李淑芳 唐 磊 李 杰 李貴陽 王曉冉 王小鹿 丁 山 莫照蘭

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3株O3血清型鰻弧菌滅活疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)效果*

李淑芳1,2唐 磊1,3李 杰1李貴陽1王曉冉1,3王小鹿1,3丁 山1,2莫照蘭1,2①

(1. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；3. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院 青島 266003)

鰻弧菌() O3血清型菌株是感染魚類的重要病原菌，本文研究了3株O3血清型鰻弧菌(SMP1、SMP3和SMP4)滅活疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)。首先在牙鲆()體內(nèi)對(duì)3株鰻弧菌進(jìn)行復(fù)壯；檢測(cè)復(fù)壯后的菌株毒力，檢測(cè)的3株鰻弧菌對(duì)藍(lán)蔓龍()的半數(shù)致死量(LD50)分別為105.1CFU/ml (SMP1)、104.7CFU/ml (SMP3)和105.4CFU/ml (SMP4)；制備了3株菌的甲醛滅活疫苗，注射免疫牙鲆，免疫后第7天可檢測(cè)到牙鲆的血清特異性抗體產(chǎn)生，免疫后第28天的血清特異性抗體效價(jià)為1︰1280(SMP1)、1︰640 (SMP3)和1︰905 (SMP4)，提供的免疫保護(hù)率(Relative percent survival rate，RPS)為94.4% (SMP1)、100% (SMP3)和73.7% (SMP4)。研究表明，3株致病性O(shè)3血清型鰻弧菌菌株具有良好的免疫原性，其中SMP3為最適疫苗候選株。本研究為鰻弧菌O3血清型疫苗的開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

鰻弧菌O3血清型；LD50；滅活疫苗；血清抗體效價(jià)；免疫保護(hù)率

鰻弧菌()是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的一種主要致病菌，可引起多種養(yǎng)殖魚類發(fā)生弧菌病，嚴(yán)重危害牙鲆()、大菱鲆()、大西洋鮭()、鱸魚、日本鰻鱺()等我國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)魚類。該病原可引起魚類出血性敗血癥，導(dǎo)致鰭部嚴(yán)重出血、眼球突出、體表潰爛直至死亡(邊慧慧, 2009; 陳吉祥等, 2005)。鰻弧菌至少有23種血清型，其中O1、O2和部分O3血清型是主要的致病菌(Wang, 2009; Colwell, 1984)，而O2血清型又有O2a、O2b和O2c三種血清亞型，O3血清型有O3a和O3b兩種血清亞型(Buch, 2003; Mikkelsen, 2011)，不同血清亞型的菌株在生理生化特征、血清學(xué)反應(yīng)、遺傳特征等方面有所差別(Mikkelsen, 2007)。O1和O2血清型分布在世界各地，是感染鮭魚、鱈魚和大菱鲆等海水養(yǎng)殖魚類最主要的病原菌，O3血清型在丹麥、意大利和日本等國(guó)家偶有發(fā)現(xiàn)，曾在患病的歐洲鰻鱺()中分離得到(Pedersen, 1999)。國(guó)際上已經(jīng)商品化的鰻弧菌疫苗有滅活三價(jià)疫苗(含O1、O2a、O2b血清型)(Mikkelsen, 2011; Schr?der, 2006)，主要用于挪威的養(yǎng)殖鱈魚；其他為多聯(lián)疫苗，如殺鮭氣單胞菌()-鰻弧菌二聯(lián)滅活疫苗、殺鮭氣單胞菌-鰻弧菌-耶爾森氏菌()三聯(lián)滅活疫苗、殺鮭氣單胞菌-鰻弧菌-海水病弧菌-冷水病弧菌()四聯(lián)滅活疫苗等，主要用于歐洲、美洲的鮭魚、鰻魚養(yǎng)殖。我國(guó)學(xué)者研發(fā)了多種鰻弧菌疫苗，如用于鱸魚的滅活疫苗(肖慧等, 2003)，用于鲆鰈類的滅活疫苗(莫照蘭等, 2002; 朱開玲等, 2004)、口服疫苗(肖鵬等, 2007)和減毒疫苗(潘燕華等, 2009)，但上述疫苗制劑的免疫效果評(píng)價(jià)均停留在實(shí)驗(yàn)室條件階段，很少進(jìn)入中試階段，更沒有獲得生產(chǎn)批文且正式用于生產(chǎn)的鰻弧菌疫苗。造成我國(guó)魚用疫苗產(chǎn)業(yè)化緩慢的一個(gè)重要原因是缺乏系統(tǒng)深入的流行病學(xué)調(diào)查工作，對(duì)流行于疫區(qū)的病原種類和抗原的變化缺乏明確的了解，對(duì)現(xiàn)有疫苗株的血清型或基因型的背景不清晰，因而不能預(yù)估疫苗對(duì)流行疾病提供的免疫保護(hù)，影響了疫苗中試階段的進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)危害我國(guó)海水魚類養(yǎng)殖的鰻弧菌開展了血清學(xué)分型研究，發(fā)現(xiàn)流行于我國(guó)鲆鰈類養(yǎng)殖的鰻弧菌主要有O1、O2、O3血清型，以O(shè)1血清型為主，其次為O2和O3血清型，其中O3血清型來源于發(fā)病大菱鲆(趙魯寧, 2014)。本研究在確定鰻弧菌O3血清型菌株致病性的基礎(chǔ)上，制備了滅活疫苗，進(jìn)一步研究了滅活疫苗對(duì)牙鲆的免疫保護(hù)效果，為鰻弧菌O3血清型及多價(jià)疫苗的研發(fā)提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基

鰻弧菌O3血清型菌株SMP1、SMP3和SMP4由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所養(yǎng)殖生物疾病控制與分子病理學(xué)研究室提供(趙魯寧, 2014)，保存于–80℃冰箱。用胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)液體或胰蛋白胨大豆瓊脂平板(TSA)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)用魚

藍(lán)蔓龍(Pallas)(Hao, 2013)購(gòu)自山東青島南山花鳥蟲魚市場(chǎng)，用于鰻弧菌菌株的毒力分析。其平均體長(zhǎng)為7 cm，暫養(yǎng)于60 L水箱進(jìn)行海水養(yǎng)殖馴化，養(yǎng)殖水溫為25~28℃，連續(xù)充氣，每天在養(yǎng)殖淡水中加適量海水直至鹽度為10 (竇海鴿等, 2006)。牙鲆購(gòu)自山東日照某養(yǎng)殖場(chǎng)，用于疫苗免疫實(shí)驗(yàn)。其平均體重為4.8 g，平均體長(zhǎng)為 8.5 cm，于500 L水箱暫養(yǎng)，水溫為13~16℃，連續(xù)通氣。實(shí)驗(yàn)前，暫養(yǎng)魚隨機(jī)取3~5尾進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分析，取魚的肝、脾、腎組織，于TSA平板劃線，在28℃培養(yǎng)24~48 h，確定未有細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，暫養(yǎng)魚方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 菌株復(fù)壯

取保存于–80℃冰箱的鰻弧菌菌種，于TSA平板劃線，挑取單菌落，接種于TSB液體培養(yǎng)基中，28℃、140 r/min培養(yǎng)過夜，得到濃度為108CFU/ml的菌液。取2尾健康牙鲆，以0.1 ml/尾的劑量進(jìn)行背部肌肉注射。取瀕死牙鲆的肝、脾、腎組織于TSA平板劃線分菌，挑取形態(tài)特征一致的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行分離純化，經(jīng)血清學(xué)反應(yīng)鑒定后，同上方法進(jìn)行第2次復(fù)壯，菌液濃度為107CFU/ml，注射劑量為0.1 ml/尾。復(fù)壯 2次的菌株保種進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 鰻弧菌菌株毒力檢測(cè)

取上述復(fù)壯菌株于TSA平板劃線，挑取單菌落，接種于TSB過夜培養(yǎng)，取培養(yǎng)液按1%接種量轉(zhuǎn)接新鮮TSB，繼續(xù)搖床培養(yǎng)3 h，菌液于4℃、6000 r/min離心10 min，用無菌PBS重懸，調(diào)節(jié)OD540 nm=0.5，進(jìn)行10倍梯度稀釋，制備稀釋度為103~106CFU/ml的菌液。取健康藍(lán)蔓龍分組，采用背部肌肉注射方式，每組注射一個(gè)稀釋度的菌液0.1 ml，對(duì)照組注射同等體積的PBS。定時(shí)觀察藍(lán)蔓龍的發(fā)病癥狀和死亡情況，對(duì)死亡魚進(jìn)行細(xì)菌分離，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)和血清學(xué)鑒定。統(tǒng)計(jì)14 d的累計(jì)死亡率，采用改良寇氏法 (楊茂成, 1990)計(jì)算LD50。

1.5 鰻弧菌滅活疫苗制備和安全性檢驗(yàn)

取上述復(fù)壯菌株于TSA平板劃線，挑取單菌落接種于TSB過夜培養(yǎng)，取培養(yǎng)液按1%接種量轉(zhuǎn)接新鮮TSB培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD540 nm后，加入終濃度為0.2%的甲醛，在28℃、140 r/min搖床條件下進(jìn)行滅活。進(jìn)行滅活檢驗(yàn)時(shí)，取滅活12 h和24 h的菌液各0.1 ml涂布TSA平板，同時(shí)取滅活菌液按1%比例接種TSB培養(yǎng)基，培養(yǎng)后觀察是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。滅活后的菌液以6000 r/min離心10 min，沉淀菌體用滅菌PBS離心洗滌2次，重懸菌體至OD540 nm=0.5，制成疫苗，置于4℃保存。進(jìn)行安全性檢驗(yàn)時(shí)，將滅活疫苗以0.1 ml/尾的劑量腹腔注射牙鲆，每種疫苗注射 5尾，對(duì)照組注射同等體積的PBS，實(shí)驗(yàn)魚觀察2周，記錄魚的癥狀及存活情況。

1.6 疫苗免疫與攻毒實(shí)驗(yàn)

健康牙鲆隨機(jī)分組，每組50尾，取濃度為 108CFU/ml的疫苗，以0.1 ml/尾的接種量從腹腔注射牙鲆，則每尾魚的接種劑量為107CFU；對(duì)照組注射等量的無菌PBS。在免疫后的7、14、21、28 d，從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取3尾魚，從尾柄靜脈采血制備血清，采用微量凝集法(沈萍, 1999)檢測(cè)血清特異性抗體效價(jià)。

在免疫后第28天進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，取濃度為 107CFU/ml的活菌從背部肌肉注射免疫組魚和對(duì)照組魚，每組魚20尾，每尾0.1 ml。攻毒后，觀察魚臨床癥狀，統(tǒng)計(jì)14 d內(nèi)的死亡數(shù)，按照如下公式計(jì)算：

疫苗免疫保護(hù)率(Relative percent survival rate, RPS)=(1–免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)×100%

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

血清抗體水平測(cè)定數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鰻弧菌菌株復(fù)壯

在進(jìn)行菌株復(fù)壯時(shí)，將–80℃保存的鰻弧菌菌種SMP1、SMP3和SMP4在TSA平板上活化，用TSB培養(yǎng)得到菌懸液，以108CFU/ml的劑量分別注射感染牙鲆，感染的牙鲆在注射后24~48 h內(nèi)全部死亡，注射部位紅腫、內(nèi)臟充血、全身性肌肉出血等典型癥狀，從瀕死魚的肝、脾、腎組織分離得到形態(tài)一致的菌落。得到的菌落經(jīng)血清學(xué)鑒定為原發(fā)菌株后，以此菌落為菌種，以107CFU/ml的劑量再次注射感染牙鲆，感染的牙鲆在注射后24~48 h內(nèi)全部死亡，從瀕死魚的內(nèi)臟分離得到的菌落經(jīng)過血清學(xué)鑒定后，用于毒力實(shí)驗(yàn)和疫苗制備。

2.2 鰻弧菌菌株毒力分析

以103~106CFU/ml系列濃度的鰻弧菌SMP1、SMP3和SMP4感染藍(lán)蔓龍，在感染后的第1天，SMP3組開始出現(xiàn)死亡，在感染后的第2天SMP1和SMP4開始出現(xiàn)死亡，死亡高峰出現(xiàn)在第2~3天，第7天后不再出現(xiàn)死亡情況。瀕死魚的癥狀為全身性肌肉出血，肝充血，脾臟腫大。計(jì)算得到SMP1、SMP3和SMP4的LD50依次為105.1、104.7和105.4CFU/ml (表1)。

表1 O3血清型鰻弧菌的毒力檢測(cè)

Tab.1 Virulence of V. anguillarum serotype O3 strains

2.3 鰻弧菌疫苗滅活及安全性檢驗(yàn)

在擴(kuò)大培養(yǎng)24 h的3株鰻弧菌(SMP1、SMP3和SMP4)的菌懸液中加入終濃度為0.2%的甲醛進(jìn)行細(xì)菌滅活，定時(shí)取菌液在TSA和TSB培養(yǎng)，檢測(cè)滅活情況。結(jié)果顯示，加入甲醛后12 h，在3種菌懸液中未檢測(cè)到細(xì)菌的生長(zhǎng)。滅活后的菌液注射牙鲆，在14 d觀察期間，牙鲆生長(zhǎng)、進(jìn)食正常，未有死亡，說明滅活的疫苗對(duì)動(dòng)物安全。

2.4 免疫魚的血清抗體效價(jià)

3種鰻弧菌滅活疫苗以107CFU/尾的劑量注射免疫牙鲆，在免疫后的第7、14、21、28天取血，測(cè)定抗體效價(jià)。結(jié)果如圖1所示，在免疫后第7天，各免疫組牙鲆的血清均可檢測(cè)到明顯的抗體效價(jià)，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，其中，SMP1組和SMP3組在第1~3周呈顯著性上升(<0.05)；在第28天時(shí)，SMP1、SMP3和SMP4組的血清抗體效價(jià)分別為 1∶1280、1∶640和1∶905(圖1)。在相同采樣時(shí)間點(diǎn)，各免疫組之間的血清效價(jià)沒有顯著性差異(>0.05)。未免疫的對(duì)照組魚血清未檢測(cè)到抗體效價(jià)。

圖1 免疫血清效價(jià)測(cè)定

不同字母表示顯著差異(<0.05)

Different letters denoted significant differences (<0.05)

2.5 疫苗免疫保護(hù)效果

在免疫后的第28天，用濃度為107CFU/ml的SMP1、SMP3和SMP4活菌分別攻毒對(duì)應(yīng)的免疫組和對(duì)照組，檢測(cè)疫苗的免疫保護(hù)力。結(jié)果顯示，攻毒后，未免疫組出現(xiàn)大量死亡，死亡高峰出現(xiàn)在攻毒后第2~ 5天；而免疫組中，僅SMP1和SMP4組出現(xiàn)少量死亡。根據(jù)累積死亡率計(jì)算SMP1、SMP3、SMP4組的相對(duì)免疫保護(hù)率分別為94.4%、100%和73.7% (表2)。

3 討論

我國(guó)學(xué)者研制了針對(duì)不同養(yǎng)殖品種的鰻弧菌滅活疫苗，但未明確疫苗株的血清型或基因型，在一定程度上限制了疫苗的田間應(yīng)用示范。本研究開展了 3株鰻弧菌O3血清型菌株(SMP1、SMP3和SMP4)的免疫原性和免疫保護(hù)效果的初步研究，在確定3株鰻弧菌菌株致病力的基礎(chǔ)上，用福爾馬林作為滅活劑制備了3種安全的滅活菌劑，比較了3種滅活菌劑免疫牙鲆后的血清抗體效價(jià)和免疫保護(hù)，結(jié)果證明， 3種疫苗制劑具有較強(qiáng)的免疫原性，對(duì)牙鲆起到了有效的免疫保護(hù)。

用于制備疫苗的菌種由于傳代次數(shù)多、保存時(shí)間長(zhǎng)，其生長(zhǎng)、繁殖以及毒力等會(huì)減弱，為了恢復(fù)疫苗株的原始毒力和免疫原性，本研究將冷凍保存的鰻弧菌菌株注射感染牙鲆進(jìn)行2次復(fù)壯，從病魚的內(nèi)臟組織均分離到與原始菌株表型特征一致的細(xì)菌，感染病菌的牙鲆出現(xiàn)典型的出血性敗血病癥狀，結(jié)果顯示，鰻弧菌菌株的毒力得到了恢復(fù)。本研究在致病性實(shí)驗(yàn)中選取了藍(lán)蔓龍作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，藍(lán)蔓龍也稱絲足魚，是一種繁殖快、飼養(yǎng)簡(jiǎn)單、便宜的淡水觀賞魚，作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用于多種水產(chǎn)致病菌的免疫和致病性研究(Ling, 2001; Fang, 2000; Srinivasa, 2003)。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)藍(lán)蔓龍的耐鹽性和鹽度馴化進(jìn)行了研究(竇海鴿等, 2006)，并將鹽度馴化的魚應(yīng)用于海水病原菌的致病性研究和海水疫苗評(píng)價(jià)(竇海鴿, 2006; 李杰等, 2010; 潘海建等, 2013; Hao, 2013)，證明了藍(lán)蔓龍作為海水魚實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用于病原毒力分析和疫苗評(píng)價(jià)的可行性。本研究將海水馴化的藍(lán)蔓龍用于檢測(cè)復(fù)壯的鰻弧菌的毒力，結(jié)果顯示， 3株菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病力，LD50在104.7~105.4CFU/ml，其中，SMP4最低劑量組(103CFU/ml)出現(xiàn)12.5%的死亡率，而104CFU/ml組沒有死亡，可能由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異所導(dǎo)致。鰻弧菌的致病性與外膜蛋白、脂多糖、胞外產(chǎn)物等多種因子有關(guān)(Frans, 2011)，這些致病因子是宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的抗原分子，毒力越強(qiáng)的鰻弧菌被認(rèn)為具有越強(qiáng)的免疫原性。根據(jù)上述結(jié)果，3株菌株可作為候選疫苗株進(jìn)行免疫原性和免疫保護(hù)效果的評(píng)價(jià)。

表2 鰻弧菌滅活疫苗的免疫保護(hù)力

Tab.2 Relative percent survival rate (RPS) of immunized P. olivaceuschallenged by 107 CFU/ml V. anguillarum bacteria

采用甲醛滅活的方法可以得到安全和有效的鰻弧菌疫苗(肖慧等, 2003; 莫照蘭等, 2002)。本研究采用終濃度為0.2%(/)的甲醛作為滅活劑，在28℃、140 r/min的條件下處理12 h，可以完全滅活細(xì)菌，用此方法滅活的3種菌劑對(duì)牙鲆沒有致病性。制備的3種疫苗免疫牙鲆，免疫后第7天便可檢測(cè)到明顯的血清抗體產(chǎn)生，且在一個(gè)月內(nèi)抗體效價(jià)呈上升趨勢(shì)，到第28天時(shí)，各免疫組血清效價(jià)高于1∶640。一般認(rèn)為較低的溫度不適合刺激魚體的免疫反應(yīng)，牙鲆的適合生長(zhǎng)溫度為12~23℃，本研究期間，養(yǎng)殖牙鲆的水溫為13~16℃，表明在較低的養(yǎng)殖溫度鰻弧菌疫苗可以刺激牙鲆產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)。攻毒實(shí)驗(yàn)顯示，各免疫組牙鲆均能夠抵抗劑量為107CFU/ml的鰻弧菌感染，RPS在73.7%~100%范圍內(nèi)，因此，可以認(rèn)為牙鲆血清中針對(duì)鰻弧菌疫苗的特異抗體水平與該疫苗提供的免疫保護(hù)力相關(guān)。從數(shù)據(jù)來看，免疫牙鲆后，每種疫苗在各個(gè)檢測(cè)點(diǎn)的血清抗體效價(jià)沒有明顯區(qū)別，但RPS有所不同，即毒力強(qiáng)的菌株提供的RPS更高。因此，可以選擇毒力強(qiáng)的鰻弧菌菌株作為疫苗候選株。其中，SMP3菌株毒力最強(qiáng)，免疫牙鲆后產(chǎn)生的血清效價(jià)相對(duì)較低，但保護(hù)率最高。推測(cè)可能由于SMP3存在不同于其他菌株的某些毒力因子，這些毒力因子在體外表達(dá)水平不高(但可能在宿主內(nèi)有較高水平表達(dá))，因而不能誘導(dǎo)高水平的體液免疫應(yīng)答；另外，某些毒力因子可能參與細(xì)胞免疫應(yīng)答而檢測(cè)不到抗體水平。上述機(jī)制需要進(jìn)一步的研究進(jìn)行確證。

本研究利用3株O3血清型鰻弧菌菌株制備滅活疫苗，對(duì)牙鲆均起到了良好的免疫保護(hù)效果，具有作為疫苗株的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。我們將進(jìn)一步比較不同血清型鰻弧菌菌株的毒力強(qiáng)弱、分布特征等數(shù)據(jù)，為鰻弧菌疫苗的開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

Bian HH. Primary study on a new method of oralvaccine for flounder. Master′s Thesis of Hebei University , 2009, 3[邊慧慧. 牙鲆鰻弧菌口服疫苗免疫新途徑的初步研究.河北大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2009, 3]

Buch C, Sigh J, Nielsen J,. Production of acylated homoserine lactones by different serotypes ofboth in culture and during infection of rainbow trout. Systematic and Applied Microbiology, 2003, 26(3): 338–349

Chen JX, Li CF, Yan XH,.Studies on biological characteristics of five pathogenicstrains isolated from diseased turbot () in Shandong Province of China. High Technology Letters, 2005, 15(6): 92–96 [陳吉祥, 李彩風(fēng), 顏顯輝, 等. 大菱鲆病原鰻弧菌生物學(xué)及分子特征研究. 高技術(shù)通訊, 2005, 15(6): 92–96]

Colwell RR, Grimes DJ.diseases of marine fish populations. Helgol?nder Meeresuntersuchungen, 1984, 37(1–4): 265–287

Dou HG, Huang J, Wang XH,. Salinity tolerance and salt water acclimation of gourami. Journal of Fishery Sciences of China, 2006, 13(5): 775–780 [竇海鴿, 黃倢, 王秀華, 等. 絲足魚()耐鹽性及鹽度馴化. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2006, 13(5): 775–780]

Dou HG. Tentative application of freshwater gouramion virulence analysis and vaccine evaluation for bacteria isolates from seawater fish. Master′s Thesis of Shanghai Fisheries University, 2006, 31–37 [竇海鴿.淡水絲足魚用于海水魚細(xì)菌分離物毒力分析和疫苗評(píng)價(jià)的初步研究.上海水產(chǎn)大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2006, 31–37]

Fang HM, Ling KC, Ge R,. Enhancement of protective immunity in blue gourami,(Pallas) againstandbymajor adhesion. Journal of Fish Diseases, 2000, 23: 137–145

Frans I, Michiels CW, Bossier P,.as a fish pathogen: Virulence factors, diagnosis and prevention. Journal of Fish Diseases, 2011, 34(9): 643–661

Hao B, Mo ZL, Xiao P,. Role of alternative sigma factor 54 (RpoN) fromM3 in protease secretion, exopolysaccharide production, biofilm formation and virulence. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(6): 2575–2585

Li J, Mo ZL, Mao YX,. Effect ofgene on's virulence and secretion of T3SS proteins. High Technology Letters, 2010, 20(2): 199–203 [李杰, 莫照蘭, 茅云翔, 等.基因?qū)t緩愛德華氏菌的毒力和T3SS蛋白分泌的影響. 高技術(shù)通訊, 2010, 20(2): 199–203]

Ling SHM, Wang XH, Lim TM,. Green fluorescent protein-taggedreveals portal of entry in fish. FEMS Microbiology Letters, 2001, 194(2): 239–243

Mikkelsen H, Lund V, Larsen R,. Vibriosis vaccines based on various sero-subgroups ofO2 induce specific protection in Atlantic cod (L.) juveniles. Fish and Shellfish Immunology, 2011, 30(1): 330–339

Mikkelsen H, Lund V, Martinsen LC,. Variability amongO2 isolates from Atlantic cod (L.): Characterisation and vaccination studies. Aquaculture, 2007, 266(1–4): 16–25

Mo ZL, Xu YL, Zhang PJ. Vaccination againston cultured flounder,. Marine Sciences, 2002, 26(4): 63–66[莫照蘭, 徐永立, 張培軍. 養(yǎng)殖牙鲆鰻弧菌疫苗的研究. 海洋科學(xué), 2002, 26(4): 63–66]

Pan HJ, Hao B, Li J,. Impact of Cpx on the virulence of. Marine Sciences, 2013, 37(2): 17–21 [潘海建, 郝斌, 李杰，等. Cpx對(duì)遲緩愛德華氏菌毒力的影響. 海洋科學(xué), 2013, 37(2): 17–21]

Pan YH, Ma Y, Zhao DL,.Study on immune response ofinduced by live attenuatedvaccine. Food and Drug, 2009, 11(5): 12–15 [潘燕華, 馬悅, 趙東玲, 等. 鰻弧菌減毒活疫苗對(duì)牙鲆免疫效果的研究. 食品與藥品, 2009, 11(5): 12–15]

Pedersen K, Grisez L, Houdt R,. Extended serotyping scheme forwith the definition and characterization of seven provisional O-serogroups. Current Microbiology, 1999, 38(3): 183–189

Schr?der MB, Mikkelsen H, B?rdal S,. Early vaccination and protection of Atlantic cod (L.) juveniles against classical vibriosis. Aquaculture, 2006, 254(1–4): 46–53

Shen P, Fan XR, Li GW. Microbiology experiment (3rd ed). Higher Education Press, 1999, 154–165 [沈萍, 范秀容, 李廣武. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第三版). 高等教育出版社, 1999, 154–165]

Srinivasa Rao PS, Lim TM, Leung KY. Functional genomics approach to the identification of virulence genes involved inpathogenesis. Infection and Immunity, 2003, 71(3): 1343–1351

Wang Z, Vinogradov E, Li J,. Structural characterization of the lipopolysaccharide O-antigen from atypical isolate ofstrain 1282. Carbohydrate Research, 2009, 344(11): 1371–1375

Xiao H, Li J, Wang XH,.Preparation of vaccine against vibriosis of sea perch () and its immune efficiency evaluation. Journal of Ocean University of Qingdao, 2003, 33(2): 226–232 [肖慧, 李軍, 王祥紅, 等. 鱸魚鰻弧菌病疫苗的制備及免疫防治效果. 青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 33(2): 226–232]

Xiao P, Mo ZL, Zou YX,. Immune responses and efficacy of an oral-emulsified bivalent vaccine againstin turbot (). High Technology Letters, 2007, 17(9): 979–985 [肖鵬, 莫照蘭, 鄒玉霞, 等. 鰻弧菌油乳化二價(jià)口服疫苗免疫養(yǎng)殖大菱鲆的免疫應(yīng)答及免疫效果的研究. 高技術(shù)通訊, 2007, 17(9): 979–985]

Yang MC. Veterinary statistics. Beijing: China Prospect Publishing House, 1990, 232–234 [楊茂成. 獸醫(yī)統(tǒng)計(jì)學(xué). 北京: 中國(guó)展望出版社, 1990, 232–234]

Zhao LN. Characterziation of serotype and genotype ofstrains isolated from marine fish. Master′s Thesis of Qingdao Agricultural University, 2014, 25–30 [趙魯寧. 海水養(yǎng)殖魚類鰻弧菌分離株的血清型和基因型鑒定. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2014, 25–30]

Zhu KL, Chen JX, Li Y,. Study on the vaccination againstin farmed marine turbot. High Technology Letters, 2004, 14(2): 76–80 [朱開玲, 陳吉祥, 李筠, 等. 鰻弧菌滅活疫苗對(duì)海水養(yǎng)殖大菱鲆的免疫預(yù)防研究.高技術(shù)通訊, 2004, 14(2): 76–80]

(編輯 馬璀艷)

Immunogenicity and Protective Efficacy of Three InactivatedSerotype O3 Vaccine Preparations

LI Shufang1,2, TANG Lei1,3, LI Jie1, LI Guiyang1, WANG Xiaoran1,3, WANG Xiaolu1,3, DING Shan1,2, MO Zhaolan1,2①

(1. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology,Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003)

, an etiological agent of fish septicemia, has caused great economic losses in many marine and fresh water fish. Vaccination is an effective and safe approach to control fish septicemia. The pathogenicityserotype O3 in cultured marine fish of China promotes us to evaluate the immunogenicity and protective efficacy of threeserotype O3 inactivated vaccine. Threeserotype O3 strains (SMP1, SMP3, and SMP4) were rejuvenated in flounderand then were determined for lethal dose 50% (LD50) inwhich had been acclimated to 10 salinity. The result showed that LD50of SMP1, SMP3 and SMP4 were 105.1CFU/ml, 104.7CFU/ml and 105.4CFU/ml, respectively. Three inactivated vaccine were obtained by incubation ofwith 0.2% formaldehyde for 36 h at 28℃. Each vaccine was used to vaccinate floundervia intraperitoneal injection with a dosage of 108CFU/ml. Specific serum antibody titers againstcells were detected evidently (<0.05) at 7 d post vaccination, and the highest titers of 1:1280(SMP1), 1:640 (SMP3) and 1:905 (SMP4) were detected at 4 weeks post vaccination (<0.05). Meanwhile, the relative percent survival rates (RPS) were 94.4% (SMP1), 100% (SMP3) and 73.7% (SMP4). These results indicated thatserotype O3 inactivated vaccines were able to induce immune response in fish and provide effective protection againstinfection, and SMP3 is the best candidate for vaccine development and application.

serotype O3; LD50; Inactivated vaccine; Serum antibody titer; Relative percent survival rate

MO Zhaolan, Email: mozl@ysfri.ac.cn

2016-11-06,

2016-12-29

S942

A

2095-9869(2018)01-0137-07

10.11758/yykxjz.20161106001

http://www.yykxjz.cn/

* 山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(2014ZZCX06205)、中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2016HY-ZD0505)和青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室鰲山科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2015ASKJ02)共同資助[This work was supported by the Special Independent Innovation and Achievement Transformation of Shandong Province (2014ZZCX06205), Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund (2016HY-ZD0505) and the Scientific and Technological Innovation Project Financially Supported by Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (2015ASKJ02)]. 李淑芳，E-mail: lsf891106@163.com

莫照蘭，研究員，E-mail: mozl@ysfri.ac.cn

李淑芳, 唐磊, 李杰, 李貴陽, 王曉冉, 王小鹿, 丁山, 莫照蘭. 3株O3血清型鰻弧菌滅活疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)效果. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(1): 137–143

Li SF, Tang L, Li J, Li GY, Wang XR, Wang XL, Ding S, Mo ZL. Immunogenicity and protective efficacy of three inactivatedserotype O3 vaccine preparations. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(1): 137–143