王玉紅 尹曉雪 丁明媚 付勝利 陳 萌 郭 政,2 葉劍敏,2

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尼羅羅非魚基因克隆及表達分析

王玉紅1尹曉雪1丁明媚1付勝利1陳 萌1郭 政1,2葉劍敏1,2①

(1. 廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點實驗室 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州 510631；2. 廣東省水產(chǎn)優(yōu)質(zhì)環(huán)保養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州 510631)

為了了解尼羅羅非魚()細胞轉(zhuǎn)錄因子()的基因序列特征及其在無乳鏈球菌()應(yīng)激和在B細胞分化中的作用，應(yīng)用RACE克隆技術(shù)獲得的基因全長1380 bp，包括開放閱讀框ORF為1155 bp，5￠端非編碼區(qū)(5￠UTR)長127 bp，3￠端非編碼區(qū)(3'UTR)長98 bp。序列分析推測該基因編碼384個氨基酸，分子量為41.32 kDa，理論等電點為4.36。同源性分析顯示，基因與其他魚類的聚為一支，其中，與南極鱈()相似性最高。熒光定量PCR及Western-blot結(jié)果顯示，OnXbp1-S在各組織中均有表達，mRNA水平上在肝臟中表達量最高，蛋白水平上在胸腺中表達量最高，而在肌肉中表達量最低。無乳鏈球菌應(yīng)激后，基因在肝臟和脾臟中的表達趨勢相似，均在應(yīng)激期間出現(xiàn)表達量上調(diào)，在192 h出現(xiàn)峰值。另外，免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，因子在不同分化程度B細胞亞類中的表達呈現(xiàn)差異，在成熟B細胞中呈現(xiàn)高表達，而在未成熟B細胞中幾乎不表達。研究結(jié)果表明，參與尼羅羅非魚對無乳鏈球菌的免疫防御，和在B細胞分化中起作用。本研究將為進一步研究因子應(yīng)答病原菌侵染的機理及促進B細胞分化機制提供理論依據(jù)。

尼羅羅非魚；；基因克??；組織表達；無乳鏈球菌

X盒結(jié)合蛋白1(Xbp1, X-box binding protein 1)是一種重要的細胞轉(zhuǎn)錄因子，與人體許多機能密切相關(guān)，如B細胞、肝細胞和樹突狀細胞的發(fā)育分化，心肌細胞的存活及肝脂肪的調(diào)節(jié)等(Wang, 2008; Iwakoshi, 2007; Tellier, 2016)。Xbp1為堿性亮氨酸拉鏈蛋白，有剪切型Xbp1(Xbp1 spliced, Xbp1-S)和未剪切型Xbp1(Xbp1 unspliced, Xbp1-U)兩種類型。兩種不同剪切類型的Xbp1具有不同的轉(zhuǎn)錄活性，其中，Xbp1-S的轉(zhuǎn)錄活性明顯高于Xbp1-U (Zhou, 2008)。Xbp1-S是CREB/ATF蛋白家族的成員，最早由Liou等(1990)在研究人類B細胞的時候發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子。隨后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時的研究發(fā)現(xiàn)不同于Xbp1-U的另一種剪切形式Xbp1-S，是由Ⅰ型跨膜蛋白激酶核酸內(nèi)切酶(TypeⅠ transmembrane protein kinase, ⅠRE1)剪切Xbp1-U的mRNA所產(chǎn)生(Yoshida, 2001; Calfon, 2002)。Xbp1參與B細胞向漿細胞的分化，是經(jīng)過調(diào)控IL-6的生成并通過進一步非折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答(Unfolded protein response, UPR)途徑所促進的(Calfon, 2002; Iwakoshi, 2003)。在哺乳動物中，Xbp1的異常活動也可以促進惡性漿細胞的分化(Reimold, 2001)。作為剪切后的Xbp1-S具有更高的轉(zhuǎn)錄活性，能進去細胞核調(diào)節(jié)未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)。

Xbp1-S是一種高度保守的蛋白，從低等酵母到高等哺乳動物中均有存在(Liou, 1990)。在硬骨魚中，Xbp1-S的研究逐步增加，現(xiàn)已報道的魚類包括斑馬魚()(Hu, 2007; Bennett, 2007)、鯉魚()(彭少卿等, 2013)、紅鰭東方鲀()(Ohtani, 2006)、虹鱒()(Barr, 2011)和大西洋鮭()(Leong, 2010)等。Hu等(2007)在斑馬魚的胚胎細胞中發(fā)現(xiàn)，當UPR應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，Xbp1可以通過IGF1/Akt激活凋亡信號發(fā)揮抑制作用；Barr等(2011)利用Xbp1作為標記分子進行鑒定不同分化程度的B細胞亞類；Zwollo等(2005、2008)利用Xbp1以及Pax-5等轉(zhuǎn)錄因子對虹鱒魚的腎臟進行分區(qū)，并進一步揭示虹鱒魚B細胞的發(fā)育分化與Xbp1的表達相關(guān)。但關(guān)于尼羅羅非魚Xbp1-S的研究還未見相關(guān)報道。另外，與哺乳動物相比，有關(guān)硬骨魚Xbp1-S的研究還處于起步階段，其在宿主應(yīng)對病原侵染中的作用尚待進一步明確。

羅非魚是聯(lián)合國推薦養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。我國是最大的羅非魚生產(chǎn)國，近些年，因養(yǎng)殖規(guī)模擴大、高密度養(yǎng)殖、水體污染等，導(dǎo)致羅非魚魚病大規(guī)模暴發(fā)，如鏈球菌病，造成巨大經(jīng)濟損失 (盧邁新, 2010)。本研究選用尼羅羅非魚為實驗魚，旨在克隆基因cDNA全長并序列比對，從基因和蛋白水平上分析無乳鏈球菌應(yīng)激脅迫后尼羅羅非魚各組織的時空表達模式，并查明該因子在不同分化程度B細胞亞類中的表達水平，為進一步研究尼羅羅非魚在防御鏈球菌侵染中所起作用及其調(diào)控B細胞發(fā)育分化機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魚購自廣東省漁業(yè)種質(zhì)保護基地，健康尼羅羅非魚的體重為(200±10) g，體長為(13±2) cm。養(yǎng)殖溫度為(29±1)℃，早晚投喂飼料，加氣泵供氧，飼養(yǎng)14 d使其充分適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境，觀察魚體外觀和活動能力，確認完全健康后用于實驗。無乳鏈球菌菌株為本實驗室保存菌株。PCR反應(yīng)體系所用試劑、pMD-18T Vector、限制性內(nèi)切酶、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript?RTreagent kit with gDNA eraser)和熒光定量試劑盒(SYBRPremix ExTM)均購自TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)、BL21(DE3)感受態(tài)膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒(TIANprep mini plasmid kit)購自TIANGEN公司；pET32a(+) Vector由本實驗室保存，SMARTTMRACE cDNA amplification kit購自BD Biosciences Clontech公司。Trizol、2′Prime Mix、Ex、10′Buffer、dNTP、pMD 18-T Vector、Solution I和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司。氨芐青霉素、氯仿和異丙醇等試劑購自廣州化學(xué)試劑公司，其余實驗試劑均為國產(chǎn)分析純。引物(表1)由華大基因科技服務(wù)有限公司合成。

表1 基因克隆和表達所用的引物

Tab.1 Primers used in the cloning and expression

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 采用Trizol(Invitrogen)法進行總RNA提取。取健康尼羅羅非魚頭腎，用勻漿器充分研磨，并按照Trizol試劑的使用說明書提取總RNA，RNA完整性和純度用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用微量分光光度計NANO2000檢測其濃度，-80℃保存。利用普通的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，使用SMARTTMRACE cDNA amplification kit將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成5￠、3￠-RACE cDNA模板(Yao, 2016)。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后對模板進行有效性的檢測，以β-actin作為內(nèi)參基因進行PCR鑒定，合格后–20℃保存。

1.2.2 尼羅羅非魚的基因全長cDNA的克隆和測序 在NCBI搜索尼羅羅非魚的基因，根據(jù)預(yù)測序列(XM_013276886.1)，應(yīng)用軟件Primer Premier 5.0進行引物Xbp1-F1和Xbp1-R1設(shè)計(表1)，以尼羅羅非魚頭腎cDNA為模板，以Xbp1-F1和Xbp1-R1為引物進行的cDNA的擴增，PCR反應(yīng)的體系為25 μl，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；58.0℃退火30 s；72℃延伸1.0 min；30個循環(huán)。擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往北京六合華大基因公司進行測序。測序結(jié)果經(jīng)NCBI (http://www. ncbi.nlm.nih.gov)比對，獲得尼羅羅非魚的cDNA序列。

1.2.3 尼羅羅非魚的基因3￠和5￠-RACE擴增

根據(jù)獲得的的CDS序列，設(shè)計的5￠-RACE PCR和3￠-RACE PCR的引物Xbp1-F2、Xbp1-F3、Xbp1-R2和Xbp1-R3(表1)，采用巢式PCR方法進行3￠和5￠-RACE的擴增，先分別用Xbp1-F2、Xbp1-R2和UPM混合引物(混合濃度參照試劑盒說明書)進行首輪擴增，然后利用首輪擴增的PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為第二輪模板，再分別用Xbp1-F3、Xbp1-R3和NUP為引物進行第二輪擴增，全長克隆采用20 μl PCR反應(yīng)體系(Yao, 2016)。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；68℃退火30 s；72℃延伸1 min，35個循環(huán)。擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往北京六合華大基因公司進行測序。測序結(jié)果與的cDNA序列比對結(jié)果見圖1，找出起始密碼子和polyA加尾信號。

1.2.4 尼羅羅非魚的序列分析 用DNAStar軟件中的SeqMan程序去克隆載體，將3￠、5￠測序結(jié)果結(jié)合CDS序列進行拼接分析，進一步確認擴增獲得CDS的全長。用NCBI網(wǎng)站的BLAST程序進行編碼蛋白序列的堿基同源性分析；用Bioedit軟件將尼羅羅非魚與其他魚類的Xbp1-S的氨基酸序列進行多重比對；應(yīng)用MEGA 6.0軟件，采用鄰位相接法(NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用Bootstrap重復(fù)1000次計算各分支的置信度。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測使用ProtParam軟件(http://web.expasy.org/protparam/)，使用NCBI網(wǎng)站保守結(jié)構(gòu)域(CDD)數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進行氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

1.2.5 尼羅羅非魚Xbp1-S多克隆抗體的制備 根據(jù)Xbp1-S的CDS序列的鋅指結(jié)構(gòu)，選取包含鋅指結(jié)構(gòu)的起始密碼子甲硫氨酸開始的前504 bp的堿基進行原核表達分析，構(gòu)建pET32A-XBP1的蛋白表達載體，并導(dǎo)入到BL21中特異性表達出約40 kDa的目的片段(包含pPET32A載體本身的分子量)。并進一步進行蛋白的大批量表達和純化，獲得目的蛋白，將純化后的重組蛋白濃縮后與弗氏佐劑(Sigma)混合，腹腔免疫小鼠(BALB/c, 8周)，2周免疫1次，連續(xù)免疫4次，首次免疫使用弗氏完全佐劑，再次免疫使用弗氏不完全佐劑，每次免疫蛋白用量為50 μg/只。尾部靜脈取血，獲得抗血清后檢測抗性，通過直接ELISA檢測其效價。在第4次免疫后4 d (達到抗體效價最高)，進行尾部靜脈取血，獲得抗血清，用于蛋白的檢測和免疫組化等實驗。

1.2.6 尼羅羅非魚Xbp1-S組織表達 采用熒光定量PCR的方法檢測Xbp1在mRNA水平上在健康羅非魚各組織中的表達量，用Western-blot的方法檢測Xbp1蛋白在各組織中的分布。取健康的3尾尼羅羅非魚，取頭腎、后腎、脾臟、皮膚、鰓、腸、胸腺、肝臟和肌肉組織，用液氮速凍后置于–80℃保存。并進行各組織RNA及組織蛋白的提取后進行RT-PCR和Western-blot組織蛋白的檢測。用于RT-PCR檢測尼羅羅非魚不同組織中表達的引物見表1。反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 1 min；60℃ 30 s；72℃ 30 s，35個循環(huán)。每個樣本重復(fù)3次，根據(jù)t(Threshold cycles)值(15＜t＜35)，以β-actin基因為內(nèi)參，利用公式2-ΔCt得出每個樣本基因的相對表達值。

1.2.7 無乳鏈球菌應(yīng)激實驗 取60尾健康尼羅羅非魚隨機分成2組，即應(yīng)激組和對照組。應(yīng)激組腹腔分別注射100 μl濃度為5×105CFU/μl的無乳鏈球菌(Tellez-Ba?uelos, 2009; Gan, 2015)；對照組腹腔注射100 μl無菌PBS，注射0、6、24、48、192、264 h后，分別在應(yīng)激組和對照組隨機取3尾魚，取各組織用液氮速凍后保存于–80℃冰箱，用于后續(xù)各組織基因的RT-PCR分析檢測。RT-PCR擴增體系為20 μl，試劑添加按照SYBR?Premix ExTMⅡ說明書進行。反應(yīng)程序：95℃3 min；95℃ 1 min；60℃ 30 s；72℃30 s，35個循環(huán)。2-ΔΔCt方法對熒光定量PCR檢測結(jié)果進行分析，顯著性用SPSS 17.0軟件進行分析并用SigmaPlot 10.0作圖。

1.2.8 Xbp1免疫組化 選取健康尼羅羅非魚的頭腎白細胞用于免疫組化實驗。頭腎白細胞的分離采用Percoll密度梯度分離法進行，根據(jù)尼羅羅非魚B細胞的比重，分別配制Percoll 40、50、60及70試劑，疊加后配成Percoll密度梯度分離液，從而分離開發(fā)育分化程度不同的B細胞亞類。在超凈工作臺取健康尼羅羅非魚的頭腎并加入3 ml 1640細胞培養(yǎng)液進行充分研磨，吸取上清液，去除大的組織塊，備用。根據(jù)使用說明書，首先把Percoll(GE Healthcare)原液用10′PBS(NaH2PO4·2H2O 2.286 g，Na2HPO4·12H2O 29.14 g，NaCl 87.75 g) 9∶1稀釋為備用Percoll儲存液，然后用1′PBS進一步配成Percoll 40、50、60和70，進行疊加各層分離B細胞。把分離的細胞進一步細胞涂片后進行采用EnVisionTM免疫組織化學(xué)二步法，主要步驟包括：切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯，去離子水水化；3%過氧化氫溶液室溫避光孵育25 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；3% BSA室溫封閉30 min后滴加一抗，4℃孵育過夜；熒光二抗室溫孵育30 min；熒光顯微鏡鏡檢，陽性細胞呈現(xiàn)明顯的熒光，并對圖像采集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OnXbp1-S基因cDNA全長克隆及序列分析

根據(jù)已經(jīng)獲得的ORF序列，進一步設(shè)計特異性RACE引物Xbp1-F2、Xbp1-F3及Xbp1-R2和Xbp1-R3 (表1)。Xbp1-F2和Xbp1-R2與通用引物UPM以及Xbp1-F3和Xbp1-R3與通用引物NUP分別配對，進行3￠-RACE和5￠-RACE擴增(Yao, 2016)，所得產(chǎn)物經(jīng)測序拼接后，獲得尼羅羅非魚基因全長cDNA序列為1155 bp，3￠端非編碼區(qū)(3'UTR)長98 bp，5￠端非編碼區(qū)(5￠UTR)長127 bp，3￠端含有polyA尾以及多聚腺苷酸AATAA加尾信號(圖1)。氨基酸序列分析可知，基因可以編碼384個氨基酸殘基，其推導(dǎo)的分子量為41.32 kDa，理論等電點為4.36。由蛋白質(zhì)的功能預(yù)測可知，含有174 bp的鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域(圖1下劃線部分)，該區(qū)域是比較保守的蛋白結(jié)構(gòu)，該蛋白屬于堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)蛋白。

2.2 OnXbp1-S基因的同源性分析

利用Bioedit軟件對尼羅羅非魚基因編碼的氨基酸序列與紅鰭東方鲀、虹鱒、歐洲食用牡蠣()、斑馬魚、斑點雀鱔()、墨西哥脂鯉()、青鳉()、南極鱈()、原雞()、小鼠()及人()進行同源比對，與不同物種中鋅指結(jié)構(gòu)的同源性高達79%(圖2)。如圖2所示，黑色陰影表示同源性大于75%的區(qū)域，主要是集中在不同物種的鋅指結(jié)構(gòu)的保守區(qū)域。利用MEGA 6.0軟件對已經(jīng)公布的哺乳動物和常見的魚類進行系統(tǒng)進化分析，顯示尼羅羅非魚與南極鱈同屬一個分支，同源性最高，與其他無脊椎動物的聚為一類。而在哺乳類動物、兩棲類動物、鳥類和魚類中有明顯分化(圖3)。

2.3 原核蛋白的表達純化及多克隆抗體的制備

以尼羅羅非魚基因片段為模板，使用特異性引物Xbp1-F4、R4(表1)成功擴增到長度為504 bp的目的片段，將目的片段連接到pET32a質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒pET32a-Xbp1。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)后，將測序正確的陽性克隆進行誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)前的目的蛋白表達較弱(圖4)，誘導(dǎo)后有明顯表達的條帶大小約為40 kDa，與融合蛋白的預(yù)測分子量一致(包括目的蛋白18 kDa和pET-32a標簽蛋白21 kDa)。融合蛋白的可溶性分析結(jié)果顯示，其主要以包涵體的形式存在。經(jīng)SDS-PAGE檢測，純化蛋白在40 kDa處有較為單一條帶。用抗His-tag的單克隆抗體Western-blot檢測純化后的蛋白，發(fā)現(xiàn)在40 kDa處存在單一條帶，確定此蛋白為OnXbp1-S表達的融合蛋白。濃縮純化后的蛋白，制作抗原免疫小鼠并獲得抗血清，直接ELISA法檢測其抗體效價為800,000(units/ml)，表明所制備的小鼠抗羅非魚Xbp1-S多克隆抗血清效果良好。

2.4 尼羅羅非魚Xbp1-S基因和蛋白水平的組織分布以及鏈球菌應(yīng)激表達分析

采用Real-time qPCR方法檢測mRNA在健康尼羅羅非魚不同組織中的相對表達量；并利用所制備的OnXbp1-S多抗Western-blot檢測OnXbp1蛋白在不同組織的相對表達水平。mRNA相對表達量的結(jié)果顯示，OnXbp1-S在所檢測的8個組織中的表達量，由低到高依次為肌肉<胸腺<脾臟<皮膚<鰓<腸<頭腎<肝臟，在肝臟的表達量最高，在頭腎也有較高的表達，而在肌肉組織中幾乎不表達(圖5 A)。OnXbp1-S蛋白的相對表達量的結(jié)果顯示(圖5 B)，OnXbp1-S蛋白在所檢測的9個組織中的表達量，由低到高依次為腸<脾臟<肌肉<皮膚<肝臟<后腎<鰓<頭腎<胸腺，在胸腺的表達量最高，在頭腎、鰓中都有較高的表達，而在腸道肌肉中幾乎沒有表達。

圖1 尼羅羅非魚Xbp1-S基因cDNA全序列以及由此推測的氨基酸序列

起始密碼子和終止密碼子由細線框標出；下劃線表示的鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域；陰影部分表示原核表達的抗原結(jié)合區(qū)域；短虛線表示RACE結(jié)果的加尾信號

Start codon (atg) and stop codon (tga) were marked with filament box; regular underline represented the basic-region leucine zipper (bZIP) domain of X-box binding protein 1 (Xbp1); shadow represented the Prokaryotic expressed sequence, short dash underline represented tailing signal of RACE

圖2 OnXbp1氨基酸序列與其他物種Xbp1序列比對

圖3 利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建的基于Xbp1基因所編碼氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進化樹

圖4 Xbp1-S蛋白的原核表達及其純化

M: 蛋白Marker; 1: 空載菌蛋白; 2: 重組菌IPTG誘導(dǎo)前; 3: 重組菌IPTG誘導(dǎo)后; 4: 純化后蛋白; 5: 純化后蛋白Western-blot

M: Protein Marker; 1: Protein of empty plasmid vector; 2: Protein before IPTG induction; 3: Protein after IPTG induction; 4: Purification protein; 5: Western-blot of purification protein

在經(jīng)過腹腔注射鏈球菌后，與對照組相比，所檢測的不同時間點里其肝臟和脾臟均呈上調(diào)表達的趨勢，且其趨勢基本一致。在早期即腹腔注射6 h后，基因的表達呈現(xiàn)顯著性增高，其后的24 h和48 h的表達量有所下降，但在192 h達到基因表達量的最高水平(圖6A，圖6B)，而后在264 h逐漸回落下降，趨向?qū)φ战M的水平。

2.5 尼羅羅非魚Xbp1-S在不同B細胞亞型中的免疫組化分析

根據(jù)Zwollo等(2005)報道的Percoll密度分離法，分離出羅非魚頭腎B細胞不同亞類細胞：Percoll 40細胞(多為漿細胞，圖7A)、Percoll 50細胞(多為原漿B細胞，圖7B)、Percoll 60細胞(初分化成熟的B細胞，圖7C)、和Percoll 70細胞(多為未成熟的B細胞，圖7D)。如圖7所示，OnXbp1-S蛋白在不同B細胞亞類中表達量水平可由其紅色熒光所顯示，表達量的 變化從低到高依次為Percoll 70

圖5 Xbp1-S基因及蛋白水平在尼羅羅非魚不同組織中的表達分布

圖6 無乳鏈球菌應(yīng)激后尼羅羅非魚Xbp1-S基因的表達量變化

A：肝臟; B：脾臟

A：Liver; B：Spleen

圖7 Xbp1在尼羅羅非魚不同B細胞亞類中的表達

A. Percoll 40; B. Percoll 50; C. Percoll 60; D. Percoll 70

3 討論

細胞轉(zhuǎn)錄因子Xbp1表達與B細胞的發(fā)育分化及抗體的表達分泌息息相關(guān)(Zwollo, 2005、2008; Tellier, 2016)。Xbp1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中蛋白質(zhì)折疊能力的主要調(diào)控者之一，具有2種不同剪切類型(Xbp1-S和Xbp1-U)，其中，Xbp1-S具有高度轉(zhuǎn)錄活性(Zhou, 2008)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)錄后修飾基因表達等多種功能,一旦發(fā)生錯誤的折疊將導(dǎo)致抗凋亡反應(yīng)并促進腫瘤細胞的無限增值(Hendershot, 2004; Robinson, 1994)。因此，Xbp1研究對于B細胞的發(fā)育分化和調(diào)控以及其在防御病原菌侵染的免疫功能分析具有重要的意義。

本研究克隆尼羅羅羅非魚的基因序列，并利用外源蛋白原核表達系統(tǒng)(Salinas, 2011)成功構(gòu)建的體外表達系統(tǒng)，制備多克隆抗體；組織表達分析發(fā)現(xiàn)，在尼羅羅非魚的正常組織中廣泛存在；在無乳鏈球菌應(yīng)激實驗期，在肝臟和脾臟表達具有較強的上調(diào)且反應(yīng)趨于同步；并證實了在尼羅羅非魚中可能也存在對于漿細胞即成熟B細胞的發(fā)育分化調(diào)節(jié)作用。

Xbp1在哺乳動物的體內(nèi)廣泛存在，在各個組織分析中都有表達，其中在肝細胞中高表達(Liou, 1990; Calfon, 2002)。本研究結(jié)果顯示，尼羅羅非魚OnXbp1-S在各個檢測組織中都有表達，在mRNA水平上主要表達在肝臟中，這與哺乳動物中的發(fā)現(xiàn)相類似。然而，蛋白水平上的高表達主要在胸腺和頭腎中，表明Xbp1-S的表達與免疫細胞(B細胞和T細胞)的發(fā)育分化可能有一定關(guān)聯(lián)(Zwollo, 2005、2008; Tellier, 2016)。免疫系統(tǒng)中主要免疫細胞的發(fā)育分化與Xbp1-S表達的正相關(guān)反映了Xbp1-S轉(zhuǎn)錄因子可能在免疫反應(yīng)中起重要調(diào)控作用，因為Xbp1-S因子不僅參與體液免疫，而且可能參與細胞免疫的促進作用。無乳鏈球菌應(yīng)激實驗顯示，在應(yīng)激后264 h期間，OnXbp1-S在脾臟和肝臟中都有明顯的表達上調(diào)。腹腔注射鏈球菌6 h后，肝臟和脾臟中OnXbp1-S mRNA表達顯著上調(diào)出現(xiàn)第一個峰值，這種應(yīng)激后短時間內(nèi)表達量激增的現(xiàn)象表明該因子很可能參與天然免疫反應(yīng)。第二個更顯著的表達高峰出現(xiàn)在鏈球菌應(yīng)激后的192 h (8 d)，這個顯著上調(diào)很可能是由于參與適用性免疫反應(yīng)的免疫細胞(B細胞和T細胞)中Xbp1-S因子的表達明顯上調(diào)。

硬骨魚的頭腎組織類似于哺乳動物的骨髓，具有造血功能并且是免疫細胞發(fā)育的場所，因此，頭腎組織含有不同血系的未成熟血細胞(Fange, 1986; Zapata, 1995)。頭腎是免疫細胞發(fā)生、發(fā)育分化和增殖的重要場所，也是捕獲抗原和產(chǎn)生抗體的主要器官(Kaattari, 1985; Bromage, 2004; Ye, 2010; Ma, 2013)。本研究尼羅羅非魚的頭腎組織采用Percoll密度梯度分離的方法獲得不同發(fā)育分化程度的B細胞亞類(Zwollo, 2005)，并采用免疫組化檢測各類細胞熒光強度，發(fā)現(xiàn)高表達在分化程度高的成熟漿細胞和原漿細胞中，而在na?ve B細胞和未成熟B細胞中表達量較低。尼羅羅非魚不同B細胞亞類表達不同水平的現(xiàn)象，與已報道的紅鰭東方鲀(Ohtani, 2006)和虹鱒魚(Zwollo, 2008)相類似。B細胞分化程度與因子的表達正相關(guān)表明，該因子對于成熟漿細胞以及漿母細胞的發(fā)育具有重要的促進作用，即對B細胞的分化起正調(diào)節(jié)作用，調(diào)控原漿細胞是在特定的生態(tài)位中進一步發(fā)育分化為漿細胞(Ye, 2011)。Xbp1-S的免疫功能尤其對于B細胞分化的作用研究有利于探索體液免疫B細胞的發(fā)育分化調(diào)控機制。綜上所述，本研究將為進一步研究尼羅羅非魚Xbp1-S因子應(yīng)答病原菌侵染的機理及促進B細胞分化機制提供理論依據(jù)。

Barr M, Mott K, Zwollo P. Defining terminally differentiating B cell populations in rainbow trout immune tissues using the transcription factor Xbp1. Fish and Shellfish Immunology, 2011, 31(6): 727–735

Bennett JT, Joubin K, Cheng S,. Nodal signaling activates differentiation genes during zebrafish gastrulation. Developmental Biology, 2007, 304(2): 525–540

Bromage ES, Ye J, Owens L,. Use of staphylococcal protein A in the analysis of teleost immunoglobulin structural diversity. Developmental and Comparative Immunology, 2004, 28(7–8): 803–814

Calfon M, Zeng H, Urano F,. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature, 2002, 415(6867): 92–96

Fange R. Lymphoid organs in sturgeons (Acipenseridae). Veterinary Immunology and Immunopathology, 1986, 12(1–4): 153–161

Gan Z, Wang B, Lu Y,. Molecular characterization and expression of Lck in Nile tilapia () in response tostimulus. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2015, 175(5): 2376–2389

Hendershot LM. The ER function BiP is a master regulator of ER function. Mount Sinai Journal of Medicine, 2004, 71(5): 289–297

Hu MC, Gong HY, Lin GH,. XBP-1, a key regulator of unfolded protein response, activates transcription of IGF1 and Akt phosphorylation in zebrafish embryonic cell line. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, 359(3): 778–783

Iwakoshi NN, Lee AH, Glimcher LH. The X-box binding protein-1 transcription factor is required for plasma cell differentiation and the unfolded protein response. Immunological Reviews, 2003, 194(1): 29–38

Iwakoshi NN, Pypaert M, Glimcher LH. The transcription factor XBP-1 is essential for the development and survival of dendritic cells. Journal of Experimental Medicine, 2007, 204(10): 2267–2275

Kaattari SL, Irwin MJ. Salmonid spleen and anterior kidney harbor populations of lymphocytes with different B cell repertoires. Developmental and Comparative Immunology, 1985, 9(3): 433–444

Leong JS, Jantzen SG, von Schalburg KR.andfull-length cDNA sequences reveal changes in evolutionary pressures on a post-tetraploidization genome. BMC Genomics, 2010, 11(1): 279

Liou HC, Boothby MR, Finn PW,. A new member of the leucine zipper class of proteins that binds to the HLA DR alpha promoter. Science, 1990, 247(4950): 1581–1584

Lu MX. Review of research on streptococcosis in Tilapia. South China Fisheries Science, 2010, 6(1): 75–79 [盧邁新. 羅非魚鏈球菌病研究進展. 南方水產(chǎn), 2010, 6(1): 75–79]

Ma C, Ye J, Kaattari SL. Differential compartmentalization of memory B cells versus plasma cells in salmonid fish. European Journal of Immunology, 2013, 43(2): 360–370

Ohtani M, Miyadai T, Hiroishi S. Identification of genes encoding critical factors regulating B-cell terminal differentiation in torafugu (). Comparative Biochemistry and Physiology Part D Genomics Proteomics, 2006, 1(1): 109–114

Peng SQ, An LG, Zhang Z,. Cloning and tissue-specific expression analysis of Xbp1 gene inL. Journal of University of Jinan, 2013, 27(2): 1671–3359 [彭少卿, 安利國, 張珍, 等. 鯉魚Xbp1基因克隆與組織特異性表達分析. 濟南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2013, 27(2): 1671–3359]

Reimold AM, Iwakoshi NN, Manis J,. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature, 2001, 412(6844): 300–307

Robinson AS, Hines V, Wittrup KD. Protein disulfide isomerase overexpression increase secretion of foreign protein in. Biotechnology, 1994, 12(4): 381–384

Salinas I, Zhang YA, Sunyer JO. Mucosal immunoglobulins and B cells of teleost fish. Developmental and Comparative Immunology, 2011, 35(12): 1346–1365

Tellez-Ba?uelos MC, Santerre A, Casas-Solis J,. Oxidative stress in macrophages from spleen of Nile tilapia () exposed to sublethal concentration of endosulfan. Fish and Shellfish Immunology, 2009, 27(2): 105–111

Tellier J, Shi W, Minnich M,. Blimp-1 controls plasma cell function through the regulation of immunoglobulin secretion and the unfolded protein response. Nature Immunology, 2016, 17(3): 323–330

Wang H, Zhang Y, Yehuda-Shnaidman E,. Liver X receptor alpha is a transcriptional repressor of the uncoupling protein 1gene and the brown fat phenotype. Molecular and Cell Biology, 2008, 28(7): 2187–2220

Yao WL, He YY, Liu P,. The cDNA cloning and expression analysis of P38 MAPK gene of. Progress in Fishery Sciences, 2016, 37(2): 91–98 [姚萬龍, 何玉英, 劉萍, 等. 中國對蝦() p38 MAPK基因克隆及表達分析. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2016, 37(2): 91–98]

Ye J, Bromage ES, Kaattari SL. Plasma blasts and plasma cells and the organization of the teleost immune system. Developmental and Comparative Immunology, 2011, 35(12): 1273–1281

Ye J, Bromage ES, Kaattari SL. The strength of B cell interaction with antigen determines the degree of IgM polymerization. Journal of Immunology, 2010, 184(2): 844–850

Yoshida H, Matsui T, Yamamoto A,. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell, 2001, 107(7): 881–891

Zapata AG, Torroba M, Vicente A,. The relevance of cell microenvironments for the appearance of lympho- haemopoietic tissues in primitive vertebrates. Histology and Histopathology, 1995, 10(3): 761–778

Zhou M, Jacob A, Ho N,. Downregulation of protein disulfide isomerase in sepsis and its role in tumor necrosis factor-alpha release. Critical Care, 2008, 12(4): R100

Zwollo P, Cole S, Bromage E,. B cell heterogeneity in the teleost kidney: Evidence for a maturation gradient from anterior to posterior kidney. Journal of Immunology, 2005, 174(11): 6608–6616

Zwollo P, Haines A, Rosato P,. Molecular and cellular analysis of B-cell populations in the rainbow trout using Pax5 and immunoglobulin markers. Developmental and Comparative Immunology, 2008, 32(12): 1482–1496

(編輯 馮小花)

Molecular Cloning and Expression Analysis ofof Nile Tilapia ()

WANG Yuhong1, YIN Xiaoxue1, DING Mingmei1, FU Shengli1, CHEN Meng1, GUO Zheng1,2, YE Jianmin1,2①

(1.510631; 2.510631)

X-box binding protein 1-S (Xbp1-S) is a key transcript factor mainly associated with B cell development and differentiation. The 1380 bp full-length cDNA ofincluding 1155 bp ORF, 127 bp 5'UTR and 98 bp 3'UTR was cloned with RACE, which encodes 384 amino acids with a molecular weight of 41.32 kDa and a theoretical isoelectric point of 4.36. Homology analysis revealed that thegene was homologous to other fish with the most similarity with.expresses in all tested tissues, with the highest mRNA expression in liver, and the highest protein level in thymus and the lowest protein level in muscle.stimulation induced the expression ofwith the highest level at 192 h post-infection. In addition, mature B cells have a much higherlevel than naive B cells. Taken together, the results indicated thatmight be involved in the immune response in Nile tilapia againstinfection, and play a role in B cell development and differentiation.

;; Gene cloning; Tissue expression;

YE Jianmin, E-mail: yjmying@126.com

2017-01-23,

2017-02-14

S917

A

2095-9869(2018)01-0073-10

10.11758/yykxjz.20170123001

http://www.yykxjz.cn/

* 國家自然科學(xué)基金面上項目(31472302; 31172432)和廣東省自然科學(xué)基金項目(2014A030313437)共同資助[This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31472302 and 31172432), and Natural Science Foundation of Guangdong (2014A030313437)]. 王玉紅, E-mail: wyhong1121@126.com

葉劍敏，教授，E-mail: yjmying@126.com

王玉紅, 尹曉雪, 丁明媚, 付勝利, 陳萌, 郭政, 葉劍敏. 尼羅羅非魚基因克隆及表達分析. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2018, 39(1): 73–82

Wang YH, Yin XX, Ding MM, Fu SL, Chen M, Guo Z, Ye JM. Molecular cloning and expression analysis ofof nile tilapia (). Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(1): 73–82