楊昌培 張 潛

(遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，遵義 563003)

糖尿病足(diabetic foot, DF)是糖尿病的常見并發(fā)癥，系由糖尿病引發(fā)的下肢神經(jīng)和血管病變導(dǎo)致，進(jìn)一步發(fā)展可加重為足部潰瘍和(或)深層組織破壞，并可伴發(fā)創(chuàng)面感染，也即出現(xiàn)糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer, DFU)的嚴(yán)重情況。多發(fā)生于病程長，血糖控制差的糖尿病患者。目前糖尿病足還缺乏有效的治療手段，預(yù)后差。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病足占到了所有因糖尿病有關(guān)問題住院比例的47%，且糖尿病足患者一生中發(fā)生足潰瘍的比例可達(dá)15%以上[1]。DFU形成后很難完全愈合，14%～24%的DFU患者最終面臨截肢的無奈選擇[2]，有截肢適應(yīng)癥的DFU患者5年死亡率也高達(dá)39%～80%，接近惡性腫瘤的死亡率水平[3-4]。由于DFU缺乏有效的治愈手段，使得探尋新的治療策略顯得極為迫切，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)及其分泌的相關(guān)細(xì)胞因子在治療DFU取得的良好療效正好為其治療帶來了新希望。本文就MSCs及其衍生物治療DFU的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述如下。

1 糖尿病足潰瘍的形成

糖尿病足的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，通常認(rèn)為與糖尿病后周圍血管病變、神經(jīng)病變及一些致傷因素引發(fā)。糖尿病足周圍血管病變主要見于股動脈、腘動脈、脛前動脈、脛后動脈以及膝關(guān)節(jié)以下的中、小血管，呈多部位多節(jié)段受累特征，病理基礎(chǔ)為糖尿病后加速形成的廣泛的動脈粥樣硬化所致。動脈粥樣硬化導(dǎo)致的周圍血管病變，尤其是下肢動脈遠(yuǎn)端閉塞是糖尿病足的主要原因，也是糖尿病足截肢的主要原因。糖尿病足下肢動脈嚴(yán)重狹窄抑或閉塞將導(dǎo)致局部組織氧供和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，任何輕微的皮膚破損都易導(dǎo)致皮膚潰瘍的發(fā)生，DFU惡化導(dǎo)致深部組織感染或壞疽的最終截肢率高達(dá)85%[5]。糖尿病周圍神經(jīng)病變率可達(dá)61.5%[6]，與糖尿病足血管病變一起對糖尿病足的形成和加重及DFU病情起到推波助瀾的不良作用。

2 糖尿病足潰瘍難愈原因

O′Loughlin 等[7]認(rèn)為DFU難以愈合的一個主要因素是創(chuàng)口的血管生成受阻。實(shí)驗(yàn)證實(shí)糖尿病創(chuàng)口難愈合是由于淋巴細(xì)胞中谷胱甘肽還原物質(zhì)降低和過氧化氫酶活性升高使局部氧化應(yīng)激增強(qiáng)；促凋亡基因Fas、Bax、Caspase-3的高表達(dá)及抑凋亡基因Bcl-2低表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞過度凋亡[8]，氧化應(yīng)激的增加與細(xì)胞調(diào)亡進(jìn)一步加重使傷口上皮化延遲，愈合困難。研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表達(dá)下調(diào)和白介素6(interleukin-6, IL-6)表達(dá)增多或兩種因子活性改變導(dǎo)致組織修復(fù)能力下降，成為慢性潰瘍創(chuàng)面長期不愈合的原因之一[9]。研究還發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路參與了糖尿病創(chuàng)面愈合過程，創(chuàng)面難以愈合與Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)[10]。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞治療糖尿病足潰瘍的研究

MSCs由于具有組織來源廣泛，取材方便，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，適宜條件下可向三胚層不同細(xì)胞分化的能力[11]，免疫原性低等特點(diǎn)而成為學(xué)界關(guān)注的研究熱點(diǎn)。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，MSCs除了可分化為各種功能細(xì)胞發(fā)揮治療作用外，其還具有炎癥免疫調(diào)節(jié)能力[12]，成為MSCs治療疾病的重要新機(jī)制，這對于治療包括難治性創(chuàng)面的修復(fù)等疾病具有重要的理論意義。有研究采用人臍血CD34+干細(xì)胞局部注射到糖尿病大鼠后足創(chuàng)面，檢測后顯示創(chuàng)面成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡減少，獲得了良好的皮膚創(chuàng)面愈合效果[13]。通過大鼠股動脈注入人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)治療大鼠DFU，結(jié)果表明，hUC-MSCs-特異性富集于目標(biāo)潰瘍組織，并通過刺激角質(zhì)形成細(xì)胞釋放細(xì)胞角蛋白19(CK19)和細(xì)胞外基質(zhì)而促進(jìn)潰瘍組織再上皮化[14]。同樣療法用于治療存在股神經(jīng)變性及足潰瘍的糖尿病大鼠，測到血清神經(jīng)生長因子(NGF)濃度上調(diào)，腓腸肌毛細(xì)血管密度增加，股神經(jīng)纖維排列松馳、軸突萎縮有明顯改善，傳導(dǎo)功能得到恢復(fù)[15]。來源于脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived mesenchymal stem cells, AD-MSCs)聯(lián)合腸促胰島素類似物(exendin-4, Ex-4)對創(chuàng)面內(nèi)皮細(xì)胞具有促血管生成的作用，并有助于加速糖尿病創(chuàng)面再上皮化和傷口閉合[16]。人AD-MSCs對糖尿病大鼠足背全層皮膚創(chuàng)傷修復(fù)有明顯的影響，第15 d潰瘍面積顯著減少，有較多的肉芽組織形成，同時在傷口床中檢測到較高水平的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及堿性成纖維生長因子(bFGF)表達(dá)。研究表明，人AD-MSCs移植具有促進(jìn)糖尿病大鼠足創(chuàng)傷愈合的能力，提示其有望成為DFU的臨床治療新手段[17]，還有賴于進(jìn)一步的臨床研究予以確定。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)注射到糖尿病小鼠背部皮膚創(chuàng)口周邊組織內(nèi)，發(fā)現(xiàn)BM-MSCs可通過旁分泌胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor-1, IGF-1)降低創(chuàng)口胰島素抵抗并促進(jìn)潰瘍愈合[18]。O′Loughlin 等[7]采用載有異基因BM-MSCs的膠原支架填充于糖尿病兔耳潰瘍創(chuàng)面上，顯示這一療法能促進(jìn)潰瘍愈合及血管生成。 筆者采用VEGF基因修飾的BM-MSCs局部肌肉注射移植治療，組織切片血管密度分析和數(shù)字減影血管造影(DSA)結(jié)果均顯示移植大鼠的后肢血管密度明顯提高，并能改善糖尿病大鼠后肢缺血[19-20]。葛勝潔等[21]采用糖尿病足患者自體外周血干細(xì)胞懸液，按3 cm×3 cm間距沿小腿病變動脈行走多點(diǎn)肌肉注射，6個月后增強(qiáng)CT檢查見有新生側(cè)支血管形成，且疼痛、麻木緩解，皮溫升高，創(chuàng)面愈合比常規(guī)內(nèi)科綜合治療的對照組更快，所有實(shí)驗(yàn)組50人中無一例患者發(fā)生截肢，移植后1月～7年內(nèi)隨訪所有患者均未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)和并發(fā)癥。

4 間充質(zhì)干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子促進(jìn)糖尿病足潰瘍愈合的研究

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs還可通過分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)創(chuàng)面愈合。通過對hUC-MSCs條件培養(yǎng)基的檢測，發(fā)現(xiàn)其含高濃度的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、VEGF、白介素8(IL-8)、表皮生長因子(EGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(SDF-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)等，這些因子能保護(hù)與逆轉(zhuǎn)受損的神經(jīng)元，促進(jìn)血管生成及上皮化，吸引循環(huán)中的干細(xì)胞、祖細(xì)胞，遷移和滲透到靶組織并啟動再生與修復(fù)[22]。采用臍血源內(nèi)皮祖細(xì)胞移植到糖尿病小鼠創(chuàng)口后，創(chuàng)口組織人角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)和血小板源生長因子(PDGF)表達(dá)升高，角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖活躍，創(chuàng)面愈合明顯提速[23]。García等[24]證實(shí)大鼠BM-MSCs在添有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)可產(chǎn)生NGF和膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)；林育輝等[25]用ELISA檢測BM-MSCs在體外無血清培養(yǎng)條件下具有分泌VEGF的功能，且在72h內(nèi) VEGF分泌達(dá)最高峰，上述研究表明，MSCs具有與生俱來的細(xì)胞因子分泌和調(diào)節(jié)作用能力，也是MSCs發(fā)揮旁分泌效應(yīng)的生物學(xué)基礎(chǔ)。Schink?the等[26]利用細(xì)胞因子微陣列分析體外擴(kuò)增的BM-MSCs的分泌譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在120種細(xì)胞因子陣列中有44種顯著增加，這些因子具有促血管生成、免疫抑制、抗凋亡、促細(xì)胞增殖的作用，進(jìn)一步佐證了上述干細(xì)胞旁分泌作用的理論。近年來，越來越多的研究證實(shí)MSCs可通過分泌內(nèi)含多種細(xì)胞因子等活性成分的外泌體發(fā)揮治療作用[27]，將人胎盤組織來源的MSCs外泌體(PLAMSCs EXO)皮下注射進(jìn)入小鼠耳廓后，增強(qiáng)了小鼠耳廓創(chuàng)面缺血性損傷模型的血管生成，提示PLAMSCs EXO在促血管生成活性中起重要作用。PLAMSC EXO可能是治療缺血性疾病尤其是并有下肢血管狹窄或閉塞的DFU一種新的治療方法[28]。這為今后提純干細(xì)胞外泌體直接用于各種組織損傷性疾病的治療提供了新的理論依據(jù)，并可避免采用干細(xì)胞移植的致瘤性風(fēng)險等的擔(dān)憂，且有比干細(xì)胞更好確定標(biāo)準(zhǔn)治療劑量的優(yōu)點(diǎn)。

研究證實(shí)，MSCs分泌的PDGF、bFGF、 VEGF、BDNF等細(xì)胞因子對 DFU具有治療作用，但生長因子是小分子蛋白，潰瘍局部微環(huán)境的理化性質(zhì)易影響其生物活性，且DFU是慢性病程，需生長因子長時間恒定維持在有效濃度范圍才能發(fā)揮最大作用。為維持生長因子在慢性潰瘍局部達(dá)有效濃度，Losi等[29]用載有VEGF及bFGF的聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)制成的納米顆粒，分別置于聚二甲硅氧烷及纖維蛋白支架上，填充于患有遺傳性糖尿病小鼠的背部創(chuàng)口，觀察到載有生長因子的2種支架在促創(chuàng)口肉芽組織形成、膠原沉積和再上皮化均優(yōu)于不含生長因子的對照組。Choi 等[30]用結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的表皮生長因子和bFGF，加載到具有生物相容性透明質(zhì)酸膠原敷料基質(zhì)中，再將其用于糖尿病小鼠潰瘍治療，結(jié)果顯示材料中的生長因子可穩(wěn)定釋放，促進(jìn)了創(chuàng)面組織再上皮化、新生血管形成和膠原沉積，明顯改善創(chuàng)面愈合的速度與質(zhì)量。將BDNF刺激預(yù)置有MSCs的電紡生物材料一并移植到后肢缺血小鼠的潰瘍創(chuàng)面上，觀察到創(chuàng)面組織中有較多新生血管形成；該研究結(jié)果表明，BDNF可通過誘導(dǎo)MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，從而加速缺血性潰瘍創(chuàng)面的愈合[31]。這些研究提示，恰當(dāng)?shù)母杉?xì)胞投遞方式(如聯(lián)合不同的組織工程材料等)對干細(xì)胞發(fā)揮治療效應(yīng)及今后臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究等均具有重要意義。

綜上所述，DFU是臨床常見的慢性難治性創(chuàng)面之一，主要系糖尿病足后下肢缺血進(jìn)一步發(fā)展導(dǎo)致的嚴(yán)重并發(fā)癥，目前還缺乏有效的治愈手段。近年來，隨著以MSCs為主要候選干細(xì)胞用于包括糖尿病足及DFU的治療研究不斷取得的新進(jìn)展，為治愈DFU帶來了新的希望?，F(xiàn)有的研究表明，MSCs可單獨(dú)或結(jié)合分泌的各種活性細(xì)胞因子，通過移植后的體內(nèi)分化和旁分泌效應(yīng)尤其是后者發(fā)揮對DFU的治療作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)MSCs可分泌富含各種細(xì)胞因子及調(diào)節(jié)性miRNA等生物活性成分的外泌體，使得采用外泌體治療包括DFU在內(nèi)的組織損傷性難治性疾病成為新的關(guān)注熱點(diǎn)，這比以往直接采用干細(xì)胞用于移植治療更為安全且療效一致，為干細(xì)胞技術(shù)的臨床應(yīng)用提供了新的途徑和思路。此外，采用不同的材料或結(jié)合細(xì)胞因子投遞干細(xì)胞也是近年來的研究熱點(diǎn)，這對今后采用MSCs及其衍生物治療DFU的臨床轉(zhuǎn)化研究具有重要意義。