王正全，崔云云，倪玲，陳力，黃寶勇，劉源，汪立平，趙勇,，王錫昌,，謝晶,

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306； 2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(上海)，上海 201306；3.北京市農(nóng)業(yè)環(huán)境監(jiān)測站，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子風(fēng)險評估實驗室(北京)，北京 100029； 4.農(nóng)業(yè)部冷庫及制冷設(shè)備質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(上海)，上海 201306)

丁香酚(eugenol,C10H12O2)是從芳香植物的精油中提取得到的，在常溫下呈黃色或透明的油狀苯丙類化合物。丁香酚具有局部麻醉、防腐、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗菌的作用，通過作用于生物體弓狀核區(qū)的敏感神經(jīng)元，影響其放電作用及相關(guān)細(xì)胞通路，從而產(chǎn)生局部降溫等作用，是清涼油等驅(qū)蚊蟲藥物的有效成分[1]。日本最早發(fā)現(xiàn)丁香酚對水產(chǎn)動物具有麻醉作用并應(yīng)用于景觀魚運輸，隨后世界各國學(xué)者也發(fā)現(xiàn)丁香酚獨特的麻醉效果，且受試動物能夠快速復(fù)蘇，開發(fā)出專用劑型應(yīng)用于食用水產(chǎn)動物的高密度運輸[2-3]。但是，含有丁香酚的運輸水長時間浸泡水產(chǎn)動物會導(dǎo)致其在動物體內(nèi)蓄積并污染環(huán)境。有研究顯示，因丁香酚的芳香烴結(jié)構(gòu)具有脂溶性特點，使其在水產(chǎn)動物中可以穩(wěn)定存在96h以上；丁香酚麻醉魚體20d后仍可被檢測，在500℃以上才會明顯降解；其前處理提取物有4d的穩(wěn)定期，可以積蓄在水產(chǎn)動物體內(nèi)[4-7]。含有丁香酚的廢水最終排放入大海后，能嚴(yán)重干擾珊瑚的繁殖，其對海洋環(huán)境的危害不可輕視[8]。

目前國際上流行3種丁香酚麻醉劑，即丁香油(cloveoil)、香精油(essentialoil)和AQUI-S?20E(10%丁香酚活性成份復(fù)配麻醉劑，僅限美國地區(qū)使用)，其中后者應(yīng)用最廣泛且相關(guān)研究最多[9-15]，而國內(nèi)流行使用的是純丁香油(醫(yī)用丁香酚)[16-18]。有學(xué)者指出，有效成分為丁香酚的復(fù)配制劑AQUI-S?20E一旦使用，必定會檢出丁香酚殘留，甚至在水產(chǎn)動物表皮也能檢測到[11]。更有研究指出，使用AQUI-S?20E麻醉鱸需要50h～7d的時間才可以代謝干凈，并且這種麻醉劑的殘留會出現(xiàn)累積效應(yīng)，最終建議捕撈前休藥2d且運輸結(jié)束后再需要暫養(yǎng)休藥7d才可食用，這是僅有的關(guān)于丁香酚在水產(chǎn)動物麻醉后休藥期的研究報道[12]。美國、歐盟等國家和地區(qū)還允許使用推薦劑量的魚安定(甲磺酸三甲酯，MS-222)作為魚類麻醉劑，該麻醉劑在中國較罕見。

調(diào)研發(fā)現(xiàn)，丁香酚作為一種漁用麻醉劑已在中國使用多年，特別是在水產(chǎn)動物運輸環(huán)節(jié)常使用丁香酚對密集運輸?shù)聂~、蝦、蟹類進行麻醉，可以有效減少甚至避免水產(chǎn)動物運輸過程中的機體損耗，進而減少鮮活水產(chǎn)品的死亡率，使養(yǎng)殖戶和各級經(jīng)銷商獲益。丁香酚麻醉水產(chǎn)動物的復(fù)蘇時間相對較長，價格卻比MS-222占優(yōu)勢，歐美等國家和地區(qū)多用MS-222，而日本、新西蘭、澳大利亞、智利則多用丁香酚，中國的使用情況與亞太地區(qū)國家的大趨勢一致[16]。丁香酚能有效使羅非魚出現(xiàn)短暫呼吸停止，減少運輸過程的應(yīng)激反應(yīng)，減少運輸過程中的損失，實際運輸中低水溫會影響魚體對麻醉劑的吸收效果，通常采用加大使用劑量(0.15mL/L)維持麻醉效果[17]。媒體曾報道丁香酚麻醉運輸活魚的案例，引起了消費者對食品安全的擔(dān)憂和恐慌，特別是一線城市的水產(chǎn)動物運輸過程長、暫養(yǎng)銷售環(huán)節(jié)到餐桌的過程周期短、從業(yè)人員加藥隨意性大且缺少休藥期概念，導(dǎo)致丁香酚殘留安全風(fēng)險陡升?？傊?，目前丁香酚殘留檢測監(jiān)管存在執(zhí)行難度大、風(fēng)險排查困難多、標(biāo)準(zhǔn)檢測方法尚未建立等問題，因此，迫切需要開發(fā)針對水產(chǎn)動物及其運輸暫養(yǎng)水體等的快速、簡單、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、有效、靈敏的檢驗檢測方法[18-26]。文章歸納了近年來國內(nèi)外針對水體及類似基質(zhì)中丁香酚的殘留檢測的方法，以期為中國漁用麻醉劑的監(jiān)測和監(jiān)管提供參考。

1　丁香酚作為麻醉劑的應(yīng)用背景

丁香酚在水產(chǎn)動物高密度養(yǎng)殖時被用作麻醉劑的作用主要是降低新陳代謝和耗氧量，有研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖密度達到240 g/L時，使用30 mg/L的商用精油AQUI-S?20E(含10%丁香酚有效成分)可有效提升溫水魚(羅非魚)和冷水魚(黃鱸)的存活率[9]。 另一研究表明運輸水中添加丁香酚精油可以有效降低水產(chǎn)動物血漿中的皮質(zhì)醇含量，減少血液中Na+、K+、C1-的損失，顯著降低運輸終了時運輸水中的總胺濃度，說明丁香酚可以在運輸過程中降低魚、蝦等水產(chǎn)動物的代謝率，提高存活率[9-10]。

本實驗室在2013—2016年間不間斷地對滬浙閩三地水產(chǎn)動物批發(fā)市場的調(diào)研和排查中發(fā)現(xiàn)，樣品從未監(jiān)測出MS-222，而丁香酚在運輸水和暫養(yǎng)水中則均有陽性檢出，運輸環(huán)節(jié)人工添加丁香酚行為歸納如圖1所示。

圖1　獨立的水產(chǎn)動物運輸水箱加入丁香酚過程示意圖Fig.1 Schematic of the addition of eugenol in a self-contained fish transport box

2　殘留檢測方法國內(nèi)外研究進展

2.1　國外研究概況

目前丁香酚的毒性機理和毒害作用尚未形成一致結(jié)論，國際上對其應(yīng)用的普遍性存在爭議，研究關(guān)注水產(chǎn)動物及其運輸和暫養(yǎng)環(huán)節(jié)的水生動物產(chǎn)品、血清、精油、茶水、豆粉和環(huán)境水等基質(zhì)中的丁香酚含量或殘留檢測，如表1所示。

表1　外文文獻關(guān)于丁香酚的殘留檢測現(xiàn)狀Tab.1　Current status of residual analysis of eugenol in foreign literatures

注： LOD(limit of detection)為檢測限；LOQ(limit of Quantity)為定量限；HPLC(high-performance liquid chromatography)為高效液相色譜；GC-MS/MS(gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry)為三重四級桿氣質(zhì)色譜儀；UV(ultra violet detectior)為紫外檢測器；LSC(liquid scintillation counter)為液體閃爍計數(shù)器；SIDA(stable isotope dilution assay)為穩(wěn)定同位素稀釋測定；FID(flame ionization detector)為火焰離子化檢測器?！硎疚墨I未記錄，下同。

國際上的相關(guān)研究多關(guān)注以丁香酚為主要功效成分的商業(yè)配方或者精油，如AQUI-S?20E、Aqui-S (10%異丁香酚)等的麻醉機理、麻醉效果、殘留穩(wěn)定性、代謝規(guī)律和環(huán)境影響等方面，研究的樣品基質(zhì)則多針對于水產(chǎn)動物及其相關(guān)水樣[4, 7-15, 28, 30, 34]。以丁香酚及其同系物純品為研究對象的文獻并不多見，研究關(guān)注的樣品基質(zhì)也并不局限于水產(chǎn)動物[6, 27-32]。另外，外文文獻中研究的樣品基質(zhì)差異非常大，既有簡單的水產(chǎn)動物肌肉組織勻漿樣品，又有環(huán)境水、茶水等均勻樣品，還有復(fù)雜的血清、血漿基質(zhì)，甚至還包括原始精油成分的常量分析，這些方法的檢出限、回收率的研究并不很全面，主要是輔助邏輯性推理和原理性推斷，檢驗檢測僅為手段而非文獻的最終研究目的。

對于水產(chǎn)動物的丁香酚研究，外文文獻關(guān)注點在于多品種的淡水魚[7]、高密度養(yǎng)殖的冷水魚和溫水魚[9, 34]中的丁香酚殘留或麻醉機理，也涉及某一種魚類或其他水產(chǎn)動物模型的可食性帶皮肌肉組織[7, 11, 35]，針對性較強。Becker等[10]發(fā)現(xiàn)丁香酚及由白棘枝提煉的精油同樣可以在運輸銀鰱和克林雷氏鯰的過程中有效地減少緊張素，降低運輸過程中氧氣的消耗和二氧化碳與總胺的積累程度，可以保障更長的運輸時間后銀鰱不因總胺含量急速上升而死亡。Kaiser等[14]專門研究了丁香油在長途運輸鮮活維多利亞麗池魚過程中有效減輕魚類的壓力反應(yīng)的作用，發(fā)現(xiàn)丁香油搭配選擇性銨離子交換沸石可控制總氨水平降幅達82%，另外關(guān)于長距離運輸鮮活水產(chǎn)品的研究還可以借鑒參考大鼠血漿、人血清和茶水為基質(zhì)的研究[29-31]。

2.2　國內(nèi)研究概況

鑒于丁香酚作為麻醉劑的風(fēng)險性以及國標(biāo)和殘留限量值的空缺現(xiàn)狀(僅有地標(biāo)DB22/T 1988—2013水產(chǎn)品中丁香酚的測定高效液相色譜法)，中國近年也涌現(xiàn)出大量針對水產(chǎn)動物以及運輸、暫養(yǎng)水體中丁香酚殘留檢測的研究。目前常見的檢測方法包含有固相萃取-高效液相色譜-熒光法(SPE-HPLC-FLD)、固相萃取-高效液相色譜-質(zhì)譜法(SPE-HPLC-MS)、基質(zhì)固相分散萃取-氣相色譜法(d-SPE-GC)、液液萃取-高效液相色譜-紫外法(LLE-HPLC-UV)、固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜法(SPE-GC/MS)和固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜法(SPME-GC/MS)法等，丁香酚殘留檢測研究進展如表2所示。國內(nèi)儀器設(shè)備傾向于選用更加優(yōu)越的三重四級桿串聯(lián)技術(shù)(MS/MS)，而國際研究則傾向于選用更加基礎(chǔ)的紫外(UV)和單四極桿(MS)檢測設(shè)備，國內(nèi)研究明顯檢測限更低、基質(zhì)更全面、應(yīng)用更廣泛，殘留檢測已經(jīng)處于世界領(lǐng)先水平。

表2　中文文獻關(guān)于丁香酚的殘留檢測現(xiàn)狀Tab.2　Current status of residual analysis of eugenol in domestic literatures

目前國內(nèi)關(guān)于丁香酚在水體及水產(chǎn)品中殘留檢測的研究尚處于起步階段。文獻調(diào)查顯示，常量分析[20, 36]、靈敏度不高的UV檢測器[21-23]、過于粗放的前處理方法[26]、穩(wěn)定性不佳的外標(biāo)法[23]占國內(nèi)研究主體。也有一些文獻的方法學(xué)研究做的比較完善，如針對魚肉組織和暫養(yǎng)水、環(huán)境水的研究比較深入，方法建立的比較完善，可供借鑒[18-19, 24]。

3　前處理技術(shù)研究概況

3.1　檢測方法的基質(zhì)

殘留檢測方法的開發(fā)都是基于實際應(yīng)用中的社會需求所開展的，除藥物濫用外，丁香酚主要是供鮮活水產(chǎn)動物的運輸使用，所以國內(nèi)外主要關(guān)注的研究基質(zhì)為水產(chǎn)動物可食性肌肉組織和運輸及暫養(yǎng)水體[4, 6-7, 10-15, 17-20, 22-28, 30-31, 35]，還有少數(shù)研究關(guān)注代謝過程中的血液樣品的丁香酚殘留情況[9, 21, 29-30, 36]。但水樣基質(zhì)的方法開發(fā)的較少，僅有部分以血液、茴香茶和環(huán)境水樣品為基質(zhì)的方法開發(fā)[27, 29-31]。國內(nèi)針對液體樣品基質(zhì)的方法相對數(shù)量多且更加具體，反映出國內(nèi)強烈的檢測需求和更細(xì)化的領(lǐng)域關(guān)注，如趙東豪等[19]和劉海新等[25]開發(fā)的養(yǎng)殖水體中丁香酚殘留的HPLC-MS/MS檢測法和不確定度分析，柯常亮等[24]使用GC-MS/MS檢測純凈水中丁香酚的殘留。然而HPLC-MS/MS雖然檢測速度快卻消耗太多有機試劑，既不經(jīng)濟又不環(huán)保，而GC-MS/MS的研究相對簡單，可深入優(yōu)化。

3.2　前處理方法的研究

所有丁香酚殘留檢測方法在拋去差異化的儀器設(shè)備和研究基質(zhì)的因素外，最大的區(qū)別就在于前處理技術(shù)。外文文獻主要選用LLE、SPE、UE、SPME、HS及幾種方法的串聯(lián)技術(shù)做丁香酚的殘留檢測前處理手段，使用的輔助吸附劑涵蓋丹磺酰氯、過濾棉和氯化鉀等，萃取溶劑則多使用甲醇、乙腈、正己烷、氫氧化鈉、丙酮和乙醇等[6-7, 27-28, 30-32, 35, 37-38]。國內(nèi)文獻則主要選用SPE、d-SPE、SPME和LLE方法，較少使用串聯(lián)的方法，輔助吸附劑多選擇PSA、C18、石墨化碳黑(GCB)、中性氧化鋁和硅膠等，萃取溶劑則多使用甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷等[18-26, 36]，國內(nèi)研究比國外研究在殘留檢測設(shè)備儀器和新型萃取技術(shù)方面有優(yōu)勢，但在傳統(tǒng)的前處理技術(shù)的串聯(lián)和方法細(xì)化方面還有一些差距。

目前，丁香酚的殘留檢測最常用的凈化方法如表3所示，可知SPE和液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)是研究中最常使用的前處理方式也是最穩(wěn)定方法，超聲萃取作為一種基本的前處理操作也可以用于丁香酚的殘留分析。

表3　丁香酚凈化方法評價Tab.3　The purification method reference table of eugenol and evaluation

注： LLE(liquid to liquid extraction)為液液萃?。籙E(ultrasonic extraction)為超聲萃?。籋S(headspace)為微波輔助萃??；SPE(solid-phase extraction)為固相萃??；SPME(solid-phase microextraction)為固相微萃取；d-SPE(dispersive solid phaseextraction)為基質(zhì)分散固相萃取。

關(guān)于3種常見的水產(chǎn)動物前處理方法的流程圖如圖2所示。LLE是最經(jīng)典的萃取方法，但是因為消耗有機溶劑量大且萃取效率較低，被SPE法逐步取代。目前最經(jīng)典的從肌肉組織和水體中萃取有機物的前處理方式就是SPE，但SPE小柱作為實驗耗材比較昂貴。近年來國際流行的趨勢著眼于開發(fā)簡單、快速、有效、經(jīng)濟、節(jié)省的前處理技術(shù)，基質(zhì)分散固相萃取(dispersive solid phaseextraction, d-SPE)方法因此誕生，該方法的優(yōu)點是需要的樣品量較少，可以有效萃取濃縮凈化復(fù)雜基質(zhì)中的目標(biāo)物，缺點是方法穩(wěn)定性有限，更適合于做科學(xué)研究，而針對大批量的樣品檢測，還應(yīng)選擇經(jīng)典的SPE方法提高準(zhǔn)確率和效率。

3.3　檢測設(shè)備儀器

丁香酚的殘留檢測方法按照檢測設(shè)備劃分可分為3大類：第一類是氣相色譜類，使用的設(shè)備涵蓋GC-MS、GC-FID、GC-MS/MS、HS-GC/MS等，后兩者較為先進和精準(zhǔn)；第二類是液相色譜類，使用的設(shè)備主要有HPLC-UV、HPLC-MS、HPLC-MS/MS這三種，后者最為精準(zhǔn)和先進；第三類是非常規(guī)設(shè)備類，包含有流通液體閃爍計(LSC)和同位素稀釋測定儀(SIDA)等稀有設(shè)備[11, 27]，條件較為苛刻，且大多數(shù)檢測機構(gòu)不具備條件，參考價值低，如表1和表2所示。但是在檢測水產(chǎn)動物中14C標(biāo)記的丁香酚的暴露水平和代謝途徑方面，非常規(guī)設(shè)備可以發(fā)揮出其無可替代的作用[35]。

3.4　氣相色譜內(nèi)標(biāo)法的內(nèi)標(biāo)物選擇及其質(zhì)譜參數(shù)

質(zhì)譜檢測已經(jīng)成為主流的殘留檢測的手段，國內(nèi)研究機構(gòu)多使用MS/MS技術(shù)提高檢測方法靈敏度和定性定量檢測準(zhǔn)確度，該技術(shù)可有效排除丁香酚殘留檢測過程中的基質(zhì)干擾[39]，在氣相和液相色譜法檢測丁香酚的殘留時都可以選用內(nèi)標(biāo)法以避免引入系統(tǒng)誤差，而對于可精準(zhǔn)定量的液相色譜法則可選用外標(biāo)法來降低選擇合適內(nèi)標(biāo)物的難度，對于常量分析或成分分析則可使用更簡單的歸一化法[11-12, 19-25, 27-31, 35-36]。由于氣相色譜法具有最經(jīng)濟、環(huán)保、定性定量準(zhǔn)確、易操作等優(yōu)點，最適合丁香酚的殘留檢測，相關(guān)文獻研究數(shù)目也最多，應(yīng)用最為廣泛，其中常用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式和質(zhì)譜參數(shù)總結(jié)如圖3和表4所示。

圖2　三個典型水產(chǎn)動物基質(zhì)中丁香酚前處理方法對比Fig.2 Comparison of 3 pretreatment methods of eugenol residues in aquatic animals

圖3　丁香酚三維結(jié)構(gòu)圖以及丁香酚殘留檢測常用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖(a)丁香酚3D；(b)丁香酚；(c)d3-丁香酚；(d)百里香酚；(e)對二苯基苯；(f)二環(huán)己基甲醇；(g)甲基丁香酚。Fig.3 Chemical structures of eugenol and internal standards(a) eugenol 3D; (b) eugenol; (c) d3-eugenol;(d) thymol; (e) p-diphenylbenzene; (f) dicyclohexyl methanol;(g) methyl eugenol.

異丁香酚作為內(nèi)標(biāo)物時會發(fā)生隨儲存時間延長而轉(zhuǎn)化為丁香酚的情況，甲基丁香酚在特定條件下也可以轉(zhuǎn)化為丁香酚，這兩種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)在選用時需要每次實驗重新配置母液。對二苯基苯、百里香酚和二環(huán)己基甲醇與丁香酚結(jié)構(gòu)差異大，雖然也可以精準(zhǔn)定量，但存在基質(zhì)不同時響應(yīng)與丁香酚不同步的可能性。d3-丁香酚和14C-丁香酚是丁香酚的氘代內(nèi)標(biāo)，是最好的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)候選項，但也存在著價格昂貴等缺點，具體操作可根據(jù)需求選用合適的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

4　結(jié)語

丁香酚麻醉劑因具有毒性低、效率高、成本低等特點被應(yīng)用于水產(chǎn)動物運輸環(huán)節(jié)，但是丁香酚殘留對水產(chǎn)品質(zhì)量和人體健康可能存在潛在危害。由于丁香酚殘留的毒性沒有持久性環(huán)境污染物和農(nóng)藥殘留危害大，相關(guān)的方法學(xué)研究還不夠豐富。建議進一步加強針對水產(chǎn)動物的運輸和暫養(yǎng)水體檢驗檢測方法的開發(fā)、實際樣品的檢測、麻醉機理的研究等。該研究為運輸環(huán)節(jié)的丁香酚合理使用提供了參考，對不同基質(zhì)樣品的檢驗檢測提供了借鑒方法，對檢測設(shè)備應(yīng)用和參數(shù)設(shè)置情況提供了理論支撐。通過有效利用串聯(lián)四級桿技術(shù)配合內(nèi)標(biāo)法與合適的前處理技術(shù)檢測水體基質(zhì)中丁香酚殘留，提高水產(chǎn)動物存活率、提升水產(chǎn)品的質(zhì)量、增加經(jīng)濟效益[40-42]。

表4　丁香酚殘留檢測常用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)及其質(zhì)譜參數(shù)Tab.4　Mass spectrometric acquisition parameters of the internal standard for measuring eugenol byGC/HPLC-MS/MS in SRM mode

注：*為定量離子。

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