜頜鲴染色體中期分裂相及核型圖(圖2、圖3)，核型公式為2N=20M+24SM+4ST，臂數NF=92。

圖2　細鱗斜頜鲴腎臟細胞染色體中期分裂相Fig.2 The kidney mitotic metaphase of Xenocypris microlepis (2N=48,Bar=5μm)

圖3　細鱗斜頜鲴腎臟細胞染色體核型圖Fig.3 Karyotype of Xenocypris microlepis(2N=48,Bar=5μm)

2.3　生化遺傳學性狀

為制定細鱗斜頜鲴種質遺傳鑒定行業(yè)標準，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，隨機選取分析了20尾健康細鱗斜頜鲴心、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、腦和眼睛7種組織中乳酸脫氫酶(LDH)、乙醇脫氫酶(ADH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、酯酶(EST)、谷氨酸脫氫酶(GDH)和山梨醇脫氫酶(SDH) 6種常見的同工酶的表達模式，并對各同工酶的酶譜進行了分析。發(fā)現腎臟和肌肉中的乳酸脫氫酶(LDH)為均為單態(tài)，觀察到5個基因座，顯示5條清晰的同工酶譜帶?？勺鳛榧汍[斜頜鲴區(qū)別其他魚類特有的生化遺傳學特性，其他不同組織同工酶可供細鱗斜頜鲴群體遺傳結構分析，將不再此文中贅述。

2種組織乳酸脫氫酶酶型相似，活性均較強，且均為單態(tài)。由Ldh-A、Ldh-B兩個基因編碼的四聚體酶，分別為A4、A3B、A2B2、AB3和B4。選擇有代表性的5尾魚肌肉與腎臟組織中LDH做電泳。由圖4和圖5可見，在遷移率和某些酶帶的著色濃度上存在細微差別，顯示同種酶在同種魚類上的組織特異性。腎臟LDH1～LDH2表達豐度略高于肌肉組織。兩種組織中均是LDH3(A2B2)、LDH4(A3B)和LDH5(A4)占明顯優(yōu)勢。

圖4　細鱗斜頜鲴肌肉組織乳酸脫氫酶Fig.4 The lactate dehydrogenase(LDH) of Xenocypris microlepis muscle

圖5　細鱗斜頜鲴腎臟組織乳酸脫氫酶Fig.5 The lactate dehydrogenase(LDH) of Xenocypris microlepis kidney

3　討論

細鱗斜頜鲴主要分布于長江水系，本研究以30尾長江水系細鱗斜頜鲴為研究對象，采用傳統(tǒng)的魚類度量方法，對其進行形態(tài)學研究。實驗結果與喬德亮等[15]報道的梁子湖細鱗斜頜鲴生物學性狀基本吻合，8個可數性狀參數差異不顯著(P>0.05)；與淮河細鱗斜頜鲴生物學性狀不一致(表3)，側線鱗、側線下鱗和鰓耙數3個參數差異顯著(P<0.05)，說明存在著群體差異性，環(huán)境因素可能對其形態(tài)產生影響。楊干榮[16]報道，其體長為體高的3.4～4.0倍，為頭長的4.9～6.1倍，頭長為吻長的3.0～4.0倍，為眼間距的2.4～2.6倍，為眼徑的4.0～4.8倍，其可量性狀之比與本研究一致。本研究數據可為長江水系細鱗斜頜鲴種質資源保護及種質標準的制定提供基礎資料。

表3　細鱗斜頜鲴3個群體可數性狀均值及標準差Tab.3　Means andstandard eviations of countable characters of three populations of Xenocypris microlepis

注：*表示與本研究相比差異顯著(P<0.05)。

對魚類的種質的評估，應結合形態(tài)特征、細胞遺傳學特征和生化遺傳學等特征進行研究。從細鱗斜頜鲴染色體照片和對其分析的結果，可發(fā)現在同一分裂相中最大的一對染色體的兩條同源染色體屬于亞中部(圖2和圖3)。這與李康等[17]報道銀鲴等4種鲴科魚類最大一對亞中部染色體特征相似。表明鲴科魚類中這一對最大染色體的相對長度和臂比可能不會因羅伯遜易位、倒位、缺失或重復等改變，反映了鲴科魚類核型的同源性。

鲴亞科魚類染色體與鯉科魚類染色體數目在進化上的保守性也可能相同，二倍數基本都是48，其共同的核型公式可歸納為(18～20)M+26SM+(2～4)ST，染色體臂數變化也相當保守：NF=(92～94)[18]。本研究中長江水系細鱗斜頜鲴核型公式：2N=48=20M+24SM+4ST，臂數NF=92，與報道的鲴亞科魚類[17]在染色體分組上具有基本一致的特征。

LDH是一種催化乳酸和丙酮酸相互轉化伴同發(fā)生輔酶NAD的氧化與還原的酶，存在于有機體所有組織細胞的胞質內，以腎臟含量最高。此外，魚類肌肉活動較頻繁，糖的代謝旺盛，LDH酶質量濃度較大，酶活性較高。LDH同工酶電泳圖譜的特征反映了基因的活動與調控，即反映了遺傳表達的本質。因此我們又針對性地研究了細鱗斜頜鲴腎臟和肌肉組織的乳酸脫氫酶的生化遺傳特性。

LDH為四聚體酶，魚類的LDH同工酶最少有3個基因編碼，其中A、B基因所編碼的酶出現在魚類的多種組織中，本研究在5尾細鱗斜頜鲴腎臟與肌肉組織中檢測到Ldh-A、Ldh-B基因編碼的經典5種酶帶，且在每種組織中LDH均為單態(tài)性，可用于種質鑒定。而在腎臟與肌肉組織中未見Ldh-C基因的表達，說明細鱗斜頜鲴LDH同工酶的遺傳多樣性處于中等地位。有研究認為，第3個基因所編碼的酶在鯉形目中只存在于肝臟中[19-20]，細鱗斜頜鲴肝臟中也存在Ldh-C基因編碼的酶帶，將在另文中報道。

同一物種不同組織中LDH同工酶譜存在差異，即具有組織特異性，不同亞基組成的LDH同工酶作用不同，這一特征與該組織所處的生理條件和機能相關[19]。肌肉和腎臟中側重于無氧酵解，LDH4與LDH5活性較高，富含A亞基，催化丙酮酸轉變?yōu)槿樗峒癗AD+[19]，而本研究結果恰好印證了這一理論。

由于LDH同工酶數量與動物生活環(huán)境含氧量的狀況相關[21]。本研究中在細鱗斜頜鲴的肌肉和腎臟組織中能檢測到經典的5條酶帶，數量處于中等，由此推斷，細鱗斜頜鲴適宜在含氧量適中、比較穩(wěn)定的水域環(huán)境中生長，這可能與細鱗斜頜鲴在水體中下層活動生活習性有關。

4　結論

通過對長江水系的細鱗斜頜鲴的形態(tài)特征和遺傳學特性進行研究，發(fā)現長江水系細鱗斜頜鲴形態(tài)特征與梁子湖細鱗斜頜鲴群體生物學性狀吻合，與淮河水系細鱗斜頜鲴生物學性狀不一致，存在著群體差異性。長江水系細鱗斜頜鲴的體細胞染色體數為2N=48，核型公式為20M+24SM+4ST，臂數(NF)為92，未發(fā)現性染色體；其腎臟和肌肉組織乳酸脫氫酶各有5條同工酶譜帶，由Ldh-A、Ldh-B兩個基因編碼，且腎臟LDH1～LDH2表達豐度略高于肌肉組織。本研究可為細鱗斜頜鲴種質評估及種質標準制定提供理論參考。

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