肖 莉 鐘坪杉 吳鵬俐 陽(yáng)德飛 陳曉琴 楊 拯 李 健△

(成都醫(yī)學(xué)院， 1 人體解剖學(xué)教研室， 2 2013級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)， 3 2014級(jí)麻醉學(xué)專業(yè)， 4 2014級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)， 5 2015級(jí)醫(yī)學(xué)影像學(xué)專業(yè)， 6實(shí)驗(yàn)技術(shù)教研室， 成都 610500)

肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)是肝及創(chuàng)傷外科手術(shù)常見的病理生理過程[1]。HIRI是一個(gè)級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)過程，涉及肝微血管紊亂、Kupffer細(xì)胞激活、炎性細(xì)胞因子等多種因素的參與[2-3]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，活化的MMP-9通過降解血管內(nèi)皮細(xì)胞及肝竇細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞跨越內(nèi)皮細(xì)胞間隙及肝竇ECM向缺血再灌注組織遷移、浸潤(rùn)[4-5]。半胱天冬酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1)是與機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的一種蛋白酶，可促進(jìn)白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-18和IL-33等細(xì)胞因子成熟，而IL-1β、IL-18 在肝缺血再灌注損傷中起重要作用。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是腎在低氧環(huán)境下產(chǎn)生的一種能夠刺激紅細(xì)胞生成和分化的細(xì)胞因子。有研究表明EPO對(duì)HIRI具有保護(hù)作用[6-7]，但是否通過抑制MMP-9、caspase-1介導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)仍未明確。本研究通過建立肝缺血再灌注模型，觀察EPO對(duì)HIRI相關(guān)因子MMP-9、caspase-1表達(dá)及病理形態(tài)學(xué)的影響，探討EPO對(duì)HIRI的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組

選用四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供的健康SPF級(jí)的SD大鼠50只，雄性，體質(zhì)量(200±20)g。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將實(shí)驗(yàn)大鼠分為5組，每組10只，缺血再灌注損傷組(I/R組)，促紅細(xì)胞生成素低劑量組(L組)、中劑量組(M組)、高劑量組(H組)、假手術(shù)組。

1.2 藥品及試劑

EPO(商品名：重組人促紅素注射液，沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司)；MMP-9抗體、caspase-1抗體、SABC免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)于武漢博士得生物工程有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶測(cè)量試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶測(cè)量試劑盒丙二醛測(cè)量試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；GAPDH抗體，山羊抗兔IgG購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 模型的制備和取材

大鼠在實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。缺血前1 h, 低、中、高劑量組分別給予腹腔注射EPO 1 000、3 000、5 000 U/kg，I/R組及假手術(shù)組腹腔注射生理鹽水。10%水合氯醛麻醉，上腹正中切開進(jìn)腹，用小號(hào)無(wú)損傷動(dòng)脈夾阻斷肝左中葉的門靜脈和肝動(dòng)脈。1 h后，松開動(dòng)脈夾恢復(fù)阻斷區(qū)血供，建立肝部分I/R模型。假手術(shù)組于僅暴露肝門，但不阻斷血管。再灌注3 h后即可開始取材，右心房抽取靜脈血4～5 ml，用于血清肝酶學(xué)檢測(cè)。取肝左中葉部分組織用4%的多聚甲醛固定用于H-E染色及免疫組織化學(xué)檢測(cè)MMP-9、caspase-1的表達(dá)，另一部分采用免疫印跡法檢測(cè)MMP-9、caspase-1的表達(dá)。

1.4 H-E染色

將制作好的石蠟切片放入65℃烘箱烤片2 h，常規(guī)脫蠟至水。蘇木精5 min，蒸餾水洗滌，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，蒸餾水洗滌，伊紅1～2 min，蒸餾水洗滌，脫水、透明、封片。

1.5 免疫組織化學(xué)測(cè)定MMP-9、caspase-1的含量

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性5～10 min，PBS沖洗5 min×3次，熱修復(fù)抗原。將切片浸于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，微波爐加熱8 min，反復(fù)2次。冷卻后PBS洗滌3次。滴加5%的BSA封閉液，37℃孵育30 min，甩干。滴加一抗MMP-9和caspase-1稀釋100倍，4℃過夜，PBS沖洗5 min×3次。滴加生物素標(biāo)記兔抗大鼠IgG，37℃孵育30 min；PBS沖洗5 min×3次。滴加SABC，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色。蘇木精復(fù)染75 s，脫水、透明、中性樹膠封片。

1.6 免疫印跡測(cè)定MMP-9、caspase-1的表達(dá)

將肝組織剪碎，將組織和裂解液按照1∶9的比例混合，置于冰上，用玻璃棒將組織打成勻漿，以12 000 r/min，4℃，離心取上清。蛋白定量分裝成200 μl/管，按照4∶1的比例加入Loading Buffer，混勻。進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，TBST洗5 min×4次。5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗5 min×4次，分別加入一抗MMP-9和caspase-1稀釋1 000倍，GAPDH稀釋5 000倍。4℃搖床孵育過夜，加入二抗(山羊抗兔IgG，稀釋1 000倍)，TBST洗5 min×4次，壓片曝光。

1.7 酶學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

比色法檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求操作，試劑混勻后在室溫放置15 min，510 nm波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀測(cè)各孔OD值。絕對(duì)OD值=測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值，根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出對(duì)應(yīng)ALT及AST活力單位。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)觀察

肝組織切片顯示：I/R組肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，肝細(xì)胞索排列紊亂；肝細(xì)胞出現(xiàn)變性、腫脹，氣球樣變，大量片狀壞死；壞死區(qū)域可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。不同濃度EPO預(yù)處理組中肝細(xì)胞索排列較好，肝小葉破壞不明顯，肝細(xì)胞水腫、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況較I/R組均有明顯的改善。EPO預(yù)處理各組比較，中劑量組肝小葉大致正常，肝細(xì)胞輕度腫脹，其病變程度與低、高劑量組相比明顯減輕(圖1)。

2.2 MMP-9免疫組織化學(xué)顯色及陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)

肝組織MMP-9免疫組織化學(xué)顯色陽(yáng)性反應(yīng)物主要表達(dá)于中央靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及血管旁的肝細(xì)胞胞質(zhì)，以中央靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)量最高，呈棕黃色。其中I/R組表達(dá)范圍與EPO預(yù)處理各組相比較范圍更廣且表達(dá)量也明顯增加，大血管內(nèi)皮細(xì)胞及周邊的肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)均有MMP-9的表達(dá)。EPO預(yù)處理各組比較，中劑量組MMP-9的表達(dá)范圍及表達(dá)量較其余2組明顯減少(圖2 A-E)。在相同的光源，隨機(jī)選擇5個(gè)互不相交叉的視野在400倍光鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示I/R組大鼠的MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最高(5.4±0.67)，EPO預(yù)處理組MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于 I/R 組(P<0.05)。EPO預(yù)處理各組比較，中劑量組的MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)率最低(3.2±0.85)，顯著低于低劑量組(4.1±0.78)和高劑量組(4.4±0.52)(P<0.05)。假手術(shù)組的MMP-9基本無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(1.8±0.87)。

2.3 Caspase-1免疫組化及陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：caspase-1主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管旁的肝細(xì)胞胞質(zhì)，呈棕黃色(圖2 F～J)。將染好的切片在10×40倍視野下隨機(jī)選擇5個(gè)互不相交叉的視野，統(tǒng)計(jì)caspase-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果顯示I/R組的caspase-1陽(yáng)性細(xì)胞(5.2±0.79)表達(dá)最高；EPO預(yù)處理組caspase-1的陽(yáng)性表達(dá)明顯低于I/R組(P<0.05)，其中中劑量組(3.2±0.63)較低劑量組(4.0±0.70)及高劑量組(4.3±0.82)MMP-9的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)最低(P<0.05)。假手術(shù)組基本無(wú)caspase-1陽(yáng)性表達(dá)(1.7±1.01)。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)改變(H-E染色，×200)。A：I/R組；B：低劑量組；C：中劑量組；D：高劑量組；E：假手術(shù)組.

2.4 免疫印跡檢測(cè)MMP-9、caspase-1的表達(dá)

對(duì)應(yīng)的條帶位置出現(xiàn)目的蛋白，MMP-9在92 kD處，caspase-1在45 kD處，GAPDH在36 kD處。MMP-9檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組(0.34±0.04)相比，I/R組MMP-9的表達(dá)顯著升高(1.64±0.11，P<0.05)。EPO預(yù)處理后，MMP-9的表達(dá)均得到了不同程度的抑制，高、中、低劑量組分別為0.94±0.19、0.80±0.05、1.05±0.07。中劑量組對(duì)MMP-9的表達(dá)抑制作用最明顯， 與I/R組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與其他不同濃度組對(duì)MMP-9的表達(dá)差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Caspase-1檢測(cè)結(jié)果顯示：經(jīng)缺血再灌注損傷后，與假手術(shù)組(0.75±0.04)相比，I/R組caspase-1的表達(dá)顯著升高(1.19±0.11，P<0.05)。EPO預(yù)處理組，capase-1的表達(dá)得到了不同程度的抑制，高、中、低劑量組分別為0.92±0.11、0.86±0.08、1.08±0.08。其中中劑量組對(duì)caspase-1表達(dá)的抑制作用最明顯，與I/R組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與其他不同濃度組對(duì)capase-1的表達(dá)差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 各組肝組織MMP-9、caspase-1的蛋白表達(dá)Fig 3 Expression of MMP-9 and caspase-1 protein in liver tissues

2.5 轉(zhuǎn)氨酶水平測(cè)定

血清轉(zhuǎn)氨酶升高，在一定程度上反映了肝細(xì)胞損害和壞死的程度。表1顯示，I/R組血清ALT、AST水平最高； 中劑量組血清ALT、AST水平顯著低于低劑量組和高劑量組；假手術(shù)組血清ALT、AST水平最低。各組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 血清轉(zhuǎn)氨酶水平的測(cè)定Tab 1 The level of serum transaminase l in each group of rats

3 討論

3.1 MMP-9、caspase-1在HIRI中的作用

HIRI是肝膽外科手術(shù)中常見的病理生理現(xiàn)象，其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，可能涉及鈣超載、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及凋亡等。但具體的發(fā)生機(jī)制、所涉及的信號(hào)通路及相關(guān)細(xì)胞因子尚不清楚[8]。大量研究表明，炎癥反應(yīng)是HIRI的主要機(jī)制之一，抑制缺血再灌注損傷過程中的炎癥反應(yīng)可以減輕HIRI[9-10]，但目前針對(duì)具體的炎癥細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)研究較少。MMP-9主要由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥反應(yīng)中能加速白細(xì)胞的募集、細(xì)胞因子釋放以及促進(jìn)基質(zhì)降解改建。Andrej 等[11]的研究表明MMP-9介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)在肝缺血再灌損傷過程中起著非常關(guān)鍵的作用。缺血再灌注后中性粒細(xì)胞激活內(nèi)皮細(xì)胞，上調(diào)并活化MMP-9，而MMP-9作為一種蛋白水解酶能夠降解內(nèi)皮細(xì)胞基底膜及肝細(xì)胞外基質(zhì)，介導(dǎo)黏附于內(nèi)皮細(xì)胞的中性粒細(xì)胞跨越內(nèi)皮細(xì)胞間隙及細(xì)胞外基質(zhì)向肝缺血再灌注區(qū)域浸潤(rùn)；同時(shí)激活的中性粒細(xì)胞在遷移的過程中還不斷產(chǎn)生促炎因子TNF-α、IL-1β及ROS誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞等細(xì)胞上調(diào)MMP-9的表達(dá)與活化，加強(qiáng)肝細(xì)胞外基質(zhì)的降解；而被激活的MMP-9又能反作用于中性粒細(xì)胞，上調(diào)TNF-α、IL-1β等促炎因子的表達(dá)，并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化遷移。在MMP-9及中性粒細(xì)胞的相互作用下，最終介導(dǎo)大量中性粒細(xì)胞遷移至缺血再灌注區(qū)域，并通過多種機(jī)制參與肝損傷[12-13]。Caspase-1又稱為IL-1β轉(zhuǎn)化酶，可見于包括巨噬細(xì)胞等在內(nèi)的多種細(xì)胞，亦可表達(dá)于Kupffer細(xì)胞?；罨腸aspase-1的功能是可剪切pro-IL-1β、pro-IL-18，從而產(chǎn)生成熟的IL-1β、IL-18，從而誘導(dǎo)級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)介導(dǎo)缺血再灌注損傷[14-15]。

3.2 EPO預(yù)處理對(duì)HIRI的保護(hù)作用

EPO是一種刺激骨髓造血的糖蛋白類激素。其基本作用是促進(jìn)紅細(xì)胞生成，并可以通過在多種非紅系組織細(xì)胞中，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞、子宮等器官表達(dá)的促紅細(xì)胞生成素受體(erythropoietin receptor，EPOR)結(jié)合，形成EPO-EPOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，參與多種非造血生物活動(dòng)[16-18]。越來(lái)越多的研究表明EPO具有細(xì)胞和組織器官的保護(hù)作用，對(duì)心、腦、腎等發(fā)生缺血再灌注時(shí)具有保護(hù)作用。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，EPO具有極強(qiáng)的抗炎活性和促紅細(xì)胞生長(zhǎng)作用和抗凋亡作用。陳茂松等[19]的研究表明，EPO能抑制炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而減輕肝缺血再灌注過程中的炎癥反應(yīng)。Li等[20]研究表明EPO對(duì)caspase-1有抑制作用，能夠減輕炎癥反應(yīng)。但是否能通過抑制MMP-9及caspase-1的表達(dá)從而減輕HIRI尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，I/R組肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞出現(xiàn)變性、腫脹，氣球樣變，大量片狀壞死，壞死區(qū)域可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，血清肝酶學(xué)指標(biāo)顯示I/R組的血清ALT、AST水平均較假手術(shù)組顯著升高，提示缺血再灌注對(duì)肝組織造成了明顯的損傷。EPO預(yù)處理組顯示肝細(xì)胞索排列較好，肝小葉破壞不明顯，肝細(xì)胞水腫，壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況較I/R組均有明顯的改善且血清ALT、AST水平同I/R組比較均顯著降低，說(shuō)明在肝缺血再灌注前使用EPO能夠顯著改善肝的病理?yè)p傷及降低血清中相關(guān)的酶學(xué)指標(biāo)，對(duì)肝功能的保護(hù)有益，可以減輕肝缺血再灌注損傷。病理學(xué)及肝酶學(xué)結(jié)果均證實(shí)中劑量組即3 000 U/kg的EPO預(yù)處理組對(duì)大鼠肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用優(yōu)于高和低劑量組。因此EPO預(yù)處理對(duì)HIRI具有保護(hù)作用，3 000 U/kg的EPO治療可能是治療大鼠HIRI的最適劑量。此外，MMP-9及caspase-1在各組的表達(dá)情況也不相同，I/R組MMP-9的表達(dá)增強(qiáng)，大血管內(nèi)皮細(xì)胞及周邊的肝細(xì)胞均有MMP-9的表達(dá)，EPO可顯著抑制MMP-9的表達(dá)。EPO預(yù)處理能明顯緩解大鼠肝缺血再灌注損傷可能與其抑制MMP-9的表達(dá)，從而減少中性粒細(xì)胞的遷移浸潤(rùn)及降低其炎癥介質(zhì)的釋放以及抑制了細(xì)胞外基質(zhì)的降解有關(guān)。缺血再灌注后，caspase-1的表達(dá)也顯著升高，免疫組織化學(xué)顯色及免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示EPO預(yù)處理可以顯著抑制caspase-1的表達(dá)。說(shuō)明EPO可能是通過抑制caspase-1的表達(dá)和活化，抑制其下游炎性因子IL-1β和IL-18的成熟及分泌，從而減輕肝缺血再灌注損傷。EPO的這種保護(hù)機(jī)制可能與EPO能減弱caspase-1活化，導(dǎo)致IL-1β分泌減少，進(jìn)而下調(diào)MMP-9的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。EPO預(yù)處理各組MMP-9及caspase-1的表達(dá)量在中劑量組即3 000 U/kg組中表達(dá)量最少。

綜上所述，EPO處理對(duì)大鼠HIRI具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制炎癥反應(yīng)及caspase-1和MMP-9的表達(dá)來(lái)減輕肝缺血再灌注損傷，并且3 000 U/kg的EPO預(yù)處理組的抗炎作用效果最佳。