劉　影，謝為天，徐春厚，張少敏，劉金帝(廣東海洋大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

海洋紅酵母是指存在于海洋環(huán)境及海洋生物中的單細(xì)胞真核微生物。研究表明，在南極、北極、印度海岸、深?；鹕郊笆芪廴竞Ｓ虻炔煌暮Ｑ蟓h(huán)境中，紅酵母均為優(yōu)勢(shì)菌群[1-5]。海洋紅酵母富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、消化酶、維生素等多種生物活性物質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和活性作用，可作為食品添加劑、功能生物飼料、抗氧化劑、生物催化劑、著色劑及微生物拮抗劑等應(yīng)用[6-9]。

目前，有關(guān)海洋紅酵母作為益生菌及微生態(tài)制劑方面的研究與應(yīng)用報(bào)道主要集中于水產(chǎn)養(yǎng)殖及水產(chǎn)動(dòng)物飼料上[8]。海洋紅酵母微生態(tài)制劑能顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物幼苗的存活率、提高飼料效果和飼料報(bào)酬，并能增強(qiáng)動(dòng)物體的免疫功能、減少抗生素用量，是生態(tài)養(yǎng)殖的優(yōu)良添加劑[10]。攝食添加海洋紅酵母飼料的水產(chǎn)動(dòng)物具有抗病能力強(qiáng)、存活率高、皮膚和肌肉色澤鮮艷等優(yōu)點(diǎn)[11]。海洋紅酵母亦是微生物發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素常用的菌種，具有生長(zhǎng)周期短、天然無(wú)毒、生產(chǎn)成本較低的特點(diǎn)[12]。在海洋紅酵母中，膠紅酵母是南海近岸海域的優(yōu)勢(shì)種群[6-7]，其含有類胡蘿卜素、蝦青素、消化酶、維生素等活性物質(zhì)[7]，是值得開(kāi)發(fā)利用的益生菌株。鑒于此，選用從雷州半島近岸海域分離篩選的1株膠紅酵母J6，優(yōu)化其培養(yǎng)基成分，繪制其生長(zhǎng)曲線，以期為該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　菌種

膠紅酵母J6由廣東海洋大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定、篩選和保存。

1.2　培養(yǎng)基

1.2.1紅酵母液體培養(yǎng)基2%蛋白胨、1%酵母膏、2%葡萄糖、2%NaCl，自然pH值。

1.2.2紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基2%蛋白胨、1%酵母膏、2%葡萄糖、2%NaCl、0.05% MgSO4，自然pH值。

1.3　膠紅酵母種子液的制備

將膠紅酵母J6斜面保存菌種接種于紅酵母液體培養(yǎng)基，28 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，連續(xù)傳2代，第2代培養(yǎng)物即為膠紅酵母種子液。

1.4　膠紅酵母培養(yǎng)物的制備

將膠紅酵母種子液按5%接種于紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，即為膠紅酵母培養(yǎng)物。

1.5　培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)

1.5.1單因素試驗(yàn)

1.5.1.1碳源優(yōu)化將紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖分別用2%蔗糖、2%海藻糖、2%麥芽糖代替，其他成分不變，按5%的接種量接種膠紅酵母種子液，28 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，即為單因素試驗(yàn)的培養(yǎng)物。用培養(yǎng)物中的菌體細(xì)胞干質(zhì)量(生物量)為判定標(biāo)準(zhǔn)篩選出適宜的碳源。

1.5.1.2氮源優(yōu)化將紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨和酵母膏分別用3%酵母膏、3%牛肉膏、1.5%蛋白胨+1.5%酵母膏、1%蛋白胨+1%酵母膏+1%牛肉膏代替，碳源為2%海藻糖，其他成分不變，種子液接種量、培養(yǎng)條件和判定標(biāo)準(zhǔn)同上。

1.5.1.3無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化將紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中的0.05% MgSO4分別用0.05% MnSO4、0.05% K2HPO4、0.025% MgSO4+0.025% K2HPO4代替，碳源為2%海藻糖，NaCl以及其他成分不變，種子液接種量、培養(yǎng)條件和判定標(biāo)準(zhǔn)同上。

1.5.1.4氮源比例優(yōu)化根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，固定碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及NaCl的含量不變，用蛋白胨、酵母膏和牛肉膏按2∶2∶1、2∶1∶1、1∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2的比例配制成5種氮源組合，種子液接種量、培養(yǎng)條件和判定標(biāo)準(zhǔn)同上。

1.5.2正交試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)優(yōu)化出的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及氮源比例，采用6個(gè)因素、3個(gè)水平，共27個(gè)組別，每個(gè)組別做3次平行試驗(yàn)，即使用L27(36)正交設(shè)計(jì)表，各個(gè)水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。按5%的接種量將膠紅酵母種子液分別接種于27個(gè)組別的正交試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，即為正交試驗(yàn)的培養(yǎng)物。根據(jù)3次平行試驗(yàn)測(cè)定的色素(類胡蘿卜素)含量及生物量的平均值，優(yōu)化出適宜的培養(yǎng)基成分及添加量組合。

表1　正交試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì) 　%

1.6　測(cè)定指標(biāo)

1.6.1生物量測(cè)定將膠紅酵母培養(yǎng)物、單因素試驗(yàn)的培養(yǎng)物或正交試驗(yàn)的培養(yǎng)物80 mL倒入100 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，去掉上清液，將淡紅色的菌體細(xì)胞沉淀物用80 mL蒸餾水懸浮，反復(fù)離心洗滌數(shù)次，直至上清液無(wú)色；將最后一次離心去掉上清液的菌體細(xì)胞沉淀物置于50 ℃生化培養(yǎng)箱中，烘干至菌體沉淀物恒定質(zhì)量，即為膠紅酵母的干菌體，以生物量(g/L)表示。

1.6.2色素含量測(cè)定稱取0.1 g干菌體于離心管中，加入3 mol/L的鹽酸溶液5 mL，在室溫下振蕩90 min，再將其放入100 ℃水浴鍋中維持3 min，放入冰塊中快速降溫，4 000 r/min離心10 min，去掉上清液后加入蒸餾水，混勻，用同樣的方法反復(fù)離心3次，此時(shí)得到膠紅酵母細(xì)胞碎片。

收集色素提取液：在細(xì)胞碎片中加入5 mL丙酮，搖勻，靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，上清液即為色素提取液。

色素含量測(cè)定：在提取液中加入丙酮，定容至15 mL，搖勻，在475 nm波長(zhǎng)下測(cè)定色素吸光值。色素含量(μg/g)=Aλ×D×V/0.16×W。

式中，Aλ：475 nm的色素吸光值；D：提取液測(cè)定時(shí)的稀釋倍數(shù)；V：加入丙酮的體積(mL)；W：干菌體的質(zhì)量(g)。

1.7　生長(zhǎng)曲線繪制

1.7.1膠紅酵母發(fā)酵液的制備將膠紅酵母種子液按5%分別接種于12瓶紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、140 r/min條件下培養(yǎng)72 h；期間每隔6 h取出1瓶發(fā)酵液，測(cè)定膠紅酵母活菌數(shù)和總菌數(shù)。

1.7.2膠紅酵母發(fā)酵液中活菌數(shù)和總菌數(shù)的測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)板法，分別取培養(yǎng)6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h的膠紅酵母發(fā)酵液1 mL，置于滅菌的小試管中，加入1 mL美蘭染色液，混勻后放置2 min，吸取混合液一滴加入到血球計(jì)數(shù)板上，光學(xué)顯微鏡下觀察，凡是染成藍(lán)色的菌體細(xì)胞判定為死亡的膠紅酵母，未染色的菌體細(xì)胞判定為活的膠紅酵母，二者之和為總菌數(shù)。

1.7.3生長(zhǎng)曲線的繪制以膠紅酵母J6發(fā)酵液的培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、發(fā)酵液中細(xì)菌的數(shù)量為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

2　結(jié)果與分析

2.1　膠紅酵母培養(yǎng)物的測(cè)定結(jié)果

膠紅酵母J6接種于紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中，其培養(yǎng)物中的生物量是6.423 8 g/L，菌體細(xì)胞內(nèi)色素含量為 131.625 μg/g，色素產(chǎn)量為0.845 5 mg/L。膠紅酵母J6的生物量較少，色素產(chǎn)量較低。

2.2　膠紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

采用控制變量法進(jìn)行單個(gè)因素最適合成分的篩選，用生物量判定優(yōu)化的結(jié)果。碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及氮源比例的優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2—表5。由表2可知，4種糖中，海藻糖作為碳源時(shí)所得的生物量最多，比優(yōu)化前以葡萄糖作為碳源時(shí)提高了41.23%。由表3和表4可知，原發(fā)酵培養(yǎng)基以蛋白胨和酵母膏為氮源時(shí)，發(fā)酵得到的菌體生物量是8.731 3 g/L，而在此基礎(chǔ)上添加牛肉膏，菌體生物量可以達(dá)到10.892 5 g/L，產(chǎn)量提高了24.75%；當(dāng)?shù)鞍纂?、酵母膏、牛肉膏的比例?∶1∶2時(shí)，菌體生物量最大，其次是2∶2∶1。由表5可知，當(dāng)MnSO4作為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，菌體生物量最大，為7.700 0 g/L，比原發(fā)酵培養(yǎng)基提高了16.93%。

表2　不同碳源的生物量　g/L

表3　不同氮源的生物量　g/L

表4　不同氮源比例的生物量　g/L

表5　不同無(wú)機(jī)鹽的生物量 　g/L

2.3　膠紅酶母發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果

從單因素優(yōu)化試驗(yàn)中篩選出的最適合成分：海藻糖、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、NaCl和MnSO4作為正交試驗(yàn)的6個(gè)測(cè)試因素，且固定蛋白胨、酵母膏、牛肉膏的比例為2∶2∶1的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，當(dāng)各因素以A1B2C2D1E2F1為培養(yǎng)基組合，即2%海藻糖、2%蛋白胨、2%酵母膏、0.5%牛肉膏、2% NaCl和0.025%MnSO4時(shí)，膠紅酵母J6細(xì)胞中的色素含量最高，為331.406 μg/g，比優(yōu)化前提高了151.78%；6個(gè)因素中，對(duì)色素含量的影響程度從大到小依次是C>A>E>F>B>D，即酵母膏對(duì)色素含量影響最明顯，海藻糖次之；當(dāng)各因素組合為A2B3C1D2E2F3時(shí)，即5%海藻糖、3%蛋白胨、1%酵母膏、1%牛肉膏、2% NaCl和0.075% MnSO4時(shí)，其生物量最多，為16.791 0 g/L，比優(yōu)化前提高了161.39%；6個(gè)因素對(duì)生物量的影響程度從大到小依次是E>F>C>B>D>A，即NaCl對(duì)生物量的影響最大，而海藻糖最小。

由表7、表8可知，本試驗(yàn)6個(gè)因素對(duì)色素含量和生物量的影響均不顯著。

表6　正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析

表7　正交試驗(yàn)方差分析(以色素含量為分析對(duì)象)

表8　正交試驗(yàn)方差分析(以生物量為分析對(duì)象)

2.4　生長(zhǎng)曲線的繪制

根據(jù)測(cè)定的膠紅酵母J6在發(fā)酵液中的活菌數(shù)和總菌數(shù)繪制出的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。由圖1可知，膠紅酵母J6在液體中發(fā)酵時(shí)，6～18 h，生長(zhǎng)速度較為遲緩；18～36 h，為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；36～48 h，為穩(wěn)定期；48～72 h，為衰亡期。

圖1　膠紅酵母J6的生長(zhǎng)曲線

3　結(jié)論與討論

通過(guò)單因素優(yōu)化試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化出了膠紅酵母的培養(yǎng)基。色素含量最高的培養(yǎng)基配方是：2%海藻糖、2%蛋白胨、2%酵母膏、0.5%牛肉膏、2% NaCl和0.025% MnSO4；菌體生物量最多的培養(yǎng)基配方是：5%海藻糖、3%蛋白胨、1%酵母膏、1%牛肉膏、2% NaCl和0.075%MnSO4；在將來(lái)用膠紅酵母J6液體發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素時(shí)，建議用2%海藻糖、2%蛋白胨、2%酵母膏、0.5%牛肉膏、2% NaCl和0.025% MnSO4培養(yǎng)基配方，既能獲得較高的色素含量，又能降低培養(yǎng)基成本。

在碳源優(yōu)化中，篩選出海藻糖是理想的碳源。而海藻糖是雙糖分子的新型糖類，具有保水性和抗變性。海藻糖的糖苷鍵在海藻糖酶的作用下能快速釋放2個(gè)分子的葡萄糖，相比斷開(kāi)1個(gè)普通糖苷鍵只釋放1個(gè)分子的葡萄糖，海藻糖釋放葡萄糖的效能是普通淀粉多聚物的2倍[13]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，以海藻糖為碳源時(shí)可使膠紅酵母的生物量提高41.23%。氮源優(yōu)化中，在原發(fā)酵培養(yǎng)基中，增加了牛肉膏，使菌體生物量提高了24.75%；蛋白胨、酵母膏和牛肉膏三者的比例為1∶1∶2和2∶2∶1時(shí)，菌體生物量分別為7.892 5 g/L和7.216 3 g/L，考慮到培養(yǎng)基中牛肉膏的價(jià)格最貴，故選用蛋白胨、酵母膏和牛肉膏三者比例為2∶2∶1的組合作為最優(yōu)氮源。

張闖[14]研究膠紅酵母培養(yǎng)基配方，得到最優(yōu)組合的生物量為11.38 g/L，類胡蘿卜素含量為120.63 g/L。本試驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基可以使膠紅酵母J6的生物量達(dá)到16.791 g/L，比原發(fā)酵培養(yǎng)基(6.423 8 g/L)提高了161.39%；色素含量達(dá)到331.406 μg/g，比原發(fā)酵培養(yǎng)基(131.625 μg/g)提高了151.78%。

分析正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，生物量最多為16.791 g/L時(shí)，其色素含量為282.344 μg/g；而色素含量最高為331.406 μg/g時(shí)，生物量只有7.303 7 g/L，菌體生物量與色素含量不呈正相關(guān)。而膠紅酵母在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的色素總量是由其生物量以及色素含量共同決定的，因此，開(kāi)發(fā)應(yīng)用膠紅酵母J6時(shí)，要根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需要來(lái)調(diào)整培養(yǎng)基的組合，以達(dá)到最好的經(jīng)濟(jì)效益。

繪制出了膠紅酵母菌J6生長(zhǎng)曲線，明確了其生長(zhǎng)的4個(gè)時(shí)期，優(yōu)化出了培養(yǎng)基，為膠紅酵母菌J6將來(lái)作為動(dòng)物微生態(tài)制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用及作為類胡蘿卜素生產(chǎn)菌種提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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