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(1.重慶市第十三人民醫(yī)院內科，重慶 400053；2.重慶醫(yī)科大學干細胞與組織工程實驗室，重慶 400032)

慢性髓細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一組起源于造血干/祖細胞的惡性克隆增殖性疾病，迄今治療仍主要采用傳統(tǒng)的大劑量聯合化療，但此法副作用大、復發(fā)率高，而且對正常機體免疫與造血系統(tǒng)有極大的損害。尋找既能抑制白血病細胞惡性增殖、誘導凋亡，副作用又相對較小的天然藥物已成為治療白血病的希望和重要途徑。1997年Bonnet等[1]從急性髓細胞白血病患者中分離出CD34+/CD38-的白血病前體細胞亞群，將這種細胞移植給NOD/SCID小鼠后會引發(fā)白血病，而能代表絕大多數白血病細胞(CD34+，CD38+/CD34-)的白血病原始細胞不能使NOD/SCID小鼠發(fā)生白血病。研究進一步發(fā)現，移植的CD34+/CD38-白血病前體細胞亞群可連續(xù)被移植給二代受體[1-2]，由此可證實該前體細胞具有自我復制能力，因此認為這是白血病干細胞或干細胞樣細胞，盡管這種細胞僅占白血病細胞的一小部分，但由于白血病干細胞更能逃逸化療或放療，是白血病難以治愈或復發(fā)的關鍵?？梢妼ふ野籽「杉毎麑χ斡籽≈陵P重要。有研究結果表明，人參皂苷Rg1對正常造血細胞和腫瘤細胞增殖分化有雙向調節(jié)作用，對正常造血細胞有延緩其衰老的作用，而對腫瘤細胞的增殖有明顯抑制作用并能誘導其向成熟方向分化[3-4]。但白血病干細胞衰老情況同正常造血干細胞相比有何區(qū)別，人參皂苷Rg1對白血病干細胞的促衰老作用還未明確，本課題擬運用現代衰老的檢測技術，通過測定健康人群及白血病患者骨髓CD34+/CD38-細胞群，即造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSCs)的衰老生物學變化特征并探討人參皂苷對白血病干細胞是否有促衰老的作用，以期為白血病的防治提供參考依據。

1　材料與方法

1.1　材料與分組

本研究中無明顯血液學異常者的骨髓，已確診為慢性髓細胞白血病的患者的骨髓，均由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液科骨穿室提供。標本收集得到重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準并獲患者家屬知情同意。納入無血液病異常者15例(正常組)，其中男6例，45～56歲；女9例，49～58歲。慢性髓細胞白血病患者16例(白血病組)，其中男8例，40～56歲；女8例，40～62歲。取骨髓，將2組患者分別再分為對照組與Rg1組。對照組進行常規(guī)培養(yǎng)，即在含30%胎牛血清及1%青霉素(或鏈霉素)的低糖培養(yǎng)基中于37 ℃、5%CO2的細胞孵育箱培養(yǎng)2 d。Rg1組在上述培養(yǎng)體系中另外加10 μg/mL人參皂苷Rg1，其他條件同對照組，培養(yǎng)2 d?？傻玫秸φ战M、正常Rg1組、白血病對照組、白血病Rg1組4個組細胞進行后續(xù)實驗。

1.2　藥品與試劑

藥物與試劑包括：Human Anti-CD34 MicroBead Kit(FITC)(NO.130-046-703)、Human Anti-CD38 MicroBead Kit(NO.130-092-263)、MS磁珠分離柱(NO.130-042-201)，Buffer緩沖液、細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒、紅細胞裂解液、CCK-8試劑盒(C0037)、Ficoll分離液。

1.3　免疫磁珠分離純化人骨髓CD34+/CD38-細胞及流式細胞術測定純度

腰椎穿刺獲取CML患者骨髓，經過置于抗凝管中，上下反復顛倒混勻，置于冰盒里，將骨髓用生理鹽水洗滌2次，移入離心管，離心后加入5 mL紅細胞裂解液置于4 ℃冰箱5 min，生理鹽水洗滌，參照說明書，分離采集骨髓單個核細胞(bone marrow nucleated cells,BMNCs)，離心后用計數板計數細胞個數。取BMNCs 1×108個細胞加入800 μL Buffer及200 μL human anti-CD38-PE 免疫磁珠抗體，輕輕吹打混勻，避光4 ℃孵育10 min，加入800 μL Buffer及200 μL anti-biotin 微珠，再避光4 ℃孵育30 min。將MS分選柱置于分離器磁場中，用干細胞專用Buffer 沖洗MS柱2次。用一次性巴氏管將孵好抗體的細胞加入分選柱中使其自然流下，分選出的細胞即為CD38-細胞，再取1×108個CD38-細胞加入100 μL Fcr blocking reagent、100 μL CD34 microbeads和300 μL Buffer，輕輕吹打混勻后4 ℃避光孵育30 min。按之前的方法將孵好抗體的細胞懸液緩緩加到MS分選柱中，即將流盡時加1 mL Buffer沖洗2次，向MS柱中加入1 mL Buffer，用美天旎MS分選柱配套的活塞迅速推出柱子里的細胞，推出的細胞即為實驗需要的人骨髓CD34+/CD38-細胞。

1.4　臺盼藍染色檢測細胞的存活率

分別采集各組CD34+/CD38-細胞懸液各90 μL，加入4 g/L 的臺盼藍染液10 μL，混勻，靜置3 min，血球計數板計數，透明不著色細胞為活細胞，著色脹大、呈淡藍色為死細胞，計算活細胞百分比?；罴毎?[活細胞總數/(活細胞總數+死細胞總數)×100%]。

1.5　各組CD34+/CD38-細胞衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色

分別收集各組人骨髓CD34+/CD38-細胞各1×105個，參照細胞衰老β半乳糖苷酶染色試劑盒說明書方法對各組細胞進行染色。染色陽性細胞呈藍色，倒置相差顯微鏡下觀察200個細胞，計數陽性細胞百分率。

1.6　各組CD34+/CD38-細胞形成造血干/祖細胞集落能力比較

分別取各組CD34+/CD38-細胞各4×104個細胞，用移液槍緩慢吸取并加入1 mL混合集落專用培養(yǎng)基，混勻后分別按0.5 mL/孔加入24 孔細胞培養(yǎng)板，用顯微鏡每天觀察細胞形態(tài)，記錄各組集落生長情況，培養(yǎng)至第7天后計數各組混合集落數，進行統(tǒng)計分析。

1.7　CCK-8 試劑盒檢測各組CD34+/CD38-細胞的增殖能力

在96 孔板中分別加入各組CD34+/CD38-細胞，每孔2×104個細胞，96孔板周圍一排孔不加細胞，只加100 μL PBS緩沖液作為空白對照，每孔再加入10 μL CCK-8 溶液，在細胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育4 d，每天分別用酶標儀調節(jié)到450 nm 波長檢測的吸光度值(A450)，并進行統(tǒng)計分析。

1.8　各組CD34+/CD38-細胞的細胞周期時相比較

收集各組CD34+/CD38-細胞，用PBS緩沖液洗滌1次，70%的冰乙醇固定過夜，再用PBS緩沖液洗滌2次，加入100 μL牛胰核糖核酸酶(1 g/L)，37 ℃水浴孵育30 min；加入50 mg/L的碘化丙啶染色液避光反應30 min，流式細胞儀進行檢測，再用Multicycle軟件分析各組細胞的細胞周期時相。

1.9　統(tǒng)計學分析

2　結果

2.1　MACS分選前后CD34+/CD38-細胞純度比較

按照已發(fā)表的免疫磁珠改良分選方法[23]可分選出純度較高的人骨髓CD34+/CD38-細胞。流式細胞術(FCM)檢測結果顯示，分選前每1×106個BMNCs中CD34+/CD38-細胞群比例為(1.76±0.34)%；免疫磁性分選后每1×106個細胞中CD34+/CD38-細胞群比例為(91.15±2.41)%，見圖1。

a:分選前;b:分選后

2.2　臺盼藍染色檢測細胞的存活率結果

各組人骨髓CD34+/CD38-細胞存活率均可達到98%以上，正常對照組，正常Rg1組，白血病正常組，白血病Rg1組分別為(98.06±0.65)%，(99.16±0.52)%，(99.4±0.27)%，(99.0±0.5)%，且各組人骨髓CD34+/CD38-細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明分離的細胞純化高、活性好，各組間無差異，均可用于后續(xù)的實驗研究。

2.3　骨髓CD34+/CD38-細胞SA-β-半乳糖苷酶染色結果

SA-β-半乳糖苷酶染色顯示陽性細胞著藍色，胞漿內可見藍色顆粒；陰性細胞未著色。白血病對照組CD34+/CD38-細胞SA-β-半乳糖苷酶陽性細胞率為(5.45±0.15)%，明顯低于正常對照組的(11.5±1.74)%與正常Rg1組的(9.81±0.89)%，說明慢性髓細胞白血病患者的CD34+/CD38-細胞，即白血病干細胞較健康人的CD34+/CD38-細胞出現逆衰老。而白血病Rg1組的SA-β-半乳糖苷酶陽性細胞率(8.74±0.45)%，相比白血病對照組出現升高，說明人參皂苷Rg1可能誘導白血病干細胞趨向了衰老。

2.4　骨髓CD34+/CD38-細胞CFU-Mix形成能力

各組CD34+/CD38-細胞CFU-Mix形成檢測結果顯示，正常對照組CFU-Mix形成(4.58±0.76)個/104、正常Rg1組(5.34±0.68)個/104、白血病對照組(8.69±0.71)個/104、白血病Rg1組(6.55±0.24)個/104。白血病對照組CFU-Mix形成率明顯高于正常對照組與正常Rg1組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。白血病患者的CD34+/CD38-細胞較健康人的CD34+/CD38-細胞增殖能力大大增加，集落細胞增大，排列不規(guī)則，即出現異常增殖，具有白血病干細胞的特質。而白血病Rg1組CD34+/CD38-的增殖速率相比白血病對照組出現下降，說明人參皂苷Rg1可以有效抑制CD34+/CD38-細胞的異常增殖情況。

2.5　骨髓CD34+/CD38-細胞增殖生長能力比較

各組CD34+/CD38-細胞CCK-8檢測結果提示，白血病對照組增殖能力明顯高于正常對照組與正常Rg1組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明慢性髓細胞白血病患者的CD34+/CD38-細胞成為白血病干細胞較健康人的CD34+/CD38-細胞增殖能力大大增加，即出現異常增殖。而白血病Rg1組的增殖速率相比白血病對照組出現明顯下降，說明人參皂苷Rg1可以有效抑制白血病干細胞的異常增殖情況，見圖2。

2.6　各組人骨髓CD34+/CD38-細胞的細胞周期時相的比較

正常對照組及正常Rg1組較白血病對照組出現明顯的G1期阻滯， 其G0/G1期比例明顯增高，S期比例減少，說明白血病對照組的細胞進入分裂期比例高，增殖活躍；白血病Rg1組的G1期阻滯相比白血病對照組有所升高，說明Rg1可以促進白血病干細胞進入G1期，減慢白血病干細胞的增殖。而正常Rg1組較正常對照組其G0/G1期比例明顯降低，S期比例增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。說明Rg1對正常細胞具有延緩其衰老速度的作用。

圖2　CCK-8檢測各組人CD34+/CD38-細胞增殖能力

組別 nG0/G1期G2/M期S期正常對照組 1590.7±3.32.2±1.26.1±0.5正常Rg1組 1585.5±2.94.1±1.58.9±1.3白血病對照組1671.1±3.2*8.3±1.9*19.6±2.7*白血病Rg1組167.3±1.16.7±2.115.3±0.5

*：與其余各組比較，P<0.05

3　討論

作為造血系統(tǒng)先祖，造血干細胞負責終身生產所有類型的血細胞。這種功能性能力及血細胞數量隨年齡顯著改變，免疫缺陷和貧血被認為是老年人群發(fā)病率和病死率增加的主要因素[5]。適應性和包括淋巴免疫系統(tǒng)(B、T淋巴細胞)與骨髓白細胞在內的先天免疫系統(tǒng)的協調誘發(fā)免疫反應。隨著年齡的增加，幼稚T細胞的產生顯著下降，記憶和效應T細胞積累和克隆擴增顯著，可導致老年人免疫防御下降，自身免疫增加[6]。B細胞的數量隨著年齡的增長而降低，而且衰老的B細胞生成的抗體親和力和多樣性降低[7]。和淋巴系細胞群相比，髓系細胞群隨年齡增加而擴大，這使體內形成了一種促炎環(huán)境，成為生活的不利因素[8]。此外，其他類免疫細胞，如自然殺傷細胞和樹突狀抗原呈遞細胞，已被證實在老年人機體里數量減少和功能衰退[9-10]。這些“免疫衰老”和“炎性衰老”顯型在許多老年人群病理性的重大健康問題中都有涉及，如癌癥、自身免疫性疾病、慢性炎癥性紊亂。

衰老伴隨著基因損傷積累、端?？s短以及代謝產物的負擔。所有這些細胞的變化可激活參與凋亡、衰老或受損細胞增殖的多個信號通路，最終導致衰老干細胞的功能下降[11-16]。老年人(大于65歲)骨髓造血干細胞的增殖特性明顯高于年輕人(20～30歲)[11-12]。老年人造血干細胞異種移植到免疫缺陷小鼠不會像年輕人的細胞有效地產生淋巴系后代[11]。

腫瘤干細胞是研究腫瘤極其重要的模型，將干細胞、促腫瘤干細胞衰老與抑制腫瘤生長密切結合，深入研究腫瘤干細胞和促腫瘤干細胞衰老的現代生物學機理，尋找促腫瘤干細胞衰老的方法對抑制腫瘤生長的研究有重大科學意義。慢性髓系白血病是一組起源于造血干/祖細胞的惡性克隆增殖性疾病，迄今治療仍主要采用大劑量聯合化療，此法副作用大、復發(fā)率高，且對正常機體免疫與造血系統(tǒng)有極大的損害。尋找既能抑制白血病細胞惡性增殖、誘導凋亡，副作用又相對較小的天然藥物已成為治療白血病新的思路。白血病干細胞異常增生與分化與白血病有密切的聯系。我們最近研究證明，衰老白血病干細胞的β半乳糖苷酶(SA-β-gal)表達顯著升高；G1期細胞的百分比增高；體外培養(yǎng)形成CFU-Mix能力降低[12-16]。

近年來我們探索了Rg1對白血病干細胞衰老調控作用，初步結果已提示，人參皂苷Rg1對正常造血干細胞和腫瘤干細胞增殖分化有雙向調節(jié)作用，對腫瘤干細胞的增殖有明顯抑制并能誘導其向成熟方向分化?；谖覀兗韧ぷ鞣e累和復習文獻，我們推測Rg1能通過調控LSCs等腫瘤干細胞衰老對腫瘤起到輔助治療作用。如果這一理論被證實，不僅對中醫(yī)藥的衰老與抗衰老理論、中醫(yī)藥對干細胞的認識、建立干細胞衰老研究平臺、篩選天然藥物抗衰老有效成分均有重要貢獻，而且對臨床腫瘤治療新途徑摸索也有重要意義[17-23]。

通過本研究得知慢性髓細胞白血病患者的CD34+/CD38-細胞，即白血病干細胞，較健康人的CD34+/CD38-細胞出現逆衰老，不僅體現在白血病Rg1組CD34+/CD38-細胞的SA-β-半乳糖苷酶陽性細胞率比白血病對照組高，還體現在增殖能力，白血病對照組的CD34+/CD38-細胞集落數量明顯高于其他組，集落中的細胞數也高于其他組，細胞雜亂無章，且細胞體積增大。說明慢性髓細胞白血病患者的CD34+/CD38-細胞較健康人的CD34+/CD38-細胞增殖能力大大增加，集落細胞增大，排列不規(guī)則，即異常增殖。從細胞周期情況來看，正常對照組及正常Rg1組較白血病對照組出現明顯的G1期阻滯， 其G0/G1期比例明顯增高，S期比例減少，而白血病對照組多數CD34+/CD38-細胞進入S期，意味著其具有活躍的增生能力。CCK-8增殖曲線可以看出白血病未干預組的增殖速度遠遠快于其他兩組，且對應時間的細胞數量也高于其他組。而各實驗中白血病Rg1組的增殖速率及增殖能力相比白血病對照組出現下降，說明人參皂苷Rg1可以有效抑制白血病干細胞的異常增殖情況。而在細胞衰老實驗中，白血病Rg1組的SA-β-半乳糖苷酶陽性細胞率明顯高于白血病對照組，說明人參皂苷Rg1可能是通過誘導白血病干細胞趨向了衰老來削弱其增殖能力的。

白血病患者由于某些惡劣因素的影響可能會導致造血干細胞增殖性增強，趨于惡性化，演變成白血病干細胞，導致造血系統(tǒng)惡性腫瘤，這可能是白血病的治療效果不好，容易復發(fā)的根本原因。本研究提示，人參皂苷Rg1可誘導白血病干細胞衰老抑制白血病干細胞的增殖分化，控制惡性腫瘤細胞大量擴增，進而控制慢性髓細胞白血病病情的發(fā)展，后續(xù)研究我們將深入研究其機制及臨床應用的可行性，以期為白血病的防治提供參考依據。

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