劉 　芳 王轉(zhuǎn)子 * 魏 　巍李文建黨秉榮

（1. 中國科學(xué)院近代物理研究所，甘肅　蘭州　730000；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 　100049）

高傳能線密度(linear energy transfer，LET)重離子射線具有常規(guī)射線(低LET射線)不可比擬的物理學(xué)和生物學(xué)優(yōu)勢，在癌癥放射治療領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注[1-3]。但與低LET射線放療一樣，高LET射線在殺死癌細(xì)胞的同時也會對周圍正常組織造成損傷。同時，隨著載人航天技術(shù)的不斷發(fā)展，空間輻射尤其是空間重離子輻射對宇航員健康安全的影響日益受到重視[4]。

骨髓是造血的主要部位和外周血細(xì)胞分化的主要場所，對電離輻射高度敏感。僅0.1 Gy的X射線輻照就會造成BALB/c和C57BL/6小鼠的網(wǎng)織紅細(xì)胞產(chǎn)生明顯的微核[5]。骨髓抑制是放療過程中最常見的副作用，也是中/高劑量全身輻射后機(jī)體死亡和發(fā)病的主要原因[6]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠受γ射線或鐵離子輻照后患急性髓系白血病的機(jī)率顯著增加[7]。電離輻射還會導(dǎo)致小鼠造血干/祖細(xì)胞急性和長期損傷，嚴(yán)重影響造血功能[8]。造血系統(tǒng)的輻射損傷不僅會影響機(jī)體造血功能的正常進(jìn)行，降低機(jī)體的輻射耐受性，并增加二次癌癥的患病幾率以及其他健康風(fēng)險，而且嚴(yán)重時更會影響到其他重要器官的功能，甚至?xí){生命。因此深入研究電離輻射對造血系統(tǒng)的損傷具有十分重要的意義。低LET射線輻射對骨髓造血影響的研究較多，但由于受實(shí)驗(yàn)裝置的限制，重離子輻射對骨髓造血損傷的相關(guān)研究相對缺乏。本研究擬利用蘭州重離子加速器(HIRFL)提供的碳離子束對小鼠進(jìn)行全身輻照，探討碳離子輻射對小鼠造血系統(tǒng)的損傷及其損傷后隨時間的恢復(fù)情況，為重離子輻射在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用以及研究空間重離子輻射的防護(hù)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動物

BALB/c雌鼠120只，SPF級，8～10周齡，體質(zhì)量(18±2) g，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號為：SCXK(甘)2015-001。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組與輻照 將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為對照組和不同劑量(0.5、1、4、6 Gy)輻照組，每組24只。除對照組外，其余各組均在室溫下進(jìn)行12C6+重離子一次性全身照射，不同劑量組每只小鼠的輻照時間分別為0.5、1、4、6 min。碳離子束由蘭州重離子加速器(heavy iron research facility in Lanzhou，HIRFL)裝置提供，能量為80 MeV/u，傳能線密度為31.6 KeV/μm，劑量率為1 G y/min。

1.2.2骨髓單核細(xì)胞DNA損傷檢測 輻照后第1、3、8天，每組各取8只小鼠，收集雙側(cè)股骨，用PBS緩沖液(含0.1%肝素鈉)沖洗骨髓以獲取骨髓細(xì)胞，骨髓細(xì)胞經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂紅得到骨髓單核細(xì)胞。再用堿性彗星電泳方法檢測小鼠骨髓單核細(xì)胞DNA損傷情況[9]。 取上述單核細(xì)胞約1×104個，加入37 ℃溫浴的1%低熔點(diǎn)瓊脂糖120 μL，迅速混勻后滴加于預(yù)先涂布過1%正常熔點(diǎn)瓊脂糖的載玻片上，蓋上蓋玻片使其固化。移去蓋玻片后放入堿性裂解液(2.225 mol/L NaCl、89 mmol/L EDTA·2Na、8.9 mmol/L Tris、10% DMSO、1% Triton X-100、1%十二烷基肌氨酸鈉，用NaOH調(diào)節(jié)pH至10)，4 ℃下裂解2 h后，在堿性電泳緩沖液(0.3 mol/L NaOH、1 mmol/L EDTA·2Na)中解旋25 min，換新鮮電泳緩沖液，在1 V/cm、300 mA條件下電泳25 min。電泳結(jié)束后將載玻片放入PBS中清洗，然后用中性緩沖液(0.4 mol/L Tris-HCl，pH=7.5)中和5 min后取出，溴化乙錠染色，熒光顯微鏡(BX-53，Olympus，日本)觀察拍照。所得圖像用CASP1.2.2軟件進(jìn)行分析，并用彗星圖像的尾矩(tail moment)和Olive尾矩(Olive tail moment)作為定量細(xì)胞DNA損傷程度的參數(shù)。

1.2.3骨髓單核細(xì)胞周期分布 按1.2.2收集骨髓單核細(xì)胞后，取骨髓單核細(xì)胞約105個，離心去除上清，用-20 ℃預(yù)冷的75%冷乙醇約1.5 mL重懸細(xì)胞，混勻后置于- 20 ℃固定細(xì)胞48 h以上。離心去除乙醇，并用PBS沖洗兩次，去除上清后用細(xì)胞周期分析試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行染色，室溫下避光染色30 min后用流式細(xì)胞儀(LSRFortessa，BD公司，美國)進(jìn)行周期測定。流式數(shù)據(jù)采用FlowJo7.6.1進(jìn)行分析。

1.2.4輻照后小鼠的造血系統(tǒng)恢復(fù)情況評估 為了評估碳離子全身輻照后小鼠造血系統(tǒng)恢復(fù)情況，我們檢測了小鼠的外周血細(xì)胞數(shù)和脾臟指數(shù)。輻照后第1、3、8天，每組各取8只小鼠，稱體質(zhì)量后眼眶采血20 μ L，用全自動血細(xì)胞分析儀(URIT-3000)分析外周血中各種細(xì)胞的含量。脫頸椎處死小鼠，解剖分離脾臟并稱質(zhì)量，計(jì)算脾臟指數(shù)：脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　碳離子全身輻照對骨髓單核細(xì)胞DNA的損傷

不同劑量碳離子輻射后第1天小鼠骨髓細(xì)胞堿性彗星試驗(yàn)結(jié)果見圖1和圖2。與對照組比較，不同劑量的碳離子輻射造成了骨髓單核細(xì)胞DNA的嚴(yán)重?fù)p傷，且損傷程度與劑量成正相關(guān)關(guān)系(第1天，r=0.99，P=0.001；第3天，r=0.96，P=0.007；第8天，r=0.97，P=0.006)。不同劑量碳離子輻射誘導(dǎo)的DNA損傷在輻照后第3天最嚴(yán)重(P均＜0.01)，在輻照后第8天，DNA損傷有所下降但仍很嚴(yán)重(P均＜0.01)。

圖1　不同劑量碳離子輻射后第1天小鼠骨髓單核細(xì)胞電泳圖

圖2　碳離子全身輻照對小鼠骨髓單核細(xì)胞DNA的損傷(n=8)

2.2　碳離子全身輻照對骨髓單核細(xì)胞周期分布的影響

如表1，從細(xì)胞周期分布的結(jié)果可以看出，碳離子輻射嚴(yán)重干擾了骨髓單核細(xì)胞的周期分布，在輻照后第3天，不同劑量的碳離子輻照造成了明顯的S期和G2/M期阻滯，S期阻滯更明顯，且輻照劑量越高，阻滯越嚴(yán)重。在輻照后第8天，各組S期阻滯基本解除，G2/M期阻滯仍然存在，但從整體上看，周期阻滯的程度有所緩解。

2.3　碳離子全身輻照后小鼠造血系統(tǒng)的恢復(fù)情況

外周血細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。在輻照后第1天，不同劑量的碳離子輻照導(dǎo)致小鼠外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)明顯下降，且輻照劑量越高，細(xì)胞數(shù)下降越多(p＜0.01)。輻照后第3天，不同劑量組白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)仍持續(xù)下降(p＜0.01)，所有劑量組的單核細(xì)胞和除0.5 Gy劑量組外其余各劑量組的中性粒細(xì)胞數(shù)也顯著下降(p＜0.01)。在輻照后第8天，各組白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞數(shù)均略有上升，但仍顯著低于對照組(p＜0.01)；除6 Gy劑量組外其余各劑量組的中性粒細(xì)胞數(shù)恢復(fù)至正常水平。此外，不同劑量的碳離子全身輻射對外周血中成熟紅細(xì)胞數(shù)的影響不大。

表1　碳離子全身輻照對小鼠骨髓單核細(xì)胞周期分布的影響(%，n=8)

脾臟指數(shù)分析結(jié)果見圖3，在輻照后第1天，僅6Gy劑量組的脾臟指數(shù)明顯降低(P=0.03)；輻照后第3天，0.5 Gy劑量組脾臟指數(shù)略微上升，其余各劑量組的脾臟指數(shù)均顯著下降(1 Gy，P=0.011；4和6 Gy，p＜0.01)，且劑量越大，下降越顯著。輻照后第8天，0.5、1 Gy輻射劑量組的脾臟指數(shù)均有所恢復(fù)(0.5 Gy，P=0.719；1 Gy，P=0.088)，但4 Gy與6 Gy劑量組的結(jié)果仍顯著低于對照組(P=0.001)。

表2　碳離子全身輻照后小鼠外周血細(xì)胞的數(shù)量變化(n=8)

圖3　碳離子全身輻照對小鼠脾臟指數(shù)的影響(n=8)

3　討論

深入了解重離子輻射對健康組織的影響，對重離子輻射在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用以及空間重離子輻射防護(hù)都具有重要意義。本文以小鼠造血系統(tǒng)為研究對象，研究了不同劑量碳離子全身輻照對小鼠造血系統(tǒng)的損傷及其損傷后隨時間的恢復(fù)情況。

DNA是電離輻射作用的主要靶分子，在細(xì)胞輻射損傷中起重要作用，因此我們首先對小鼠骨髓單核細(xì)胞的DNA損傷情況進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，碳離子輻射誘導(dǎo)的DNA損傷具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系(r均≤0.96，P均＜0.01)，且在輻照后第3天最嚴(yán)重，在第8天仍顯著下降。電離輻射通過直接作用和間接作用兩種方式造成骨髓細(xì)胞DNA損傷，DNA損傷后會激活機(jī)體內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答(DDR)通路以啟動細(xì)胞內(nèi)DNA損傷自修復(fù)過程。但骨髓細(xì)胞中DDR相關(guān)的許多蛋白(如ATM、ATR以及DNA-PKcs等)表達(dá)水平均很低，因此骨髓細(xì)胞的DNA損傷不能通過同源重組和非同源末端連接得到有效修復(fù)[10]。同時，電離輻射后細(xì)胞內(nèi)不斷產(chǎn)生的活性氧和活性氮等物質(zhì)會進(jìn)一步導(dǎo)致骨髓細(xì)胞的DNA損傷。這種氧化應(yīng)激會在機(jī)體受到電離輻射后持續(xù)數(shù)天到數(shù)月[11]，如6.5 Gy γ射線全身輻照小鼠導(dǎo)致其骨髓單核細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)在輻照后4周內(nèi)均顯著高于對照，且峰值出現(xiàn)在輻照后第3天[12]。另外，碳離子輻射會誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生DNA簇?fù)p傷，這類損傷會在堿基切除修復(fù)過程中產(chǎn)生新的DNA鏈斷裂[13]。低修復(fù)效率、持續(xù)氧化應(yīng)激與堿基切除修復(fù)過程中新產(chǎn)生的DNA損傷共同導(dǎo)致骨髓細(xì)胞DNA損傷在碳離子輻照后第3天最為嚴(yán)重(圖2)。此后，新產(chǎn)生的DNA損傷逐漸減少，而原有的DNA損傷逐漸得以修復(fù)，但由于高LET碳離子輻射會產(chǎn)生較多難以修復(fù)的簇?fù)p傷[13-14]，因此在輻照后第8天，DNA損傷雖有所減輕，但殘余損傷與對照相比仍具有顯著差異(圖2)。與常規(guī)射線(X/γ射線)相比，高LET重離子輻射引起的DNA損傷更嚴(yán)重、且呈團(tuán)簇狀分布、空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜、難以修復(fù)[13-14]，研究報道，暴露于同等劑量的X射線和碳離子射線24 h后，碳離子輻照造成的DNA殘余損傷更加顯著[15]。

DNA損傷能夠激活細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)[16]，進(jìn)而導(dǎo)致周期阻滯，為DNA損傷的修復(fù)提供時間[17]。骨髓單核細(xì)胞周期分布的檢測結(jié)果表明，不同劑量的碳離子輻照造成了不同程度的S期和G2/M期阻滯，劑量越大，周期阻滯越明顯(表1)。周期阻滯隨輻照后時間的變化情況與DNA損傷程度基本一致(圖2和表1)。研究表明，與常規(guī)射線相比，暴露于高LET射線后，小鼠成骨細(xì)胞因更嚴(yán)重的DNA損傷導(dǎo)致了更明顯的周期阻滯[18]。2 Gy的碳離子照射會造成結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2產(chǎn)生永久的G2/M期阻滯(輻照后72 h未恢復(fù))，而5 Gy的X射線輻照造成的該種細(xì)胞G2/M期阻滯在輻照后48 h即已恢復(fù)[15]。

碳離子全身輻照還引起小鼠外周血有核細(xì)胞(白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)數(shù)量發(fā)生變化，外周血中不同細(xì)胞的輻射敏感性不同，其中淋巴細(xì)胞對碳離子輻射最敏感(表2)，小鼠外周血淋巴細(xì)胞對γ射線的輻射敏感性也高于單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞[19]。而碳離子輻射對紅細(xì)胞影響不大組(表2)。這可能是由于DNA是電離輻射損傷的重要靶標(biāo)，碳離子輻射嚴(yán)重?fù)p傷外周血中的有核細(xì)胞，而成熟紅細(xì)胞受到的損傷相對較弱。此外，碳離子輻射誘導(dǎo)的骨髓單核細(xì)胞DNA損傷(圖2)和周期阻滯(表1)也會使外周血細(xì)胞來源匱乏[20]。隨著骨髓細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)、周期阻滯的緩解以及造血干細(xì)胞的自我更新，外周血細(xì)胞數(shù)有所回升，但在碳離子輻照后第8天，除中性粒細(xì)胞外，其余有核細(xì)胞數(shù)仍顯著低于對照(表2)。碳離子全身輻照還劑量依賴性地引起小鼠脾臟指數(shù)下降(圖3)，劉麗等[21]也報道小鼠受到4 Gy γ射線輻射后脾臟明顯萎縮。外周血細(xì)胞含量和脾臟指數(shù)可以反映小鼠造血系統(tǒng)恢復(fù)情況，從圖3和表2結(jié)果來看，在碳離子輻照后第8天小鼠的造血系統(tǒng)并沒有得以明顯恢復(fù)。

綜上，不同劑量的碳離子全身輻射會造成小鼠骨髓單核細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的DNA損傷和明顯的周期阻滯，DNA損傷和周期阻滯程度與劑量呈正比，并具有明顯的時間-效應(yīng)關(guān)系。碳離子輻射后小鼠脾臟指數(shù)下降以及外周血有核細(xì)胞數(shù)銳減，即碳離子輻射導(dǎo)致明顯的骨髓抑制。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束(輻照后第8天)時，骨髓細(xì)胞DNA損傷仍很嚴(yán)重，小鼠脾臟指數(shù)和外周血有核細(xì)胞數(shù)并未明顯恢復(fù)，表明骨髓細(xì)胞DNA嚴(yán)重?fù)p傷使外周血細(xì)胞來源匱乏，小鼠造血系統(tǒng)未得到明顯恢復(fù)。

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