李　麗，周桐希

多年研究實踐表明：運動成績的取得與運動天賦和刻苦的訓練密不可分，經(jīng)過嚴格和刻苦的訓練并不一定能取得優(yōu)秀的運動成績，其原因在于不同人帶有不同遺傳素質(zhì)基因，也就是運動天賦不同.只有具有優(yōu)秀運動基因的人經(jīng)過科學訓練才能獲得優(yōu)異成績.縱觀我國運動員選材的發(fā)展，主要為經(jīng)驗選材法［1］、形態(tài)學選材法、家族選材法、PTC嘗味能力選材法、皮紋選材法、血型選材法及生理生化指標選材法.以上選材方法不能得出客觀、準確的結(jié)論.

目前，分子生物學技術(shù)已得到廣泛的應用，國內(nèi)外學者在運動相關基因研究領域進行大量研究，已取得了有意義的成果.cntf（ciliary neuro?trophic factor）基因全稱為睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子.cntf能夠促進突觸處神經(jīng)分化，故神經(jīng)發(fā)生損傷時能起到修復作用，即使神經(jīng)元沒發(fā)生損傷也能延緩其衰退［2］.Oppenheim RW［3］證實 cntf可維持運動神經(jīng)元正常活動從而延緩其衰退；Anderson KD、Emerich DF和Emerich DF［4-6］實驗證實外源性的cntf對被損傷的神經(jīng)有修復作用.相關研究表明cntf基因多態(tài)性與力量素質(zhì)相關.近年來對于cntf基因與運動能力的相關性研究較少，黃昌林等［7］通過對攜帶AG基因型和GG基因型的我國軍人（男性、漢族）的握力測試，實驗研究的結(jié)果顯示此兩種基因型的力量與體指數(shù)無統(tǒng)計學差異.韓偉等［8］對我國越野滑雪運動員cntf基因三種基因型與普通人進行實驗研究得出的結(jié)論是無統(tǒng)計學差異.

基因選材是一種準確、客觀、科學的選材依據(jù)，需要大量的實驗數(shù)據(jù)支持.冰雪項目基因選材方面的工作現(xiàn)在還沒有得到全面的開展，缺少運動項目、實驗方面的數(shù)據(jù)支持.2022年冬奧會在我國舉行，冬季項目選材和訓練工作得到重視.此項目現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)了一批具有世界水平的運動員，但后備人材的短缺制約著項目長期發(fā)展.利用當前優(yōu)秀運動員的寶貴資源，對他們進行相關選材指標尤其是基因指標的測定，對于我國建立優(yōu)秀運動員選材模型具有重要意義.本課題研究旨在對cntf基因能否作為雪上技能主導類運動員基因選材指標進行篩選，可為冰雪運動員的基因選材做前期積累工作.

1　研究對象與方法

1.1　研究對象

東北地區(qū)單板大跳臺和坡式障礙優(yōu)秀運動員為實驗組，普通高校大學生為對照組.

實驗組：東北地區(qū)單板大跳臺和坡式障礙優(yōu)秀運動員為實驗組.測試對象：東北地區(qū)單板大跳臺和坡式障礙優(yōu)秀運動員21名（女11名、男子10名）.國際運動健將級別運動員2名，國家一級運動員5名，其余為國家二級運動員.平均運動年限7年，年齡在10～26歲.

對照組：選取參加全國高考的非體育專業(yè)考生，在高中階段未參加過系統(tǒng)的體育訓練，未曾經(jīng)過體育術(shù)科考試，進入體院后沒有進行專項訓練.運動人體科學專業(yè)、體育人文專業(yè)本科生共115名.所有測試人員種族一致，年齡在16～23歲；調(diào)查表明本人無任何重大疾病，測試時保證身體健康.以上參加測試的人員均來自于中國北方漢族.

1.2　實驗內(nèi)容

采用分子生物學PCR-RFLP的方法對實驗組和對照組的cntf基因A/G多態(tài)性進行測定.

1.3　主要實驗儀器

PCR擴增儀（德國艾本德股份公司GSX1）；電泳儀（北京市六一儀器廠DYY-6D）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Protein Simple公司Alphaimager Mini）.

1.4　實驗操作主要過程

（1）全血DNA提取.靜脈取新鮮全血5ml放入到帶抗凝劑的試管中，按照普瑞麥格全血DNA攝取試劑盒操作.

（2）設計cntf基因的引物.查找Gene Bank數(shù)據(jù)庫嚴格按照引物設計原則.依據(jù)Thome［9］等報道的cntf的引物序列和cntf基因多態(tài)位點的特點，利用Primer select 5.0軟件來設計引物，提供給生物科技公司，由上海捷瑞公司合成，放在冰箱中保存.

（3）擴增cntf基因.擴增cntf基因的反應體系包括：Taq 酶 0.25μl、5×Taq Buffer 5μl、dNTP 0.5μl、滅菌雙蒸水15.25μl、上下游引物各1μl、以及DNA模板2μl，共25μl.

（4）cntf基因 PCR擴增參數(shù).95℃預變性5min；94℃變性5min35s、58℃退火30s、72℃延伸15s，共循環(huán)36次；72℃終末延伸8min；4℃保存.

（5）cntf基因A/G多態(tài)位點的酶切反應體系.cntf基因A/G多態(tài)位點的酶切反應體系包括：HaeⅢ限制性內(nèi)切酶0.4μl、Buffer 0.2μl、BSA 0.1μl，以及擴增產(chǎn)物17.3μl，共18μl.

（6）電泳.依據(jù)所測得物質(zhì)的分子量來確定濃度為：DNA由于分子量大確定濃度為0.8%；cntf基因經(jīng)過酶切分子量濃度為3%.設置電泳儀器U=100V、P=50W、I=50mA，時間50min.電泳完畢后，觀察凝膠采用紫外可見光分析裝置，利用軟件分析結(jié)果.

1.5　數(shù)據(jù)統(tǒng)計

（1）對照組和實驗組的基因型頻率分布運用基因平衡定律（Hardy-Weinberg，H-W）對其進行檢驗，確定所測人群的群體代表性，利用遺傳學統(tǒng)計方法對三種基因不同多態(tài)性的頻率和等位基因進行整理.

（2）用SPSS統(tǒng)計學軟件對所得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，用卡方對基因型和等位基因頻率進行檢驗，（P＜0.05）為顯著差異，（P＜0.01）極其顯著差異.

2　cntf基因A/G多態(tài)性的實驗結(jié)果

（1）cntf基因A/G多態(tài)性的判斷.睫狀神經(jīng)因子cntf基因保證雞胚睫狀神經(jīng)元最初從雞眼睛中提取.它是一個酸性蛋白質(zhì)，具有200個殘基的氨基酸，是一種細胞因子，屬于白介素6家族.人的cntf基因定位第11號染色體長臂近端，由兩個外顯子和一個1kb左右內(nèi)含子組成，本實驗中HaeⅢ酶切多態(tài)位點位于第二個外顯子和內(nèi)含子之間，設計引物擴增后的長度為134bp，用HaeⅢ酶切后所得到產(chǎn)物G等位基因是40bp和94bp，A等位基因是134bp沒有酶切位點，出現(xiàn)的三種基因型是AG、AA、GG.cntf基因A/G凝膠電泳圖（見圖1）.

圖1　cntf基因A/G凝膠電泳圖

Marker電泳條帶：Lane 1為 100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp.

純合子AA電泳條帶：Lane 4.

純合子GG電泳條帶：Lane 13、10、9、8、7、6、5、3、2.

雜合子AG電泳條帶：Lane 12、11.

PCR產(chǎn)物電泳條帶：Lane 14.

（2）cntf基因A/G多態(tài)性基因頻率的平衡檢驗.由表1得出：經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律的檢驗，實驗組和對照組的HEW值為1.64和1.34.實驗組和對照組基因型頻率因（P＞0.05）符合Hardy-Weinberg平衡檢驗.結(jié)果顯示，對照組和實驗組cntf基因A/G多態(tài)性頻率分布符合遺傳定律.

表1　cntf基因A/G多態(tài)性頻率分布的Hardy-Weinberg平衡定律的檢驗

（3）實驗組和對照組cntf基因A/G多態(tài)性等位基因頻率的檢驗.表2表明：無論實驗組還是對照組的等位基因G頻率都高于A頻率，A等位基因?qū)嶒灲M和對照組分別為14.3%和18.7%，G等位基因為85.7%和81.3%.經(jīng)卡方檢驗實驗組等位基因頻率χ2=0.468，χ2（0.05）=5.99，χ2＜χ2（0.05）.結(jié)論P=0.494（P＞0.05），無統(tǒng)計學差異.

表2　實驗組和對照組cntf基因A/G多態(tài)性等位基因頻率分布

（4）實驗組和對照組cntf基因A/G多態(tài)性頻率的卡方檢驗.據(jù)表3表明：實驗組AA基因型頻率為19.0%，AG基因型頻率為4.8%，GG基因型頻率為76.2%；對照組AA基因型頻率為25.2%，AG基因型頻率為6.1%，GG基因型頻率為68.7%.經(jīng)卡方檢驗實驗組基因型頻率χ2=0.474，χ2（0.05）=5.99，χ2＜χ2（0.05）.結(jié)論P=0.789（P＞0.05），無統(tǒng)計學差異.cntf基因A/G多態(tài)性分布頻率的順序：①GG型，②AA型，③AG型.

表3　實驗組和對照組cntf基因A/G多態(tài)性頻率

3　分析與討論

cntf基因能增加體內(nèi)外大部分神經(jīng)元的存活、阻止損傷后神經(jīng)元的衰退、促進其恢復和影響神經(jīng)元分化，增進運動神經(jīng)元存活并具有保護作用［10］.這可能是cntf基因與力量素質(zhì)有關的原因之一.Roth Stephen M通過對cntf多態(tài)性實驗研究，結(jié)果表明，A/G型在進行快速運動時比G/G型產(chǎn)生的肌肉力量更大［11］.cntf基因能保持骨骼肌的形態(tài)和功能，增加肌纖維數(shù)目、減少由于缺少神經(jīng)支配、衰老等原因而造成的肌萎縮、肌肉力量下降.它有營養(yǎng)肌肉的作用，cntf的受體存在于骨骼肌纖維中，兩者的結(jié)合對骨骼肌纖維的生長有一定的促進作用，在促進長粗的同時通過對肌纖維的生長營養(yǎng)調(diào)控作用以提高肌肉的功能［12］.由于肌纖維營養(yǎng)充足，促進肌肉蛋白質(zhì)合成使得肌纖維生理橫斷面積粗大，由于生理橫斷面積變粗、突觸部位運動神經(jīng)元和所支配的肌纖維的數(shù)量增加，從而促進肌肉力量的增長.研究顯示：cntf對神經(jīng)肌肉的病癥可能有治療作用，如早期阿爾茨海默病、帕金森氏綜合癥和重癥肌無力［13］.實驗表明，24個月的老年鼠坐骨神經(jīng)cntf的表達量比6個月成年鼠低2～4倍，讓其進行游泳訓練，cntf的含量與游泳速度呈高度相關（P＜0.0003）.老年鼠比目魚肌肌肉力量經(jīng)過cntf處理14天后，肌力增加2.5倍（P＜0.001）.此研究證實：cntf基因與肌肉力量相關.

本實驗結(jié)果顯示：經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗，對照組基因型頻率P=1.34，實驗組基因型頻率P=1.64（P＞0.05）符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性.運動員組與對照組cntf基因的多態(tài)性中G等位基因分布頻率普遍偏高，實驗組基因型頻率經(jīng)卡方檢驗運動員基因型頻率與對照組相比（P＞0.05）無統(tǒng)計學差異，此結(jié)果表明cntf基因A/G多態(tài)性，不可成為早期選材的指標，但研究結(jié)果顯示運動員組G等位基因頻率高.

分析其可能原因：實驗組21個，全部為東北地區(qū)單板大跳臺和坡式障礙優(yōu)秀運動員，此兩類項目屬于技能主導類項群.雖為省級運動員，但全國此類項目優(yōu)秀運動員全部集中于東北三省，尤其黑龍江省是雪上項目的強省.可以說，此21名運動員代表國家的水平.人數(shù)少是影響實驗結(jié)果的主要因素.隨著國家對冰雪項目越來越重視，在國家和地方政府的大力扶持下，運動員的人數(shù)會逐漸增多，在今后的研究中增加實驗組的人數(shù)或通過增加同一項群實驗人員的數(shù)量，再進行進一步研究以期得到客觀的結(jié)論.

4　結(jié)論

經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律的檢驗，對照組和實驗組cntf基因A/G多態(tài)性頻率分布符合遺傳定律，具有群體代表性.

cntf基因A/G多態(tài)性，不可成為早期選材的指標，但研究結(jié)果顯示運動員組G等位基因頻率高.

通過研究了解我國技能主導類滑雪運動員運動相關基因多態(tài)性的分布，以單板大跳臺和坡式障礙項目運動員基因選材為突破點，逐步開展我國冰雪運動員的基因選材工作，并在后備運動員選材過程中提供數(shù)據(jù)上的支持和選材標準，對此項目的長期發(fā)展具有參考作用.

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