郭嘉露 ，李心樂(lè) ，2，李 新 ，呂子成 ，張 瑋 ，劉大全 ，2，張 平 ，2

（1.天津醫(yī)科大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)系，天津300070；2.泰達(dá)國(guó)際心血管病醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)中心，天津300457）

高血壓是常見(jiàn)的慢性疾病之一，2016年我國(guó)高血壓發(fā)病率為32.5%[1]，其引發(fā)的心、腦血管及腎臟損傷嚴(yán)重影響著高血壓患者的預(yù)后。目前高血壓的治療強(qiáng)調(diào)生活方式改變與藥物治療相結(jié)合，二者缺一不可。研究表明有氧運(yùn)動(dòng)不僅可以減少藥物所需劑量，而且有助于降低高血壓患者和大鼠的血壓水平[2-4]。我們自主研發(fā)的脈沖式機(jī)械加載是模擬主動(dòng)有氧運(yùn)動(dòng)的物理康復(fù)療法。前期工作報(bào)道，機(jī)械加載通過(guò)對(duì)滑膜關(guān)節(jié)和骨產(chǎn)生機(jī)械應(yīng)力作用達(dá)到機(jī)體主動(dòng)物理運(yùn)動(dòng)的效果，已經(jīng)證實(shí)其在一定程度上可以降低機(jī)體的炎癥反應(yīng)，并調(diào)節(jié)骨代謝、促進(jìn)骨折的愈合[5-6]。我們實(shí)驗(yàn)室的近期實(shí)驗(yàn)還表明，機(jī)械加載可以有效地改善高脂飲食導(dǎo)致的肥胖和脂肪肝（數(shù)據(jù)待發(fā)表）。但有關(guān)機(jī)械加載改善高鹽高脂導(dǎo)致的高血壓大鼠血壓以及臟器損傷的作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立高鹽高脂誘發(fā)的高血壓大鼠模型，比較分析治療前后大鼠體質(zhì)量、體脂含量、BMI、血壓變化及血管、心臟、腎臟損傷指標(biāo)，探索機(jī)械加載對(duì)高血壓及心臟、血管、腎臟損傷的影響。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雌性SD大鼠50只，6周齡，體質(zhì)量200 g左右，購(gòu)于中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，其飼養(yǎng)和管理遵守天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定，本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要儀器和試劑BP-100A全自動(dòng)無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x購(gòu)自四川成都泰盟有限公司。機(jī)械加載儀器采用我們自主研發(fā)并制作的產(chǎn)品（已經(jīng)獲得中國(guó)專利批準(zhǔn)）。其他設(shè)備和材料包括：高鹽高脂純化飼料（北京華阜康有限公司）、ImpediVET實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體組成測(cè)定分析儀采用我們自主研發(fā)并制作的產(chǎn)品（已經(jīng)獲得中國(guó)專利批準(zhǔn)）。其他設(shè)備和材料包括：高鹽高脂純化飼料（北京華阜康有限公司）、ImpediVET實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體組成測(cè)定分析儀（上海怡耀科學(xué)儀器有限公司）、全身骨密度測(cè)量?jī)xXR-600（美國(guó)NORLAND公司）、RM 2255輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）、光學(xué)顯微鏡BX53（日本OLYMPUS公司）、SF-400電子稱（永康市轉(zhuǎn)金工貿(mào)有限公司）、電子天平（美國(guó)Mrttler Toledo公司）。

1.3方法

1.3.1分組和處理普通飲食喂養(yǎng)1周后，50只SD雌性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組10只、研究組40只。研究組給與32%kcal fat、8%NaCl的高鹽高脂飲食（北京華阜康有限公司，配方參考Research diets D12266B），用大小鼠無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈測(cè)壓法監(jiān)測(cè)血壓（1次/周），收縮壓高于158 mmHg為高血壓造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[7]。6周后22只大鼠造模成功。隨機(jī)選出高血壓大鼠20只，采用隨機(jī)數(shù)表法分為高鹽高脂模型組和高鹽高脂的機(jī)械加載治療組（n=10）。

1.3.2機(jī)械加載治療使用2%異氟烷（1.0～1.5 L/min流量）對(duì)治療組大鼠進(jìn)行吸入麻醉后，機(jī)械加載作用于腰椎關(guān)節(jié)，設(shè)定加載頻率為5 Hz，力度為2 N，時(shí)間5 min/d，連續(xù)加載6周（圖1A）。對(duì)照組和模型組動(dòng)物放置在加載平臺(tái)，僅接受麻醉而不進(jìn)行機(jī)械加載治療[8-9]。

1.3.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體組成測(cè)定分析實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉后，采用ImpediVET實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體組成測(cè)定分析儀對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行體成分分析（圖1B）。

1.3.4無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量本實(shí)驗(yàn)采用BP-100A全自動(dòng)無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x測(cè)量大鼠安靜清醒狀態(tài)下尾動(dòng)脈血壓。測(cè)量前，大鼠0.5 h內(nèi)禁食、禁水，將大鼠置于大鼠固定器，尾部連接傳感器和阻斷器。將大鼠置于36～37℃恒溫環(huán)境中，連續(xù)測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈收縮壓、舒張壓、平均尾動(dòng)脈壓3次，間隔60 s，取其平均值（圖1C）。

圖1　實(shí)驗(yàn)器材Fig 1 Experimental equipments

1.3.5取材、組織學(xué)觀察和分析大鼠麻醉后，打開(kāi)胸腔，在心尖處插入灌注針頭，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，快速均勻的推入肝素生理鹽水，待右心耳流出的液體明顯變淺，換成4%多聚甲醛灌注，大約需要400～500 mL。灌注固定后迅速獲取心臟，去除周圍大血管，濾紙吸干心臟血液，稱取全心濕重。分離胸主動(dòng)脈段，去除多余組織，用生理鹽水沖洗主動(dòng)脈管腔的殘血。分離雙側(cè)腎。然后將心臟、胸主動(dòng)脈段、雙側(cè)腎放置4%甲醛溶液中固定，48 h后對(duì)心臟、胸主動(dòng)脈段及雙腎進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋處理，心臟及胸主動(dòng)脈經(jīng)橫斷面制成3 μm連續(xù)切片，腎臟經(jīng)腎門經(jīng)冠狀面制成3 μm連續(xù)切片[10-11],常規(guī)HE染色。顯微鏡下觀察心臟HE染色切片，使用OLYMPUS cell Sens Standard軟件測(cè)量心室壁厚度和心肌細(xì)胞的橫截面積[12]，以此反映心室重構(gòu)程度。測(cè)定胸主動(dòng)脈中膜厚度和管腔面積的比值以及血管壁面積，以此反映血管重構(gòu)程度。此外，在×200倍鏡下計(jì)數(shù)腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞數(shù)，反映炎癥水平及腎臟損傷程度。

2　結(jié)果

2.1機(jī)械加載降低高鹽高脂高血壓大鼠的血壓各實(shí)驗(yàn)組大鼠收縮壓基線水平基本一致，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)高鹽高脂喂養(yǎng)6周后，大鼠血壓達(dá)到高血壓標(biāo)準(zhǔn)（收縮壓持續(xù)穩(wěn)定在158 mmHg以上），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表 1）。

表1　各實(shí)驗(yàn)組大鼠收縮壓造模后的比較(mmHg)Tab 1　Comparison of the systolic blood pressure after modeling(mmHg)

與對(duì)照組相比，模型組大鼠經(jīng)過(guò)12周高鹽高脂飲食后血壓值明顯升高。治療組大鼠經(jīng)過(guò)6周的機(jī)械加載治療后，血壓值與模型組相比有顯著的降低，其中收縮壓（P<0.05）、舒張壓（P<0.001）和平均尾動(dòng)脈壓（P<0.001）的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 2）。

圖2　各組大鼠機(jī)械加載治療后血壓的變化Fig 2　Changes of blood pressure after mechanical loading

2.2機(jī)械加載降低高鹽高脂高血壓大鼠的體質(zhì)量、BMI值、體脂含量高鹽高脂模型組大鼠飼養(yǎng)12周后表現(xiàn)為體態(tài)肥胖，機(jī)械加載治療組大鼠體型基本恢復(fù)正常（圖3A）。全身骨密度儀掃描的體脂含量圖（黃色、橙色、藍(lán)色、紫色、黑色等顏色越淺，表明脂肪含量越高，圖3B）表明，模型組的脂肪含量明顯增加，機(jī)械加載治療后大鼠脂肪含量降低。大鼠體質(zhì)量和體成分分析證實(shí)，經(jīng)高鹽高脂喂養(yǎng)12周后，大鼠體質(zhì)量、BMI、體脂含量均顯著增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.001）；經(jīng)機(jī)械加載治療后大鼠體質(zhì)量（P<0.01，圖 3C）、BMI（P<0.05，圖 3D）、體脂含量（P<0.01，圖3E）均顯著降低。

2.3機(jī)械加載改善高血壓導(dǎo)致的胸主動(dòng)脈病理進(jìn)程高鹽高脂飼養(yǎng)12周后，模型組大鼠胸主動(dòng)脈血管壁明顯增厚，血管壁面積增加，管腔狹窄，動(dòng)脈壁中層平滑肌細(xì)胞肥大，排列紊亂，血管壁與血管管腔的比值增大。機(jī)械加載治療后，上述血管指標(biāo)顯著改善（圖4）。

圖3　大鼠體質(zhì)量、體脂含量、BMI的改變Fig 3　Changes of body weight,body fat content,and BMI

圖4　各組大鼠血管組織學(xué)變化Fig 4 Histological changes in blood vessels

2.4機(jī)械加載改善高血壓導(dǎo)致的心室重構(gòu)高鹽高脂飼養(yǎng)12周后，與對(duì)照組相比，模型組心室指數(shù)顯著增加（P<0.001）。機(jī)械加載治療6周后，心室指數(shù)明顯降低（P<0.001）。與對(duì)照組相比，高鹽高脂模型組心肌細(xì)胞增殖、肥大、心室壁增厚，發(fā)生了心室重構(gòu)。機(jī)械加載治療后，上述心室重構(gòu)的病理變化指標(biāo)減輕，且均有顯著性差異（P<0.05）（圖5）。

圖5　各組大鼠心臟組織學(xué)變化Fig 5　Histological changes of hearts

2.5機(jī)械加載改善腎臟的炎性反應(yīng)高鹽高脂飼養(yǎng)12周后，模型組與對(duì)照組相比腎間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)6周機(jī)械加載后，治療組腎炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度較造模組減輕，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.001）（圖 6）。

2.6相關(guān)性分析通過(guò)對(duì)平均尾動(dòng)脈壓與體質(zhì)量、BMI、體脂含量進(jìn)行的相關(guān)性分析表明，平均尾動(dòng)脈壓與體質(zhì)量（r=0.74，P<0.001）、BMI（r=0.70，P<0.001）、體脂含量（r=0.72，P<0.001）成正相關(guān)（圖 7）。

圖6　各組大鼠腎臟組織學(xué)改變Fig 6　Renal histological changes

圖7　大鼠平均尾動(dòng)脈壓與體質(zhì)量、BMI、體脂含量的相關(guān)性分析Fig 7　Analysis of correlations between mean tail artery pressure and body weight,BMI and body fat content

3　討論

本研究中實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)過(guò)6周高鹽高脂飲食，收縮壓在158 mmHg以上，作為高血壓造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[7]。隨后，對(duì)高血壓大鼠進(jìn)行了機(jī)械加載治療。本研究結(jié)果顯示，機(jī)械加載有效降低了高鹽高脂高血壓大鼠的血壓水平，并且減緩了高血壓大鼠的體質(zhì)量、BMI和體脂的增長(zhǎng)。機(jī)械加載治療后高血壓大鼠血管壁增厚、管腔直徑和面積縮小、管壁厚度與管徑之比增加等血管重構(gòu)指標(biāo)較模型組都有顯著效果。心室指數(shù)HW(mg)/tibia length(mm)（心臟濕重/脛骨長(zhǎng)度）可用來(lái)反映心臟肥大的程度，心室重構(gòu)是高血壓的重要病理變化。機(jī)械加載治療后心室壁肥厚和心肌細(xì)胞肥大等心室重構(gòu)指標(biāo)較模型組也有顯著療效。此外，機(jī)械加載不但改善高血壓大鼠心血管的重構(gòu)，而且對(duì)腎臟損傷有一定的修復(fù)作用，治療組大鼠腎臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)水平較模型組降低。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，機(jī)械加載對(duì)高鹽高脂高血壓大鼠有明顯的降壓療效，并且在一定程度上延緩了高血壓導(dǎo)致的重要靶器官的損傷。

隨著生活水平的提高，人們的飲食習(xí)慣也發(fā)生了改變，高血壓已成為我國(guó)常見(jiàn)的慢性疾病之一，其造成的并發(fā)癥嚴(yán)重影響到人們的身體健康。心臟、血管以及腎臟是高血壓損傷常見(jiàn)的組織和靶器官。長(zhǎng)期的高鹽高脂飲食引起的血脂、血糖及血壓的升高，造成心肌負(fù)荷增加和心肌損傷[13]。同時(shí)，高鹽飲食會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)高脂所致的動(dòng)脈粥樣硬化作用，血管內(nèi)皮損傷程度加重，表現(xiàn)為血管壁增厚和管腔的狹窄。腎臟則是高血壓損傷的主要靶器官，同時(shí)也是調(diào)節(jié)血壓變化的重要組織器官，腎臟損傷會(huì)進(jìn)一步加劇血壓升高，導(dǎo)致惡性循環(huán)。本課題的高鹽高脂飼養(yǎng)，成功地誘導(dǎo)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的高血壓和心臟、血管、腎臟的損傷。

參考文獻(xiàn)：

[1]Lewington S,Lacey B,Clarke R,et al.The burden of hypertension and associated risk for cardiovascular mortality in China[J].JAMA Intern Med,2016,176(4):524

[2]Zhang Y,Yu X J,Chen W S,et al.Exercise training attenuates renovascular hypertension partly via RAS-ROS-glutamate pathway in thehypothalamicparaventricularnucleus[J].SciRep,2016,6:37467

[3]Kumral Z N,Sener G,Ozgur S,et al.Regular exercise alleviates renovascular hypertension-induced cardiac/endothelial dysfunction and oxidative injury in rats[J].J Physiol Pharmacol,2016,67(1):45

[4]Pellegrin M,Aubert J F,Bouzourène K,et al.Voluntary exercise stabilizes established angiotensin II-dependent atherosclerosis in mice through systemic anti-inflammatory effects[J].PLoS One,2015,10(11):e0143536

[5]Zhang P,Sun Q,Turner C H,et al.Knee loading accelerates bone healing in mice[J].J Bone Miner Res,2007,22(12):1979

[6]Zhang P,Malacinski G M,Yokota H.Joint loading modality:its application to bone formation and fracture healing[J].Br J Sports Med,2008,42(7):556

[7]Dobrian A D,Schriver S D,Lynch T,et al.Effect of salt on hypertension and oxidative stress in a rat model of diet-induced obesity[J].Am J Physiol Renal Physiol,2003,285(4):F619

I will never forget the day.We first met each other on the day.

[8]Zhang P,Yokota H.Knee loading stimulates healing of mouse bone wounds in a femur neck[J].Bone,2011,49(4):867

[9]Li X,Yang J,Liu D,et al.Knee loading inhibits osteoclast lineage in a mouse model of osteoarthritis[J].Sci Rep,2016,6:24668

[10]Boffa J J,Lu Y,Placier S,et al.Regression of renal vascular and glomerular fibrosis:role of angiotensin II receptor antagonism and matrix metalloproteinases[J].J Am Soc Nephrol,2003,14(5):1132

[11]于海利,劉長(zhǎng)江,王一帆,等.決明子蒽醌苷對(duì)兩腎一夾高血壓大鼠降壓及腎損傷保護(hù)作用研究[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2014,13(09):692

[12]Kadowaki S,Shishido T,Sasaki T,et al.Deficiency of senescence marker protein 30 exacerbates cardiac injury after ischemia/reperfusion[J].Int J Mol Sci,2016,17(4):542

[13]Rabkin S W.Considerations in understanding the coronary blood flow-leftventricular mass relationship in patients with hypertension[J].CurrCardiol Rev,2017,13(1):75

[14]Tfd S,Souza A A,Lima F F,et al.Effect of the exercise of walkers performed in public squares with spontaneous or prescribed intensity on post-exercise hypotension[J].Rev Saude Publica,2017,51:71

[15]Wong A,Alvarez-Alvarado S,Jaime S J,et al.Combined wholebody vibration training and l-citrulline supplementation improves pressure wave reflection in obese postmenopausal women[J].Appl Physiol Nutr Metab,2016,41(3):292

[16]Wong A,Alvarez-Alvarado S,Kinsey A W,et al.Whole-body vibration exercise therapy improves cardiac autonomic function and blood pressure in obese pre-and stage 1 hypertensive postmenopausal women[J].J Altern Complement Med,2016,22(12):970

[17]Zhang P,Turner C H,Yokota H.Joint loading-driven bone formation and signaling pathways predicted from genome-wide expression profiles[J].Bone,2009,44(5):989

[18]Zhang P,Yokota H.Elbow loading promotes longitudinal bone growth of the ulna and the humerus[J].J Bone Miner Metab,2012,30(1):31

[19]Liu D,Li X,Li J,et al.Knee loading protects against osteonecrosis of the femoral head by enhancing vessel remodeling and bone healing[J].Bone,2015,81:620

[20]巫洪坤,梁貴友.間充質(zhì)干細(xì)胞治療心血管疾病的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2015,21(14):2538

[21]Wang S,Li Y,Zhao J,et al.Mesenchymal stem cells ameliorate podocyte injury and proteinuria in a type 1 diabetic nephropathy rat model[J].Biol Blood Marrow Transplant,2013,19(4):538