李　艷，趙紅星，王　勇，姜　俊*，孟祥鋒，魏小春，李金玲(.駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 駐馬店市蔬菜遺傳育種工程技術(shù)研究中心，河南 駐馬店 46000； .河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 鄭州 45000； .南陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 南陽 47000)

辣椒屬(Capsicum)起源于中美洲和南美洲地區(qū)，有著悠久的栽培歷史，其野生種質(zhì)資源極為豐富。目前，辣椒是我國栽培面積最大的三大蔬菜之一。辣椒種質(zhì)資源指攜帶有不同基因型的辣椒野生種、近緣種和栽培種，是開展辣椒育種和基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)。由于我國地域廣闊，土壤、氣候類型復(fù)雜，是重要的辣椒次生起源中心，所以我國野生種和栽培種種質(zhì)資源十分豐富。利用其資源優(yōu)勢(shì)可研究鑒別種質(zhì)資源中特異種質(zhì)、篩選核心親本，避免育種的盲目性，提高育種效率。

1975年，Sambrook等[1]發(fā)明了限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)，隨后，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和模式植物全基因組序列測(cè)序的完成，相應(yīng)地開發(fā)出了AFLP、RAPD、ISSR、SSR等一系列分子標(biāo)記。Tam等[2]利用SSAP、AFLP和SSR 3種DNA分子標(biāo)記比較分析了辣椒和西紅柿的遺傳多樣性。李晴等[3]采用11個(gè)隨機(jī)RAPD標(biāo)記對(duì)37份辣椒資源材料進(jìn)行擴(kuò)增分析，聚類分析將37份辣椒資源材料分為5個(gè)類群，每個(gè)類群內(nèi)的資源材料親緣關(guān)系較近，但其遺傳關(guān)系與地域、距離并無明顯相關(guān)性。周晶等[4]利用52對(duì)SSR多態(tài)性引物分析了89份辣椒資源材料的遺傳關(guān)系，聚類結(jié)果表明，利用SSR標(biāo)記進(jìn)行辣椒遺傳多樣性分析是可行的。賈豪等[5]首次用不同地理來源的24份辣椒種質(zhì)資源，對(duì)基于辣椒全基因組編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)的152對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，獲得條帶清晰、穩(wěn)定性好的41對(duì)SSR多態(tài)性引物，并將24份辣椒聚為7類，結(jié)果基本與辣椒種類來源相符。SSR標(biāo)記屬于共顯性類分子標(biāo)記，與其他幾種分子標(biāo)記相比，具有多態(tài)性信息豐富、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定性好、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，是研究群體遺傳多樣性和親緣關(guān)系遠(yuǎn)近較理想的標(biāo)記[6]。

由于辣椒種質(zhì)資源的遺傳變異性大，種質(zhì)間的交流不僅豐富了辣椒資源材料的遺傳信息，也為辣椒品種的改良和新品種的選育提供了基礎(chǔ)。(本研究以基于辣椒全基因組編碼區(qū)序列開發(fā)設(shè)計(jì)覆蓋12條染色體的152對(duì)SSR引物為基礎(chǔ)，經(jīng)過前期試驗(yàn)篩選出17對(duì)多態(tài)性較好的SSR引物)，對(duì)169份辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，為辣椒資源材料的收集、鑒定、保存和新品種的選育提供理論指導(dǎo)。

1　材料和方法

1.1　試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所多年來收集的來源于不同地區(qū)且性狀存在差異的169份辣椒資源材料，材料信息見表1。所有資源材料均種植在駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地。

表1　辣椒種質(zhì)資源的名稱和來源

續(xù)表1　辣椒種質(zhì)資源的名稱和來源

1.2　方法

1.2.1辣椒總DNA提取采取辣椒幼嫩葉片為試驗(yàn)材料，利用改良過的CTAB法提取辣椒總DNA[5]，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的辣椒樣品總DNA的質(zhì)量，測(cè)定樣品DNA的質(zhì)量濃度，并稀釋至50 ng/μL，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

1.2.2引物的篩選根據(jù)已經(jīng)測(cè)序的CM334和遵辣1號(hào)基因組數(shù)據(jù)庫[7-8]，參照黃瓜中開發(fā)SSR引物的方法進(jìn)行辣椒全基因組編碼區(qū)序列SSR引物的開發(fā)[9-10]，以隨機(jī)挑選覆蓋辣椒12條染色體的152對(duì)SSR引物為基礎(chǔ)，篩選出17對(duì)多態(tài)性好的引物用于全部試驗(yàn)材料的檢測(cè)(表2)，分析其遺傳多樣性。

表2　17對(duì)多態(tài)性SSR引物信息

1.2.3PCR擴(kuò)增及檢測(cè)PCR反應(yīng)體系為20 μL：10×TaqBuffer (Mg2+plus) 2 μL，TaqDNA Polymerase(5 U/μL) 0.1 μL，dNTP Mix (10 mmol/L each) 0.4 μL，ddH2O 13.9 μL，正、反向引物各0.8 μL，模板DNA 2 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃低溫保存。PCR擴(kuò)增結(jié)束后使用9%聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.4數(shù)據(jù)分析根據(jù)二元數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)原則，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果中多態(tài)性條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有條帶的記為1，無條帶的記為0，模糊條帶不統(tǒng)計(jì)。利用Phylip軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果的分析，并用UPGMA法對(duì)169份試驗(yàn)材料進(jìn)行聚類分析，生成聚類分析圖，明確辣椒種質(zhì)資源材料間的親緣關(guān)系。

1.2.5遺傳多樣性分析根據(jù)統(tǒng)計(jì)的擴(kuò)增結(jié)果，利用POPGENE32軟件計(jì)算試驗(yàn)材料的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、期望雜合度(He)、觀測(cè)雜合度(Ho)和香濃指數(shù)(I)[11]；采用PIC1.06并根據(jù)Nei遺傳距離計(jì)算引物的多態(tài)性信息含量(PIC)[12]。

2　結(jié)果與分析

2.1　SSR引物多態(tài)性分析

利用已合成的152對(duì)SSR引物，用4種不同類型的辣椒資源材料篩選出17對(duì)多態(tài)性較好的引物，利用其對(duì)不同來源的169份辣椒材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增及聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測(cè)(圖1)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，17對(duì)SSR引物共擴(kuò)增出46個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出2.71個(gè)位點(diǎn)，其中擴(kuò)增出2個(gè)等位基因的引物有14對(duì)，而產(chǎn)生3個(gè)等位基因的引物有3對(duì)，分別為S1、S147、S151(表3)。

2.2　遺傳多樣性分析

利用POPGENE32軟件對(duì)試驗(yàn)獲得的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行計(jì)算 (表3)。辣椒資源材料的等位基因數(shù)為2～3，平均值為2.176 5；有效等位基因數(shù)為1.113 9～2.587 9，平均值為1.629 1；期望雜合度為0.103 7～0.622 0，平均值為0.360 2；觀測(cè)雜合度為0～1，平均值為0.834 7；香農(nóng)指數(shù)為0.210 3～1.013 0，平均值為0.549 6；多態(tài)信息含量為0.166 2～0.568 1，平均值為0.310 6。表明篩選出的引物多態(tài)性信息豐富，參試?yán)苯焚Y源材料的遺傳多樣性高。

M為Maker；1—32為樣品圖1　引物S115對(duì)部分辣椒材料SSR擴(kuò)增結(jié)果

表3　辣椒種質(zhì)資源遺傳多樣性相關(guān)指標(biāo)

2.3　聚類結(jié)果分析

將垂直電泳結(jié)果轉(zhuǎn)化為0-1矩陣，利用Phylip軟件對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，采用UPGMA方法進(jìn)行聚類和親緣關(guān)系遠(yuǎn)近分析(圖2)。結(jié)果表明，將169份資源材料分為7類。第1類為材料D10，與其他辣椒資源材料的親緣關(guān)系最遠(yuǎn);第2類為材料D8，除D10外，與其他辣椒資源材料的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；第3類為材料D4，與大部分辣椒資源材料的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；第4類為材料D62和D106，這2份材料親緣關(guān)系最近；第5類為材料D47；第6類為材料D58和D141，這2份材料親緣關(guān)系也最近；第7類為其他的大部分資源材料。

圖2　169份辣椒資源遺傳多樣性聚類分析

3　結(jié)論與討論

SSR分子標(biāo)記一般是由1～6個(gè)堿基對(duì)串聯(lián)組成的核苷酸重復(fù)序列，是通過PCR特異性擴(kuò)增的共顯性類型的遺傳標(biāo)記[13]。全基因組水平上的基因編碼區(qū)的SSR標(biāo)記在基因組中的位置是確定的，能夠檢測(cè)出轉(zhuǎn)錄區(qū)的多態(tài)性，較適合用于群體遺傳關(guān)系的評(píng)價(jià)。本研究基于辣椒全基因組編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)152對(duì)SSR引物，前期試驗(yàn)篩選出17對(duì)多態(tài)性好的SSR引物，利用這些引物對(duì)來源不同的169份辣椒資源材料進(jìn)行擴(kuò)增，并統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果表明，共擴(kuò)增出46個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出2.71個(gè)等位基因，平均多態(tài)性信息含量為0.310 6。羅玉娣等[14]利用21對(duì)SSR引物對(duì)33份辣椒種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，每對(duì)SSR引物平均檢測(cè)出2.6個(gè)等位基因，且聚類分析時(shí)把同種的辣椒材料基本聚為一類，說明SSR分子標(biāo)記是研究辣椒材料遺傳關(guān)系的有效手段。周晶等[4]利用109對(duì)SSR引物對(duì)不同來源的89份辣椒資源材料進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，每對(duì)SSR引物平均擴(kuò)增出2.66個(gè)等位基因，且聚類分析結(jié)果表明，SSR分子標(biāo)記用來分析辣椒資源材料的遺傳多樣性是可行的。陳文超等[15]利用33對(duì)SSR分子標(biāo)記對(duì)31份辣椒材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，每對(duì)SSR標(biāo)記平均擴(kuò)增出2.76個(gè)等位基因。本試驗(yàn)檢測(cè)出的平均等位基因數(shù)均比羅玉娣等[14]、周晶等[4]的結(jié)果高，與陳文超等[15]檢測(cè)出的平均等位基因數(shù)最接近，表明本研究所篩選的SSR引物具有較豐富的多態(tài)性，可以真實(shí)地反映出種質(zhì)之間的遺傳多樣性。

在辣椒資源材料聚類分析中，本研究將169份辣椒資源材料聚為7類，遺傳聚類分析結(jié)果清晰地表明了辣椒種質(zhì)的遺傳多樣性和種質(zhì)間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，可有效提高辣椒的育種效率，減少育種目標(biāo)的盲目性，并為今后的辣椒新品種的選育提供理論指導(dǎo)。

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