韓　毅,于　艷,吳振起,王清華

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)中心,沈陽　110032;*通訊作者,E-mail:zhenqiwu@163.com)

清肺膏是由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院吳振起主任醫(yī)師新研制的外用制劑,處方以《溫病條辨》中宣白承氣湯為基礎(chǔ)加黃柏構(gòu)成,該方由大黃、石膏、苦杏仁、瓜蔞皮、黃柏五味中藥組成,該制劑具有清熱解毒宣肺、通腑泄熱通絡(luò)的作用,外敷背腧穴區(qū)治療兒童肺炎取得了較好的療效。為了有效控制清肺膏的質(zhì)量,以保證良好的治療效果,本試驗(yàn)采用薄層色譜法對(duì)清肺膏中的大黃[1,2]、瓜蔞皮、黃柏[3]進(jìn)行薄層色譜鑒別研究,采用高效液相色譜法對(duì)方中苦杏仁苷[4-6]含量進(jìn)行定量檢測(cè),為清肺膏的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1　儀器與試藥

1.1　實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1100系列高效液相色譜儀;E-240電子分析天平(上海梅特勒-托力多儀器有限公司);KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司);DZ-2BC型干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.2　試藥及試劑

苦杏仁苷對(duì)照品(含量測(cè)定用,批號(hào):110720-200404)、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品(鑒別用,批號(hào):110796-201113,110795-200605,110757-200206,110783-201113,110796-200615)、鹽酸黃柏堿對(duì)照品(鑒別用,批號(hào):111895-201202)大黃對(duì)照藥材(批號(hào):120902-200609)、黃柏對(duì)照藥材(批號(hào):121510-201105),均購自中國食品藥品檢定研究院;瓜蔞皮對(duì)照藥材(批號(hào):121185-201503),購自上海士峰生物科技有限公司;甲醇、乙腈(色譜純,Fisher公司),水為純凈水,其余試劑均為分析純;清肺膏(批號(hào):20160401,20160402,20160403,20170301,20170302,20170303),由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

2　方法與結(jié)果

2.1　大黃的薄層色譜鑒別

2.1.1供試品溶液的制備取清肺膏8 g,加甲醇25 ml攪拌均勻,超聲處理30 min,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)铀?0 ml使溶解,再加鹽酸2 ml,置電熱套中加熱回流30 min,冷卻,用乙醚振搖提取3次,每次15 ml,合并乙醚提取液,蒸干,殘?jiān)蛹状糽 ml使溶解,作為供試品溶液。

2.1.2對(duì)照藥材溶液的制備取大黃對(duì)照藥材0.2 g,按“2.1.1”項(xiàng)下方法制成對(duì)照藥材溶液。

2.1.3對(duì)照品溶液的制備分別取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品,加甲醇制成每l ml各含l mg的混合溶液,作為對(duì)照品溶液。

2.1.4陰性對(duì)照溶液的制備取除大黃外的陰性樣品,按供試品制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.1.5薄層色譜鑒別照2015版《中國藥典》四部(通則0502)及有關(guān)文獻(xiàn)試驗(yàn),吸取供試品、對(duì)照藥材、陰性對(duì)照溶液各10 μl,對(duì)照品溶液5 μl,分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上,以正己烷-甲酸乙酯-甲酸(30 ∶10 ∶0.5)為展開劑,展開,取出,晾干,置氨蒸氣中熏后,在日光下檢視。

2.1.6鑒別結(jié)果清肺膏供試品色譜中,在與大黃對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的5個(gè)紅色主斑點(diǎn);在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的紅色斑點(diǎn)(見圖1)。

1.清肺膏(批號(hào):20170301);2.清肺膏(批號(hào):20170302);3.清肺膏(批號(hào):20170303);4.大黃對(duì)照藥材溶液;5.混合對(duì)照品溶液;6.缺大黃的陰性對(duì)照溶液;a.大黃酚;b.大黃素甲醚;c.大黃素;d.大黃酸;e.蘆薈大黃素圖1　大黃薄層色譜鑒別Figure 1　Thin layer chromatogram of Rhei Radix Et Rhizoma

2.2　黃柏的薄層色譜鑒別

2.2.1供試品溶液的制備取清肺膏10 g,置錐形瓶中,加1%醋酸甲醇溶液30 ml,在60 ℃條件下,超聲處理30 min,濾過,濾液濃縮至1 ml,作為供試品溶液。

2.2.2對(duì)照藥材溶液的制備取0.1 g黃柏對(duì)照藥材,加1%醋酸甲醇溶液20 ml,同法制成對(duì)照藥材溶液。

2.2.3對(duì)照品溶液的制備取鹽酸黃柏堿對(duì)照品,加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。

2.2.4陰性對(duì)照溶液的制備取不含黃柏的藥材,按處方取其他藥材制備陰性樣品,按供試品制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.2.5薄層色譜鑒別照2015版《中國藥典》四部(通則0502)試驗(yàn),分別吸取供試品、對(duì)照藥材、陰性對(duì)照溶液各10 μl,鹽酸黃柏堿對(duì)照品溶液5 μl,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-甲醇-水(30 ∶15 ∶4)的下層溶液為展開劑,置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi),展開,取出,晾干,噴以稀碘化鉍鉀試液。

2.2.6鑒別結(jié)果清肺膏供試品色譜中,在與黃柏對(duì)照藥材色譜和鹽酸黃柏堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的橙黃色斑點(diǎn),陰性液位置無斑點(diǎn)干擾(見圖2)。

1.清肺膏(批號(hào):20170301);2.清肺膏(批號(hào):20170302);3.清肺膏(批號(hào):20170303);4.黃柏對(duì)照藥材溶液;5.鹽酸黃柏堿對(duì)照品溶液;6.缺黃柏的陰性對(duì)照溶液;a.鹽酸黃柏堿圖2　黃柏薄層色譜鑒別Figure 2　Thin layer chromatogram of Cortex Phellodendri

2.3　瓜蔞皮的薄層色譜鑒別

2.3.1供試品溶液的制備取清肺膏15 g,加乙醇30 ml,超聲處理15 min,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)蛹状? ml使溶解,作為供試品溶液。

2.3.2對(duì)照藥材溶液的制備取瓜蔞皮對(duì)照藥材2 g,加乙醇20 ml,同上法制成對(duì)照藥材溶液。

2.3.3陰性對(duì)照溶液的制備取不含瓜蔞皮的藥材,按處方取其他藥材制備陰性樣品,按供試品制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3.4薄層色譜鑒別照2015版《中國藥典》四部(通則0502)試驗(yàn),吸取供試品、陰性對(duì)照液溶液各10 μl,瓜蔞皮對(duì)照藥材溶液5 μl,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(60-90 ℃)-乙酸乙酯(4 ∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%香草醛硫酸溶液,加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

2.3.5鑒別結(jié)果清肺膏供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性液位置無干擾出現(xiàn)(見圖3)。

1.清肺膏(批號(hào):20170301);2.清肺膏(批號(hào):20170302);3.清肺膏(批號(hào):20170303);4.瓜蔞皮對(duì)照藥材溶液;5.缺瓜蔞皮的陰性對(duì)照溶液圖3　瓜蔞皮薄層色譜圖Figure 3　Thin layer chromatogram of Pericarpium Trichosanthis

2.4　苦杏仁苷含量測(cè)定[7]

2.4.1色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱:采用Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),苦杏仁苷色譜峰可基線分離;紫外全程掃描,確定苦杏仁苷在210 nm處有最大吸收,故選擇210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng);以乙腈-0.05%磷酸水溶液(20 ∶80)為流動(dòng)相,色譜圖顯示苦杏仁苷色譜峰保留時(shí)間適宜,與其他色譜峰分離度大于1.5,理論塔板數(shù)按苦杏仁苷峰計(jì)不得低于7 000。

2.4.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取苦杏仁苷對(duì)照品13.06 mg,置10 ml棕色容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得質(zhì)量濃度為每1 ml含1.306 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1.5 ml,置10 ml棕色容量瓶中,加甲醇制成每1 ml含0.196 mg的溶液,搖勻,即得。

2.4.3供試品溶液的制備取本品約0.25 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇20 ml,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,加甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,作為供試品溶液。

2.4.4陰性液干擾試驗(yàn)取方中除苦杏仁外的各藥材,按供試品項(xiàng)下方法制備成缺苦杏仁陰性液。精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性液各5 μl,注入液相色譜儀,繪制液相色譜圖,結(jié)果在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰,陰性液在此峰位無吸收(見圖4)。

圖4　清肺膏中苦杏仁苷HPLC圖Figure 4　High performance liquid chromatogram of amygdalin in Qingfei paste

2.4.5含量測(cè)定方法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 μl,注入高效液相色譜儀,測(cè)定,即得。

2.4.6線性范圍考察分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1,0.5,1.0,1.5,2.0,3.0 ml,置于10 ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,制成質(zhì)量濃度分別為1 ml含13.06,65.30,130.60,195.90,261.20,391.80 μg的系列對(duì)照品溶液。精密吸取上述對(duì)照品溶液各5 μl,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積,以質(zhì)量濃度(x,μg/ml)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo),得苦杏仁苷的回歸方程為y=639.45x-2.764,r=0.999 9,結(jié)果表明,苦杏仁苷在13.06-391.80 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.7檢測(cè)限與定量限考察取“2.4.2”項(xiàng)下苦杏仁苷對(duì)照品溶液,逐步稀釋后進(jìn)樣,記錄峰面積。當(dāng)信噪比分別為3 ∶1和10 ∶1時(shí),測(cè)得檢測(cè)限和定量限。試驗(yàn)結(jié)果,苦杏仁苷的檢測(cè)限和定量分別為0.13,2.61 μg/ml。

精密度試驗(yàn):精密吸取對(duì)照品溶液5 μl,連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果峰面積值的RSD為0.61%,表明儀器精密度較高。

2.4.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取供試品6份,按“2.4.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液,按“2.4.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果苦杏仁苷平均含量為1.53 mg/g,峰面積的RSD為1.63%,表明本方法重復(fù)性較好。

2.4.9穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液,分別于制備后0,2,4,6,8,10,12 h依“2.4.1”法進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果12 h內(nèi)苦杏仁苷峰面積值的RSD為1.28%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4.10加樣回收率試驗(yàn)分別稱取6份已知含量的供試品0.125 g,精密稱定,精密加入苦杏仁苷對(duì)照品溶液1.0 ml(相當(dāng)于苦杏仁苷0.196 mg),按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1苦杏仁苷回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

Table1ResultsofrecoverytestofamygdalininQingfeipaste(n=6)

序號(hào)稱樣量(g)樣品中量(mg)加入量(mg)測(cè)得量(mg)回收率(%)平均(%)RSD(%)1013180201701960396399292012970198401960388997193013170201501960391496899755109401279019570196038849832501263019320196038219638601276019520196038589724

2.4.11樣品含量測(cè)定取6批樣品(批號(hào):20160401,20160402,20160403,20170301,20170302,20170303),按上述“2.4.2”和“2.4.3”項(xiàng)下方法分別制備對(duì)照品溶液和供試品溶液,依法進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果6批樣品中苦杏仁苷的含量分別為1.56,1.50,1.49,1.48,1.51,1.53 mg/g,平均含量為1.51 mg/g。

3　討論

本制劑中大黃、黃柏及瓜蔞皮的薄層鑒別方法參照2015版《中國藥典》[8]一部及有關(guān)文獻(xiàn)資料,在對(duì)大黃的薄層色譜研究中,采用藥典鑒別方法,吸取供試品、對(duì)照藥材、陰性對(duì)照溶液各10 μl,對(duì)照品溶液5 μl,分別點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上,以石油醚(30-60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15 ∶5 ∶1)的上層溶液為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視,結(jié)果在紫外光燈下觀察及在氨蒸氣中熏后,在日光下檢視,斑點(diǎn)均不清晰。后改用正己烷-甲酸乙酯-甲酸(30 ∶10 ∶0.5)為展開劑,展開,取出,晾干,置氨蒸氣中熏后,在日光下檢視,薄層斑點(diǎn)更加清晰。

在測(cè)定苦杏仁苷的成分含量時(shí),預(yù)試驗(yàn)曾采用甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液及甲醇-0.2%磷酸溶液以不同比例為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫,結(jié)果兩個(gè)組分無法達(dá)到基線分離,后改用乙腈-0.05%磷酸溶液(20 ∶80)洗脫后,得到較好的分離效果。

本實(shí)驗(yàn)所建立的薄層色譜法能快速、準(zhǔn)確地鑒別出清肺膏中的大黃、黃柏及瓜蔞皮,其鑒別方法簡(jiǎn)便實(shí)用,薄層斑點(diǎn)清晰度高,分離度好。高效液相色譜法測(cè)定清肺膏方中苦杏仁苷的含量,結(jié)果測(cè)定方法準(zhǔn)確,線性關(guān)系和重現(xiàn)性好。上述研究可作為清肺膏的質(zhì)量控制方法。

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