毛萬里,趙　英,王　彬,張好春,王　斌,胡攀攀

(1重慶市永川區(qū)人民醫(yī)院急診科,重慶　402160;2重慶市永川區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科;3重慶鋼鐵集團(tuán)總醫(yī)院神經(jīng)外科;4重慶市永川區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科;5重慶市大坪醫(yī)院腫瘤中心;*通訊作者,E-mail:cqycmjx@sina.com)

膀胱癌約占癌癥相關(guān)死亡的3%,是男性癌癥相關(guān)死亡的第九大常見原因[1]。盡管針對膀胱癌的治療有手術(shù)治療、放射治療和化療等多種療法,但膀胱癌的5年生存率仍較低[2]。微小RNA(miRNA)是一類長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子,miRNA表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3]。miRNA為靶點(diǎn)的基因治療日益成為膀胱癌治療研究的重點(diǎn)[4]。miR-27a-3p是近年來研究發(fā)現(xiàn)的具有抑制肝癌、鼻咽癌、骨肉瘤等多種腫瘤生物學(xué)行為的小分子RNA[5-7],但其在膀胱癌細(xì)胞中的作用尚不明了。本研究觀察過表達(dá)miR-27a-3p對膀胱癌細(xì)胞生長的影響,探討其可能的分子機(jī)制,為以miR-27a-3p為靶點(diǎn)的基因治療提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　細(xì)胞株及主要試劑

膀胱癌細(xì)胞株EJ和5637購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心;miR-27a-3p mimics、miR-NC購于廣州市銳博生物科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司;lipofectamine 2000、細(xì)胞周期試劑盒購于美國Invitrogen公司;噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;熒光定量PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司;一抗KRAS、p-Raf-1、p-MEK、p-ERK和β-Actin均購于美國BD公司。

1.2　細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞EJ和5637,培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2飽和濕度,取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為兩組:miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)和miR-27a-3p組(轉(zhuǎn)染miR-27a-3p),根據(jù)lipofectamine 3000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3　MTT檢測細(xì)胞增殖活性

將轉(zhuǎn)染后24 h的EJ和5637細(xì)胞按3 000個(gè)/孔接種于96孔板,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別于第1,2,3,4,5天,使用MTT試劑盒檢測細(xì)胞增殖活性。具體操作如下:在檢測前每孔先加入20 μl 5 g/L的MTT溶液,培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸去培養(yǎng)液,每孔加入150 μl二甲基亞砜,振蕩15 min,酶標(biāo)儀讀取各孔在490 nm波長處所對應(yīng)的吸光度A值。

1.4　集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力

轉(zhuǎn)染后24 h,消化收集EJ和5637細(xì)胞,按1 000個(gè)/孔接種于6孔板。連續(xù)培養(yǎng)10 d,甲醇10 min,0.5%的結(jié)晶紫溶液染色30 min,清水緩慢吸去多余染液,晾干后每孔取4個(gè)視野計(jì)數(shù)集落數(shù)取平均值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.5　流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布

轉(zhuǎn)染后48 h,消化收集EJ和5637細(xì)胞,使用細(xì)胞周期試劑盒檢測細(xì)胞周期分布。具體操作如下:預(yù)冷的PBS溶液洗3次,離心后用預(yù)冷的70%乙醇溶液重懸細(xì)胞,4 ℃固定3 h,PBS溶液洗3次,加入100 mg/L RNase A在37 ℃水浴30 min,加入含50 mg/L碘化丙啶溶液的PBS溶液500 μl,4 ℃避光孵育30 min,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布。

1.6　miR-27a-3p靶基因預(yù)測

參考文獻(xiàn)[8]及使用miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站TargetScanHuman 6.2(http://www.targetscan.org/vert-61/)預(yù)測miR-27a-3p的靶基因?yàn)镵RAS,miR-27a-3p與KRAS序列互補(bǔ)結(jié)合區(qū)域見圖1。

圖1TargetScanHuman 6.2基因預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測miR-27a-3p靶基因
Figure 1TargetScanHuman 6.2 gene prediction website predicts miR-27a-3p target gene

1.7　qRT-PCR檢測KRAS mRNA表達(dá)

提取轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以GAPDH為內(nèi)參,使用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測,PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃ 60 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。最終Ct值均以2-ΔΔCt分析。GAPDH引物序列:上游5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。KRAS引物序列:上游5′-ACAGAGAGTGGAGGATGCTTT-3′,下游5′-TTTCACACAGCCAGGAGTCTT-3′。

1.8　Western blot檢測KRAS蛋白及下游靶蛋白表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染后48 h EJ和5637細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,每組分別取30 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳,轉(zhuǎn)至NC膜,脫脂牛奶封閉,一抗、二抗孵育,滴加顯影劑顯影。

1.9　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　過表達(dá)miR-27a-3p對膀胱癌細(xì)胞增殖能力的影響

MTT法檢測細(xì)胞增殖能力結(jié)果顯示,在第5天,miR-NC組和miR-27a-3p組EJ細(xì)胞的吸光度A值分別為1.53±0.13和1.00±0.09(t=3.32,P=0.03),5637細(xì)胞的吸光度A值分別為1.42±0.09和0.93±0.09(t=3.999,P=0.016),轉(zhuǎn)染miR-27a-3p組的膀胱癌細(xì)胞吸光度明顯低于miR-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。該結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-27a-3p的EJ和5637細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制。

與miR-NC比較,*P<0.05圖2　MTT法檢測miR-27a-3p對膀胱癌細(xì)胞增殖能力的影響Figure 2　Effect of miR-27a-3p on the proliferation of bladder cancer cells by MTT assay

2.2　過表達(dá)miR-27a-3p對膀胱癌細(xì)胞集落形成能力的影響

集落形成實(shí)驗(yàn)顯示,miR-NC組和miR-27a-3p組EJ細(xì)胞形成的集落數(shù)分別為159.20±16.83和53.56±10.92(t=5.267,P=0.002),5637細(xì)胞形成的集落數(shù)分別為194.90±11.52和114.10±18.88(t=3.653,P=0.011)。與miR-NC組相比,過表達(dá)miR-27a-3p的膀胱癌細(xì)胞形成的集落數(shù)顯著減少(P<0.05,見圖3),提示過表達(dá)miR-27a-3p后膀胱癌細(xì)胞增殖能力被抑制。

2.3　過表達(dá)miR-27a-3p對膀胱癌細(xì)胞周期分布的影響

流式細(xì)胞術(shù)顯示,miR-27a-3p組中G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于miR-NC組(P<0.01),S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯低于對照組(P<0.05,見表1,圖4),表明miR-27a-3p可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞周期的進(jìn)展。

細(xì)胞　分組　G0/G1　　S　G2/MEJmiR?NC4004±3243330±3992667±085miR?27a?3p6329±798??2404±360?1267±466??5637miR?NC4924±5792634±3902442±220miR?27a?3p6843±721??1802±289?1356±510??

與miR-NC比較,*P<0.05,**P<0.01

圖3　miR-27a-3p對膀胱癌細(xì)胞集落形成能力的影響Figure 3　Effect of miR-27a-3p on colony forming ability of bladder cancer cells

圖4　miR-27a-3p對膀胱癌細(xì)胞周期的影響Figure 4　Effect of miR-27a-3p on cell cycle of bladder cancer cells

2.4　過表達(dá)miR-27a-3p對膀胱癌細(xì)胞中KRAS mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示,miR-NC組和miR-27a-3p組EJ細(xì)胞中KRAS mRNA相對表達(dá)量分別為1.02±0.11和0.32±0.09(t=4.812,P=0.003),5637細(xì)胞中KRAS mRNA相對表達(dá)量分別為1.00±0.03和0.18±0.02(t=24.160,P<0.001)。miR-27a-3p中KRAS mRNA相對表達(dá)量明顯低于miR-NC組(P<0.01,見圖5),表明miR-27a-3p具有抑制KRAS mRNA表達(dá)的作用。

2.5　過表達(dá)miR-27a-3p對膀胱癌細(xì)胞KRAS蛋白及下游蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,與miR-NC組相比,miR-27a-3p組中KRAS及下游蛋白p-Raf-1、p-MEK、p-ERK的表達(dá)明顯降低(見圖6),表明miR-27a-3p具有抑制KRAS蛋白及下游蛋白表達(dá)的作用。

與miR-NC比較,**P<0.01圖5　qRT-PCR檢測KRAS mRNA表達(dá)情況Figure 5　KRAS mRNA expression in bladder cancer cells after miR-27a-3p overexpression by qRT-PCR

圖6　Western blot檢測KRAS及下游蛋白表達(dá)情況Figure 6　Expression of KRAS and downstream proteins in bladder cancer cells after miR-27a-3p overexpression by Western blot

3　討論

miRNA是一類內(nèi)源性的非編碼RNA,通過特異性結(jié)合于基因mRNA的3′UTR區(qū)域發(fā)揮干擾基因表達(dá)的作用[4,9]。miR-27a-3p參與多種疾病包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。miR-27a-3p可通過干擾SFRP1基因的表達(dá)調(diào)控Wnt/beta-catenin信號通路,抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[10]。miR-27a-3p能抑制人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中BTS2基因的表達(dá),并顯著抑制其生長和遷移[11]。也有研究表明,miR-27a-3p促進(jìn)腫瘤的生長,miR-27a-3p可通過抑制PPAR-γ基因的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[12]。miR-27a-3p也可促進(jìn)靶基因的表達(dá),如miR-27a-3p可導(dǎo)致宮頸癌中B4GALT3基因的表達(dá)增加,促進(jìn)EMT過程的發(fā)生,提升宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[3]。然而,miR-27a-3p在膀胱癌中的作用研究尚未明了。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí),轉(zhuǎn)染miR-27a-3p后的膀胱癌細(xì)胞的增殖能力降低,細(xì)胞周期進(jìn)展阻滯,提示過表達(dá)miR-27a-3p具有抑制膀胱癌細(xì)胞增殖的作用。本研究參考文獻(xiàn)[8]及miRNA-mRNA基因預(yù)測網(wǎng)站TargetScanHuman 6.2認(rèn)為miR-27a-3p可能通過抑制KRAS發(fā)揮作用。膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展受多種基因的調(diào)控,KRAS是被普遍認(rèn)為的一種癌基因,與膀胱癌的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為密切相關(guān)[13]。因而,通過阻斷KRAS基因的表達(dá),可能會(huì)抑制膀胱癌細(xì)胞的生長。本研究證實(shí),過表達(dá)miR-27a-3p可明顯抑制KRAS基因的表達(dá)。KRAS參與調(diào)控MAPK信號通路的傳導(dǎo),MAPK信號通路與腫瘤的增殖、分化、凋亡和衰老等生物學(xué)行為密切相關(guān),參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,在多數(shù)腫瘤中均發(fā)現(xiàn)該信號通路的異常[14]。本研究結(jié)果表明,過表達(dá)miR-27a-3p下調(diào)KRAS基因的表達(dá)后,p-Raf-1、p-MEK、p-ERK蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào),表明MAPK信號通路的異常傳導(dǎo)被抑制。由此可知,miR-27a-3p抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖可能是通過抑制KRAS基因的表達(dá),進(jìn)一步干擾MAPK信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。有研究表明,MAPK信號通路與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15],miR-27a-3p是否可通過阻斷MAPK信號通路抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力是本研究下一步研究的重點(diǎn)。

綜上所述,本研究證實(shí)miR-27a-3p可明顯抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖能力,其可能的分子機(jī)制為miR-27a-3p抑制KRAS蛋白的表達(dá),進(jìn)而阻斷MAPK信號通路的傳導(dǎo)，為未來miRNA靶向治療膀胱癌提供了有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Sankin A, Narasimhulu D, John P,etal. The expanding repertoire of targets for immune checkpoint inhibition in bladder cancer: What lies beneath the tip of the iceberg, PD-L1[J].Urol Oncol,2017,pii:S1078-1439(17)30176-X.

[2]Pinto IG. Systemic therapy in bladder cancer[J]. Indian J Urol, 2017, 33(2):118-126.

[3]Sun Y, Yang X, Liu M,etal. B4GALT3 up-regulation by miR-27a contributes to the oncogenic activity in human cervical cancer cells[J]. Cancer Lett, 2016, 375(2):284-292.

[4]Mitash N, Tiwari S, Agnihotri S,etal. Bladder cancer: Micro RNAs as biomolecules for prognostication and surveillance[J]. Indian J Urol, 2017, 33(2):127-133.

[5]Zhao N, Sun H, Sun B,etal. miR-27a-3p suppresses tumor metastasis and VM by down-regulating VE-cadherin expression and inhibiting EMT: an essential role for Twist-1 in HCC[J]. Sci Rep, 2016, 6:23091.

[6]Li L, Luo Z. Dysregulated miR-27a-3p promotes nasopharyngeal carcinoma cell proliferation and migration by targeting Mapk10[J]. Oncol Rep, 2017, 37(5):2679-2687.

[7]Salah Z, Arafeh R, Maximov V,etal. miR-27a and miR-27a* contribute to metastatic properties of osteosarcoma cells[J]. Oncotarget, 2015, 6(7):4920-4935.

[8]Zhu L, Wang Z, Fan Q,etal. microRNA-27a functions as a tumor suppressor in esophageal squamous cell carcinoma by targeting KRAS[J]. Oncol Rep, 2014, 31(1):280-286.

[9]Keklikoglou I, Hosaka K, Bender C,etal. MicroRNA-206 functions as a pleiotropic modulator of cell proliferation, invasion and lymphangiogenesis in pancreatic adenocarcinoma by targeting ANXA2 and KRAS genes[J]. Oncogene,2015,34(37):4867-4878.

[10]Wang K, Xie D, Xie J,etal. MiR-27a regulates Wnt/beta-catenin signaling through targeting SFRP1 in glioma[J]. Neuroreport, 2015, 26(12):695-702.

[11]Li WQ, Yu HY, Zhong NZ,etal. miR27a suppresses the clonogenic growth and migration of human glioblastoma multiforme cells by targeting BTG2[J]. Int J Oncol, 2015, 46(4):1601-1608.

[12]Li S, Li J, Fei BY,etal. MiR-27a promotes hepatocellular carcinoma cell proliferation through suppression of its target gene peroxisome proliferator-activated receptor gamma[J]. Chin Med J (Engl), 2015, 128(7):941-947.

[13]Ouerhani S, Bougatef K, Soltani I,etal. The prevalence and prognostic significance of KRAS mutation in bladder cancer, chronic myeloid leukemia and colorectal cancer[J]. Mol Biol Rep, 2013, 40(6):4109-4114.

[14]Burotto M, Chiou VL, Lee JM,etal. The MAPK pathway across different malignancies: a new perspective[J]. Cancer, 2014, 120(22):3446-3456.

[15]Sun Y, Liu WZ, Liu T,etal. Signaling pathway of MAPK/ERK in cell proliferation, differentiation, migration, senescence and apoptosis[J]. J Recept Signal Transduct Res, 2015, 35(6):600-604.