張 　妍 張小強(qiáng)* 梁曉瑜王 　旭 劉 　靜

（1. 東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇　南京　210009；2. 東南大學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 　南 京 　210009）

原花青素(proanthocyanidin，PC)是一類黃烷醇單體及其聚合體形成的多酚類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜、樹皮中。原花青素生物學(xué)功能豐富，具有較強(qiáng)的抗氧化和清除自由基[1]、 抗炎[2]、 神經(jīng)保護(hù)[3]等功能，且其在人體內(nèi)的生物活性很高，作用安全可靠，廣泛應(yīng)用于食品、保健、醫(yī)療等領(lǐng)域。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類固有免疫細(xì)胞。當(dāng)大腦受到外界環(huán)境刺激時(shí)，靜息的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)被迅速激活，持續(xù)釋放腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)、一氧化氮等細(xì)胞毒性分子，引發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)并損傷周圍神經(jīng)元。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性桿菌胞壁外膜層的重要組分[4]。

Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)是一類天然免疫受體，在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較為廣泛。其中TLR4作為TLR家族中的重要成員，是介導(dǎo)脂多糖應(yīng)答的最主要受體。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)是絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路之一，在炎癥反應(yīng)和眾多神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用。研究表明，LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞可引起TLR4/p38 MAPK信號(hào)通路的活化并釋放炎性細(xì)胞因子[5]。目前原花青素的研究主要集中于抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生促炎性因子的形態(tài)學(xué)研究上[6]，缺乏機(jī)制學(xué)研究。本研究利用LPS激活小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞(BV2細(xì)胞)構(gòu)建體外炎癥模型，原花青素進(jìn)行干預(yù)，探討原花青素抑制LPS激活 BV2細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　藥品與試劑

BV2細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；原花青素，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LPS(E. coli O55：B5)、四甲基噻唑藍(lán)(thiazolyl blue，MTT)均購自Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購于HyClone公司；胎牛血清購自Clarkbio公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液購自Gibco公司；NO檢測(cè)試劑盒(S0021)、BCA蛋白濃度試劑盒(P0010)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒均購于南京森貝伽生物科技有限公司；TLR4、p38、p-p38及actin一抗和二抗、免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自Santa Cruz公司。

1.2　主要儀器

Series 8000恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo Scientific公司，IX51倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司，5417R高速冷凍離心機(jī)購自Eppendorf AG公司，RT-6000酶標(biāo)分析儀購自Rayto公司。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) BV2細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，于CO2體積分?jǐn)?shù)5%的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天更換1次培養(yǎng)基，每2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2Griess法測(cè)定NO水平 LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞活化，構(gòu)建體外炎癥損傷模型。BV2細(xì)胞以1×105/mL 的密度接種于24孔板，每孔800 μL。待細(xì)胞貼壁后，設(shè)立對(duì)照組 、 LPS(0.01、0.1、 1.0、10.0和20.0 μg/mL)組。LPS刺激BV2細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞上清，按試劑盒說明書操作，測(cè)定吸光度D(540)值。樣品中NO含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，由此確定并驗(yàn)證LPS的造模濃度。

1.3.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 BV2細(xì)胞以1×104/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL。待細(xì)胞貼壁后，設(shè)調(diào)零組、對(duì)照組、LPS(1.0 μg/mL)組、原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0 μg/mL)組、LPS(1.0 μg/mL)+原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0 μg/mL)組。調(diào)零組不含細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，原花青素比LPS預(yù)先1 h加入。孵育24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，繼續(xù)孵育4 h后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度D(570)值，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

1.3.4ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-1β、IL-6水平BV2細(xì)胞以5×104/mL的密度接種于24孔板中，每孔500 μL。待細(xì)胞貼壁后，設(shè)對(duì)照組、1.0 μg/mL LPS組和1.0 μg/mL LPS+不同濃度(0.1、0.5、2.5、10.0 μg/mL)原花青素組，孵育24 h后收集上清。具體操作按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度D(450)值。樣品中TNF-α、IL-1β、IL-6含量根據(jù)各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

1.3.5Western blot檢測(cè) BV2細(xì)胞以每皿1×106個(gè)接種于6 cm培養(yǎng)皿中，分組同1.3.4。PC提前1 h加入，加入LPS作用1 h后，收集細(xì)胞，用RIPA裂解液提取蛋白。高速低溫離心機(jī)4 ℃、12 000 g離心5 min，取上清液，以碧云天BCA蛋白濃度試劑盒對(duì)蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。取適量蛋白進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗4℃封閉過夜。TBST洗膜8次，每次5 min。二抗室溫孵育2 h，TBST再次洗膜8次，每次5 min。然后加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行顯影、定影，并用Image J軟件對(duì)成像結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)　果

2.1　LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥損傷模型的建立

不同濃度LPS對(duì)BV2細(xì)胞釋放NO影響的結(jié)果如圖1所示。與對(duì)照組相比，0.1、1.0、10.0、20.0 μg/mL LPS均可增加BV2釋放NO水平(p＜0.05)，且隨LPS濃度增大而增加。為確保炎癥損傷模型建模成功，同時(shí)減少LPS對(duì)細(xì)胞不良影響，結(jié)合文獻(xiàn)選擇1.0 μg/mL LPS染毒BV2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1　不同濃度LPS對(duì)BV2細(xì)胞釋放NO的影響

2.2　原花青素及LPS對(duì)BV2細(xì)胞活性的影響

如圖2所示。與對(duì)照組相比，0.1、0.5、2.5、10.0 μg/mL原花青素單獨(dú)作用或與1.0 μg/mL的LPS共同作用，對(duì)BV2細(xì)胞存活率的影響差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。該結(jié)果表明在實(shí)驗(yàn)所用劑量范圍內(nèi)，原花青素對(duì)靜息狀態(tài)或1.0 μg/mL LPS激活狀態(tài)下的BV2細(xì)胞未產(chǎn)生毒性作用。

圖2　原花青素及LPS對(duì)BV2細(xì)胞活性的影響

2.3　原花青素抑制LPS激活BV2細(xì)胞釋放炎性因子

ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度的結(jié)果如表1所示。與對(duì)照組相比，LPS(1.0 μg/mL)處理BV2細(xì)胞后TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放水平明顯增加(p＜0.05)。與1.0 μg/mL LPS組相比，不同濃度(0.1、0.5、2.5、10.0 μg/mL)的原花青素預(yù)處理使TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度顯著降低且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系(r值依次為0.735，0.604，0.736，P均＜0.05)。

表1　原花青素對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β和IL-6的影響(s)

表1　原花青素對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β和IL-6的影響(s)

與對(duì)照組比較，*p＜0.05；與1.0 μg/mL LPS組比較，#p＜0.05.

組別 TNF-α/(ng/L)IL-1β/(ng/L) IL-6/(pg/mL)對(duì)照組 #257.1±17.9 #77.2±12.5 #85.3±10.8 1.0 μg/mL LPS組 *665.4±90.1 *143.0±8.6 *157.3±29.3 LPS+0.1 μg/mL PC組 #128.0±11.5 LPS+0.5 μg/mL PC組 #*506.6±85.4 #*120.2±13.8 #**429.0±44.6 #*108.0±16.2 117.5±11.2*#LPS+2.5 μg/mL PC組 #368.5±69.4 #103.7±15.2 #103.7±11.1*LPS+10 μg/mL PC組 #289.3±66.8 #91.8±6.5 #91.9±12.1

2.4　原花青素對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞p38蛋白磷酸化的影響

采用Western blot法檢測(cè)原花青素對(duì)p38 MAPK通路的影響，結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組比較，給予LPS(1.0 μg/mL)刺激，BV2細(xì)胞p-p38蛋白表達(dá)升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。與1.0 μg/mL LPS組相比，原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0 μg/mL)預(yù)處理BV2細(xì)胞，p-p38蛋白表達(dá)下調(diào)(p＜0.05)，且磷酸化水平呈劑量依賴性降低(r=0.710，p＜0.05)。

圖3　原花青素對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞p38蛋白磷酸化的影響

2.5　原花青素對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot法檢測(cè)原花青素對(duì)TLR4受體表達(dá)水平的影響，結(jié)果如圖4所示。與對(duì)照組相比，LPS刺激BV2細(xì)胞后TLR4蛋白表達(dá)顯著升高(p＜0.05)。與1.0 μg/mL LPS處理組相比，原花青素(0.1、0.5、2.5、10.0 μg/mL)干預(yù)BV2細(xì)胞后，TLR4蛋白表達(dá)水平下調(diào)且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系(r=0.732，p＜0.05)。

3　討論

圖4　原花青素對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)的影響

近年來神經(jīng)免疫炎癥機(jī)制在神經(jīng)退行性疾病中的作用受到普遍關(guān)注。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的固有免疫細(xì)胞，是神經(jīng)炎癥的重要參與者，在大腦的炎癥反應(yīng)中起最為關(guān)鍵的作用[7]。當(dāng)大腦受到外界環(huán)境刺激時(shí)，靜息的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)被迅速激活為“阿米巴樣”，持續(xù)釋放腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、一氧化氮等炎癥介質(zhì)，還可釋放活性氧、谷氨酸、趨化細(xì)胞因子等細(xì)胞毒性分子，這些細(xì)胞因子大量累積可導(dǎo)致局部細(xì)胞生存環(huán)境惡化，引發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)并損傷周圍神經(jīng)元[8]。受損的神經(jīng)元反過來又會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，從而形成一個(gè)惡性循環(huán)的病理過程，導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變持續(xù)進(jìn)展。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化有望成為緩解帕金森病等神經(jīng)退行性疾病進(jìn)程的有效手段。

本研究首先利用LPS建立體外炎癥模型，通過Griess法測(cè)定NO濃度選定LPS 1 μg/mL作為造模濃度，原花青素干預(yù)，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)炎癥因子分泌水平，結(jié)果表明原花青素可呈劑量依賴性抑制LPS激活BV2細(xì)胞釋放的TNF-α、IL-1β、IL-6炎性因子。因此，原花青素可對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化引起的炎癥因子分泌水平升高起到一定緩解作用。

在小膠質(zhì)細(xì)胞中，NF-κB信號(hào)通路是介導(dǎo)炎癥的經(jīng)典通路。我們前期研究已經(jīng)證實(shí)，原花青素可通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化，抑制炎癥介質(zhì)的釋放，從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化[9]。但NF-κB途徑還需要與其他信號(hào)通路相互協(xié)調(diào)作用，比如受MAPK信號(hào)通路的調(diào)控，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)。

p38 MAPK信號(hào)通路是MAPK信號(hào)通路中的一條重要通路，與炎性反應(yīng)調(diào)控密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)LPS等促炎因子刺激可通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞中p38 MAPK通路，誘導(dǎo)NF-κB通路激活，引起小膠質(zhì)細(xì)胞活化，從而釋放炎性因子[10-12]。大量文獻(xiàn)表明藥物通過抑制p38 MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。因此，我們研究在LPS激活的BV2細(xì)胞中原花青素是否可以通過抑制p38 MAPK信號(hào)通路的磷酸化激活從而發(fā)揮其抗神經(jīng)炎癥的作用。本研究證實(shí)，LPS顯著上調(diào)了p38 MAPK的磷酸化水平，而原花青素干預(yù)可顯著降低p-p38蛋白表達(dá)，且隨濃度增大抑制作用越明顯，說明p38 MAPK信號(hào)通路在原花青素抑制脂多糖激活神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子過程中發(fā)揮重要作用，這一結(jié)論與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[13-14]。

TLR4是引起機(jī)體炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子，在小膠質(zhì)細(xì)胞活化引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)中至關(guān)重要。研究表明LPS可被小膠質(zhì)細(xì)胞膜上TLR4受體識(shí)別，觸發(fā)MAPK[15-16]和 NF-κB[17-18]通路，從而啟動(dòng)促炎因子等多種基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。本研究采用Western blot檢測(cè)表明LPS可顯著上調(diào)TLR4蛋白表達(dá)，原花青素干預(yù)BV2細(xì)胞后，TLR4蛋白表達(dá)較LPS刺激組明顯下降，提示原花青素可能通過TLR4通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化釋放的炎性因子。這一結(jié)論與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[19-20]。

綜上所述，原花青素可通過TLR4/p38 MAPK信號(hào)通路抑制脂多糖激活神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞，抑制炎癥因子的分泌，從而為研究原花青素預(yù)防和延緩神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展提供了理論依據(jù)。

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