吳少坤，林茂,*，李忠琴，黃利強(qiáng)，李江森

(1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院； 2. 廈門(mén)市漁用藥物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門(mén) 361021)

甲砜霉素(thiamphenicol，TAP) 又名硫霉素、甲砜氯霉素，與氟苯尼考、氯霉素均屬于酰胺醇類(lèi)藥物，其結(jié)構(gòu)和氯霉素相似，氯霉素分子中的對(duì)硝基以甲磺?；〈礊榧醉棵顾亍＜醉棵顾貫閺V譜抗菌藥，抗菌譜和抗菌作用與氯霉素接近，但其毒性低[1]；口服給藥后吸收快，體內(nèi)分布廣泛，可用于腸道感染，也可用于全身性的細(xì)菌性疾病[2-3]。在氯霉素被世界各國(guó)禁止用于食用動(dòng)物后，甲砜霉素與氟苯尼考分別作為氯霉素的替代藥物應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物的疾病防治[4]，中國(guó)農(nóng)業(yè)部1435號(hào)公告發(fā)布的第一批《獸藥試行標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)目錄》中就列有水產(chǎn)用的甲砜霉素制劑——甲砜霉素粉[5]。

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)俗稱多寶魚(yú)，是一種低溫、底層肉食性魚(yú)類(lèi)，隸屬于硬骨魚(yú)綱(Osteichthyes)、鰈形目(Pleuronectiformes)、鲆科(Bothidae)、菱鲆屬(Scophthalmus)[6]。1992年，大菱鲆由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所雷霽霖院士從英國(guó)引進(jìn)，經(jīng)過(guò)二十多年的推廣，大菱鲆已成為中國(guó)重要的海水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)[7]。大菱鲆在養(yǎng)殖過(guò)程中，常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病的病原菌主要有弧菌(Vibriospp.)、鏈球菌(Streptococcusspp.)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、沿海屈撓桿菌(Flexibactermaritimus)和液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)等[8]，使用藥物進(jìn)行防治是最直接、最常規(guī)、最有效的手段。但是藥物的過(guò)度使用，也導(dǎo)致一些問(wèn)題的出現(xiàn)。2006年，上海、廣州、香港等多個(gè)城市的食品藥品監(jiān)督部門(mén)對(duì)市場(chǎng)銷(xiāo)售的大菱鲆進(jìn)行抽樣檢查，檢測(cè)出藥物殘留超標(biāo)和使用違禁藥物現(xiàn)象。一時(shí)之間多寶魚(yú)在消費(fèi)者眼中成為“毒魚(yú)”，淪為 “致癌”水產(chǎn)品?！岸鄬汈~(yú)事件”是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的一次危機(jī)，促使監(jiān)管部門(mén)進(jìn)一步加大了對(duì)違禁藥物的監(jiān)測(cè)和執(zhí)法力度。隨著民眾對(duì)食品質(zhì)量需求的提升，水產(chǎn)養(yǎng)殖的藥物使用將更加嚴(yán)格，這就要求在漁藥殘留檢測(cè)技術(shù)和藥動(dòng)學(xué)理論方面開(kāi)展更加深入的研究。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)甲砜霉素在畜禽動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)多有研究[9-14]，在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)也有些報(bào)道，研究對(duì)象主要集中于鯽(Carassiusauratus)[1,4,15]、鯉(Cyprinuscarpio)[1,4,15-16]、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[17]、紅笛鯛(Lutjanussanguineus)[18]、眼斑擬石首魚(yú)(Sciaenopsocellatus)[19]等，但尚未見(jiàn)甲砜霉素在大菱鲆體內(nèi)代謝規(guī)律的研究報(bào)道。本研究采用混飼口灌給藥方式，研究甲砜霉素在大菱鲆體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征和殘留消除規(guī)律，并提出給藥方案和休藥期建議，以便為實(shí)際生產(chǎn)中的安全使用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　主要試劑

本實(shí)驗(yàn)所需試劑主要包括甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品(99.7%，中國(guó)獸醫(yī)藥品檢查所)；甲砜霉素原料藥(99.0%，濰坊三江醫(yī)藥化工有限公司)、甲醇(色譜純，TEDIA公司)、乙酸乙酯(西隴化工股份公司)；正己烷(西隴化工股份公司)；氨水(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)前大菱鲆暫養(yǎng)在200 L養(yǎng)殖缸中，每缸10～15尾，使用循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，水溫19 ℃，鹽度17.8。期間大菱鲆抽樣檢測(cè)體內(nèi)無(wú)甲砜霉素殘留，暫養(yǎng)7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，平均體重為(451.5±67.8)g。

1.3　給藥及樣品采集

代謝動(dòng)力學(xué)研究組采用30 mg/kg的常規(guī)治療劑量以導(dǎo)管單次混飼口灌給藥，在給藥后0.25、0.50、1、2、3、4、6、9、12、24、36和48 h，分別采集大菱鲆的血液、肝臟、腎臟和肌肉等組織樣品。殘留消除研究組則采用60 mg/kg的高劑量[20-25]，采樣時(shí)間點(diǎn)為給藥后的1、3、5、8、10、13、15和30 d。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取5條魚(yú)作為重復(fù)，未口灌處理的大菱鲆各組織樣品為空白對(duì)照組。

血液的采集是用2 mL注射器進(jìn)行尾部抽血，并置于5 mL 離心管中，注射器和離心管使用前用0.1 %肝素鈉潤(rùn)洗風(fēng)干。血液以1 480 g離心10 min，取上清液，同其他組織樣品置于-80 ℃保存。

1.4　樣品處理

組織(肌肉、肝臟、腎臟)和血漿自然解凍后，組織剪碎并用研磨儀勻漿。肌肉、肝臟、腎臟各取1 g，血漿取1 mL，樣品分別放入10 mL離心管中。加入3 mL堿化乙酸乙酯(乙酸乙酯∶氨水=97∶3，V/V)，漩渦振蕩5 min后，以9 300 g離心5 min，取其上清液于廣口瓶中。重復(fù)上述提取步驟2次，合并上清夜。將廣口瓶置于50 ℃水浴鍋中，在通風(fēng)柜中進(jìn)行風(fēng)干。樣品抽干后加入2 mL流動(dòng)相溶液，放入搖床振蕩至完全溶解。加入2 mL正己烷，振蕩5 min。所有溶液移至10 mL離心管中，以9 300 g離心5 min，移取1 mL下層溶液于15 mL離心管中，用流動(dòng)相稀釋10倍后以0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，存于進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

1.5　檢測(cè)方法

TAP含量的檢測(cè)使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀Agilent 1260-6420。色譜條件：色譜柱Agilent ZORBAX C18(2.1mm×50 mm，1.8 μm)；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為甲醇∶水(80∶20，V/V)；流速0.40 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。質(zhì)譜條件：噴霧離子源(ESI)；負(fù)離子掃描；多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓 -3 500 V；定性離子對(duì)(m/z)353.9/290和353.9/184.7，定量離子對(duì)(m/z)353.9/184.7；采集時(shí)間200 ms；碰撞解離電壓130 V；碰撞能量8 V/20 V。

1.6　標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限

用1.4節(jié)方法前處理的空白樣品將TAP 標(biāo)準(zhǔn)品配制成1、10、25、50和100 ng/mL的樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行色譜檢測(cè)。以TAP濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。檢測(cè)中對(duì)于含量超過(guò)100 ng/mL的樣品以流動(dòng)相進(jìn)行相應(yīng)的稀釋，使終濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

1.7　回收率和精密度

將空白對(duì)照大菱鲆的血漿、肝臟、腎臟和肌肉樣品進(jìn)行組織勻漿后，分別加入TAP標(biāo)準(zhǔn)液，制成不同質(zhì)量濃度梯度樣品，混勻靜置，使藥物充分滲入組織中，最終含量為50、10和1 ng/mL。按照1.4節(jié)進(jìn)行樣品前處理。于一日和一周內(nèi)分別對(duì)各個(gè)濃度樣品重復(fù)測(cè)定3次，并計(jì)算回收率和日內(nèi)、日間精密度[26]。

1.8　數(shù)據(jù)處理

代謝動(dòng)力學(xué)的藥時(shí)數(shù)據(jù)使用DAS 3.0軟件進(jìn)行分析。殘留消除的藥時(shí)數(shù)據(jù)用WT1.4軟件來(lái)計(jì)算休藥期，計(jì)算涉及到的甲砜霉素最高殘留限量值(MRL，50 μg/kg)依據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的235號(hào)公告[27]。

2　結(jié)果與分析

2.1　色譜質(zhì)譜特征

在優(yōu)化的檢測(cè)條件下，血漿樣品中TAP保留時(shí)間約為0.39 min，色譜峰的峰形尖銳，且有良好的分離效果(圖1)。以m/z353.9作為母離子，選取碎片豐度最強(qiáng)的m/z184.7和290.0作為T(mén)AP的監(jiān)測(cè)離子，以3倍信噪比(S/N)計(jì)，甲砜霉素的最低檢測(cè)限為0.001 mg/L。

2.2　分析方法驗(yàn)證

繪制血漿、肝臟、腎臟和肌肉中的TAP標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計(jì)算各批樣品對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.998。添加TAP的加標(biāo)空白樣，經(jīng)檢測(cè)，平均回收率為(93.1±5.6)%(表1)。方法日內(nèi)變異系數(shù)為(2.4±0.6)%，日間變異系數(shù)為(4.7±1.1)%。

圖1　甲砜霉素(50 ng·mL-1)的MRM色譜圖1：母離子m/z 353.9；2：子離子m/z 290.0；3：子離子m/z 184.7。Fig.1 MRM chromatograms of TAP(50 ng·mL-1)1：parent ion m/z 353.9；2：daughter ion m/z 290.0；3：daughter ion m/z 184.7.

表1　樣品加標(biāo)回收率Tab.1　Recoveries of standard addition n=5

2.3　甲砜霉素在大菱鲆血漿中的藥動(dòng)學(xué)特征

甲砜霉素以30 mg/kg的劑量對(duì)大菱鲆給藥后的時(shí)間-濃度曲線(圖2)顯示，在0～9 h內(nèi)，甲砜霉素在血漿中的濃度逐漸升高，在9 h時(shí)達(dá)到峰濃度(Cmax)21.968 μg/mL。之后迅速消除，在24 h時(shí)血漿中甲砜霉素殘留為1.563 μg/mL，在48 h時(shí)為1.087 μg/mL。藥時(shí)數(shù)據(jù)以非房室模型進(jìn)行分析，獲得的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(表2)顯示藥時(shí)曲線下面積(AUC0-∞)為319.754 mg/(L·h)，表觀分布容積(Vz/F)為6.206 L/kg，平均滯留時(shí)間[MRT(0-∞)]和消除半衰期(T1/2z)分別為33.984 h和45.841 h。

圖2　單次口灌甲砜霉素后大菱鲆血漿中的藥時(shí)曲線(n=5)Fig.2 Mass concentration-time curve of TAP in the plasma of Scophthalmus maximus after single oral administration(n=5)

表2　甲砜霉素在大菱鲆血漿、肌肉、肝臟和腎臟中的非房室藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab.2　Non-compartmental pharmacokinetic parameters of TAP in plasma，muscle，liver and kidney of Scophthalmus maximus

注：AUC表示曲線下面積；MRT表示平均駐留時(shí)間；(0—t)表示在 0—48 h時(shí)間內(nèi)；(0—∞)表示在 0—∞時(shí)間內(nèi)；T1/2表示消除半衰期，下標(biāo)“z”表示統(tǒng)計(jì)矩原理計(jì)算；Vz/F表示表觀分布容積；CL/F表示清除率；Tmax表示達(dá)峰時(shí)間；Cmax表示達(dá)峰濃度。

2.4　甲砜霉素在大菱鲆中組織的代謝特征

甲砜霉素在大菱鲆的肌肉、肝臟和腎臟組織中的藥時(shí)曲線(圖3)顯示，甲砜霉素在這3種組織中廣泛分布，達(dá)峰濃度(Cmax)分別至22.346、27.128和47.718 μg/g。除了肝臟中達(dá)峰時(shí)間較快(4 h)，在肌肉和腎臟組織中均在9 h時(shí)達(dá)峰。在3種組織中的非房室藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(表2)顯示，甲砜霉素在腎臟中的達(dá)峰濃度(Cmax=47.718 μg/g)和藥時(shí)曲線下面積[AUC(0-∞)=517.768 mg/(L·h)]最大，表明腎臟對(duì)甲砜霉素的吸收能力最高；在肝臟中的平均滯留時(shí)間[MRT(0—∞)= 36.565 h]最長(zhǎng)，結(jié)合消除半衰期(T1/2z=42.370 h)，說(shuō)明給藥后48 h內(nèi)甲砜霉素在肝臟中的消除較慢。

圖3　單次口灌甲砜霉素后大菱鲆肌肉(A)、肝臟(B)和腎臟(C)中的藥時(shí)曲線(n=5)Fig.3 Time-concent curve of TAP in muscle(A), liver(B) and kidney(C) of Scophthalmus maximus after single oral dose(n=5)

2.5　甲砜霉素的殘留消除與休藥期

甲砜霉素采用60 mg/kg的劑量口灌給藥大菱鲆，第1天血漿、肌肉、肝臟和腎臟中的藥物含量分別為2.776 μg/mL、3.480 μg/g、11.891 μg/g和13.531 μg/g，并分別在給藥后第5、10、10和13天時(shí)降至MRL(0.05 μg/g)之下，此時(shí)含量分別是0.017 μg/mL、0.022 μg/g、0.029 μg/g和0.016 μg/g。甲砜霉素在大菱鲆血漿、肌肉、肝臟和腎臟中的殘留消除藥時(shí)數(shù)據(jù)，用WT軟件的回歸法計(jì)算(圖4)，所得的理論休藥期(WDT)分別為8.90、10.64、18.19 和23.95 d，說(shuō)明甲砜霉素在大菱鲆腎臟中的殘留期較長(zhǎng)。

圖4　甲砜霉素在大菱鲆各組織中的理論休藥期(n=3)A:血漿；B：肌肉；C：肝臟；D：腎臟。a：擬合回歸線；b：95%置信區(qū)間的上限；c：最高殘留限量(MRL，0.05 μg·g-1)。Fig.4 The withdrawal time in theory calculated for TAP in different tissues of Scophthalmus maximus(n=3)A:Plasma；B:Muscle；C: Liver；D: Kidney.a :Linear regression line； b :Tolerance limit with 95% confidence；c :Maximum residual limit(MRL，0.05 μg·g-1).

3　討論

3.1　 甲砜霉素在大菱鲆體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tmax越大，通常表明吸收速率越慢；Cmax越大，則表明吸收程度越高。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，甲砜毒素在腎臟中的達(dá)峰濃度和藥時(shí)曲線下面積值最大，分別為47.718 μg/g和517.768 mg/(L·h);在血漿中的表觀分布容積最大，為6.206 L/kg；在腎臟中的清除率最低，為0.058 L/(h·kg)；在肝臟中的平均駐留時(shí)間最長(zhǎng)，為36.565 h；在肝臟中的達(dá)峰時(shí)間較快(4 h)，在血漿、肌肉、腎臟中的達(dá)峰時(shí)間為9 h；在血漿中的消除半衰期時(shí)間最長(zhǎng)，為45.841 h。與已報(bào)道的甲砜霉素藥動(dòng)學(xué)研究相比(表3)，在相同給藥劑量(30 mg/kg)時(shí)，甲砜霉素在大菱鲆中的吸收速率遠(yuǎn)低于鯽、松浦鏡鯉、家兔和雞，但吸收程度較好。

半衰期(T1/2)反映藥物在動(dòng)物機(jī)體中的消除速率，甲砜霉素在鯽、松浦鏡鯉、凡納濱對(duì)蝦、紅笛鯛等動(dòng)物體內(nèi)的T1/2分別為16.71、77.29、10.66和50.09 h，而本實(shí)驗(yàn)中大菱鲆的T1/2為45.841 h，表明了甲砜霉素在大菱鲆體內(nèi)的消除較為緩慢，維持有效濃度時(shí)間較長(zhǎng)(表3)。

表3　口灌給藥方式下甲砜霉素在不同動(dòng)物血漿中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab.3　Pharmacokinetic parameters of TAP in the plasma of different animals following oral administration

注：—表示未提供。

3.2　給藥方案和休藥期建議

抗菌藥物能否在體內(nèi)維持一定時(shí)間的治療往往取決于達(dá)峰濃度/最小抑菌濃度(Cmax/ MIC)能否達(dá)到10[28]。甲砜霉素對(duì)鱉、魚(yú)類(lèi)和貝類(lèi)中常見(jiàn)病原菌的MIC多報(bào)道為0.39～1.6 μg/mL[29-31]，在本次研究中甲砜霉素在大菱鲆血漿中的Cmax為21.968 μg/mL，通過(guò)計(jì)算Cmax/ MIC的值在13.7～56.3之間，說(shuō)明了以30 mg/kg的劑量對(duì)于常見(jiàn)的病原菌是有效的。本次研究中甲砜霉素在大菱鲆體內(nèi)的消除較為緩慢，消除半衰期T1/2z(45.841 h)大于24 h，而在24 h時(shí)血漿中甲砜霉素含量?jī)H為1.563 μg/mL，結(jié)合半衰期及血藥濃度，建議投喂方案為30 mg/kg的劑量，一日一次。

藥物殘留消除規(guī)律的研究對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物食品安全具有重要的理論價(jià)值。本研究在19 ℃水溫下，采用高劑量(60 mg/kg)單次口灌的給藥方式，采集了30 d內(nèi)甲砜霉素在大菱鲆各組織中的殘留數(shù)據(jù)，結(jié)合甲砜霉素的最高殘留限量(50 μg/kg)[27]計(jì)算理論休藥期，如果只考慮把肌肉作為主要食用部分，建議休藥期為11 d；如果考慮所有組織，則以消除最慢的腎臟代謝數(shù)據(jù)為參照，建議休藥期為24 d。

4　結(jié)論

甲砜霉素以30 mg/kg的劑量單次混飼口灌后，在大菱鮃體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)顯示，達(dá)峰濃度(Cmax)和達(dá)峰時(shí)間(Tmax)分別為21.968 μg/mL和9 h，平均滯留時(shí)間MRT(0—∞)和消除半衰期(T1/2z)分別為33.984 h和45.841 h。參考現(xiàn)有甲砜霉素的藥效學(xué)數(shù)據(jù)，在大菱鲆常見(jiàn)細(xì)菌病的治療中，甲砜霉素建議的給藥方案為：30 mg/kg，混飼給藥，一日一次。

考慮多次給藥的藥物累積作用，甲砜霉素以60 mg/kg的高劑量單次混飼口灌后計(jì)算理論休藥期。結(jié)果顯示，甲砜霉素在大菱鲆血漿、肌肉、肝臟、腎臟中的理論休藥期分別為8.90、10.64、18.19、23.95 d。因此，建議甲砜霉素用藥后的理論休藥期應(yīng)在24 d以上。

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