劉佳樂 韋秀梅 楊頂瓏 童 潼 劉相全

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大竹蟶-整合素基因的特性分析和重組表達*

劉佳樂1,2韋秀梅3楊頂瓏3童 潼1劉相全3①

(1. 廣西壯族自治區(qū)海洋研究所 廣西海洋生物技術重點實驗室 北海 536000；2. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306；3. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室 煙臺 264006)

整合素作為一種細胞粘附因子，在細胞粘附、遷移、增殖、凋亡和吞噬等過程中發(fā)揮重要作用。本研究利用分子克隆技術獲得了大竹蟶()-整合素基因()的cDNA全長，分析了其編碼氨基酸序列的進化特點，并以SWISS-MODEL預測了氨基酸序列的三級結構。基因序列全長為1168 bp，5′和3′非編碼區(qū)(UTR)分別為61 bp和18 bp，開放閱讀框(ORF)為1089 bp，編碼362個氨基酸，理論等電點約為4.98，分子量為30.0 kDa。通過熒光定量PCR法檢測了在健康大竹蟶各組織中以及大竹蟶受到脂多糖、肽聚糖和葡聚糖等微生物多糖刺激后的表達。結果顯示，在血細胞、鰓、肝胰腺、性腺、肌肉和外套膜等組織中均可表達，在鰓中的表達量最高；脂多糖、肽聚糖和葡聚糖都可以誘導表達量上調，的表達量分別在脂多糖和葡聚糖刺激后的3 h和48 h達到最高；肽聚糖刺激后表達量上調幅度最大，在6 h時達到最高,證實參與大竹蟶抵御外源微生物的免疫應答。利用基因重組技術構建了的重組表達載體，為進一步分析軟體動物整合素的功能、揭示大竹蟶先天性免疫機制奠定了基礎。

大竹蟶；整合素；免疫應答；熒光定量PCR

細胞粘附因子(Cell adhesion molecules)介導細胞與細胞之間以及細胞與細胞外基質之間的相互作用，參與信號傳導、細胞間識別、細胞增殖和分化、炎癥和傷口愈合等過程(Zhuang, 2008)。根據(jù)結構和功能的不同，細胞粘附因子分為整合素(Integrin)、鈣粘素(Cadherin)、選擇素(Selectin)、免疫球蛋白超家族(Ig-superfamily)和透明質酸粘素(Hyaladherin)五類。其中，整合素是一種由一個α亞單位和一個β亞單位通過非共價鍵連接而成的異二聚體跨膜糖蛋白。目前，已經(jīng)確認的有18種α亞單位和8種β亞單位，共組成20余種整合素(Jia, 2015)。大部分α亞基只結合一種β亞基，少數(shù)的如αV亞基可以與不同的β亞基結合。由于不同的α亞基和β亞基的氨基酸序列存在不同程度上的同源性，使得它們在結構上有共同的特點。整合素在體內表達廣泛，大多數(shù)細胞表面都可表達一種以上的整合素，在多種生命活動中發(fā)揮關鍵作用。脊椎動物的Integrin作為一種重要的粘附受體，首先在淋巴細胞表面發(fā)現(xiàn)，目前，對于Integrin發(fā)揮的免疫功能的研究已經(jīng)比較深入。Integrin細胞外的“頭部”結構域可以結合配體，“頸部”是激活單位，而長度可變的細胞質內結構域形成細胞骨架起到鏈接信號分子的作用。此外，Integrin蛋白是雙向信號轉導分子(Hynes, 2002; Schwartz, 1995)，在調控免疫反應過程中也發(fā)揮必不可少的作用(Rose, 2002; von Andrian, 2003)。近些年的研究表明，Integrin還參與腫瘤細胞粘附，比如，Integrin在口腔癌癌前病變時，起串聯(lián)受體的作用(Shahidul, 2010)；Integrin還被證明是人腸道弧菌病毒(Nelsen- Salz, 1999)、腺病毒(Wickham, 1993)、手足口病毒(Jackson, 2000)、乳頭瘤病毒(Coulson, 1997)等多種病毒的受體。

在無脊椎動物中，果蠅() Integrin被研究得較為透徹，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)3個不同的α亞基(αPS1、αPS2和αPS3)和2個β亞基，3個位置特殊的Integrin異構體(PS1、PS2和PS3)與已被發(fā)現(xiàn)脊椎動物的β1-Integrin最為相似(Relja, 2011; Stark, 1997; Yee, 1993)，有研究表明，果蠅-Integrin參與調控其血細胞吞噬細菌(Mamali, 2009)。在其他無脊椎動物中也相繼發(fā)現(xiàn)了Integrin，例如，在岡比亞按蚊()中克隆得到的-Integrin基因，推測其參與血細胞介導的對大腸桿菌的包囊作用，相應的結構特征可能使其具有吞噬革蘭氏陰性菌的能力(Moita, 2006)；在海洋無脊椎動物中，凡納濱對蝦()-Integrin被認為是細胞膜上的對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)受體(Li, 2007)；中華絨螯蟹()-Integrin作為細胞受體參與抗菌免疫(Huang, 2015)；仿刺參()-Integrin起到細胞凋亡抑制劑的作用(Wang, 2016)。與高等動物和模式動物相比，目前海洋無脊椎動物Integrin的研究尚處在起步階段，有關貝類Integrin的報道十分有限。

本研究從前期已構建的大竹蟶() cDNA文庫中克隆獲得大竹蟶-Integrin ()基因的cDNA全長，分析了編碼氨基酸的序列特征，通過熒光定量PCR法檢測了基因的mRNA在健康大竹蟶不同組織中的表達譜，以及在大竹蟶受到脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)和葡聚糖(Glucan) 3種不同病原相關分子(PAMPs)刺激后，血細胞中基因的響應規(guī)律，旨在了解基因在大竹蟶防御外源微生物的免疫應答中發(fā)揮的功能，為進一步闡釋無脊椎動物Integrin的結構和功能、豐富無脊椎動物先天性免疫學研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

野生大竹蟶捕取自山東省煙臺周邊海區(qū)，體長為90 mm左右，共210只，實驗前在20~22℃海水中暫養(yǎng)7 d。取其中10只大竹蟶用于解剖獲得組織，剩余的200只隨機均分為5組，用于PAMPs刺激實驗，LPS、PGN和Glucan等3種PAMPs分別用PBS(0.14 mol/L NaCl, 3 mmol/L KCl, 8 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4, pH=7.4)溶解，終濃度分別為0.5、0.8和1.0 mg/ml；以50 μl/只的劑量注射大竹蟶肌肉(Yang, 2011)。第1~3組分別注射LPS、PGN、Glucan，第4組注射PBS作為陰性對照，第5組未作任何處理作為空白對照。

1.2 RNA的提取和cDNA模板的合成

解剖大竹蟶，取肌肉、外套膜、血細胞、性腺、肝胰腺和鰓等，加入TRIzol (Invitrogen)，存于–80℃。

PAMPs注射后3、6、12、24和48 h分別從實驗組和對照組中隨機取5只大竹蟶，注射器吸取預冷的抗凝劑(0.1 mol/L葡萄糖，13 mmol/L檸檬酸，15 mmol/L檸檬酸鈉，0.45 mol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，pH=7.0)，抽取血淋巴，4℃ 800條件下離心5 min，收集血細胞，以1 ml TRIzol重懸，存于–80℃。

所有保存于TRIzol中的樣品，按照TRIzol試劑盒說明書提取RNA，經(jīng)DNase I (Promega)降解DNA，反應體系：RNA 8 μl, RQ1 RNase-Free DNase 5× Reaction Buffer 2.5 μl，RQ1 RNase-Free DNase 1 μl，RNase抑制劑0.6 μl，于37℃反應30 min；加入1 μl Stop solution，65℃ 10 min滅活DNase；加入2× Oligo dT 2.5 μ1，70℃反應5 min，冰浴2 min。反應體系：5×M-MLV反應緩沖液6.5 μl，RNase-Free dNTP 12.5 μl，RNase抑制劑1.25 μl，M-MLV反轉錄酶2.5 μl，RNase-Free 水1 μl，42℃反轉錄1 h，95℃ 5 min滅活反轉錄酶。模板存入–80℃，用于熒光定量PCR分析。

1.3 SgβInt基因cDNA全長的克隆

在本研究前期工作構建的大竹蟶cDNA文庫中，用BLAST分析獲得基因的EST序列，將對應質粒轉入Trans5α感受態(tài)細胞(全式金)中，挑取單菌落，以pBluescript II SK*載體的通用引物M13F和M13R對其進行重新測序。

1.4 SgβInt基因的序列分析

在http://www.expasy.org/進行蛋白等電點和分子量預測；用BLAST軟件進行序列同源性比較和相似性搜索；使用SingalP查找信號肽；使用MEGA 4.1軟件，將基因和家蠶()、通訊鰲蝦()、紫海膽()、雙臍螺()、凡納濱對蝦、中華絨螯蟹、果蠅、岡比亞按蚊、仿刺參、鴨嘴海豆芽()、小菜蛾()、豌豆蚜()、長牡蠣()、瓜實蠅()、地中海實蠅()、意大利蜂()、華支睪吸蟲()、粘蟲()和大乳頭水螅()等20個物種的-Integrin基因編碼的氨基酸序列以鄰接法(Neighbor- joining)構建系統(tǒng)進化樹；使用SWISS-MODEL預測基因編碼氨基酸序列的三級結構，利用pyMOL軟件展示。

1.5 熒光定量PCR檢測

將cDNA模板稀釋100倍，使用Mastercycler ep realplex(Eppendorf)熒光定量PCR儀進行PCR擴增。反應體系20 μl：2×SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)10 μl、稀釋100倍后的cDNA模板2 μl、正反引物各1 μl和6 μl水。的正向引物為5￠-AAGCGTGTCCGAGCAAATGTC-3￠，反向引物為5￠-TGTGGGGAGGGGTAGGATAAT-3￠；內參基因的正反向引物分別為5￠-TGTACGCCAACAC-TGTCCTGTC-3￠和5￠-CATCGTATTCCTGCTTGCT-GATC-3￠。反應程序：50℃ 2 min，95℃ 10 min；94℃ 30 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)。采用2-DDCt法分析實驗數(shù)據(jù)，以檢驗分析顯著性，<0.05為差異顯著，<0.01為差異極顯著。

1.6 SgβInt基因重組載體的構建

PCR反應擴增成熟肽DNA序列，反應體系：菌液模板1 μl，10×Buffer 2.5 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，正反引物各1 μl，酶1 μl，DEPC水補足至25 μl。重組正反引物分別為5￠-AACATGAGGTCCAT- GATAAACGG-3￠和5￠-TCATGTTGTAGTGTATGTC- TCACTGGTC-3￠。反應條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 80 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物0.5~4.0 μl；PEASY E1 Expression Vector(全式金) 1 μl，混合后室溫反應5 min，將連接產(chǎn)物加入Trans-T1(全式金)感受態(tài)細胞中，42℃水浴熱激60 s；加入LB液體培養(yǎng)基，涂布平板，培養(yǎng)過夜。挑選單菌落由北京諾賽基因組研究有限公司測序。

1.7 SgβInt基因重組蛋白的誘導表達

將測序結果正確的菌株使用EZNA mini plasmid (Omega)試劑盒按照步驟提取質粒轉入Transetta(全式金)感受態(tài)細胞中，涂布平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，加入含氨芐青霉素(AMP)的LB培養(yǎng)基中，200 r/min、37℃震蕩培養(yǎng)至OD600 nm約為0.6；加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導表達目的蛋白，37℃ 200 r/min誘導培養(yǎng)4 h；4℃、5000 r/min離心10 min，收集菌體沉淀。以12%的SDS-PAGE電泳分析誘導表達結果。

2 結果

2.1 SgβInt基因cDNA的克隆及序列特點

測序結果拼接獲得的基因cDNA全長，提交至GenBank獲得登錄號KX925404，其全長為1168 bp，5′和3′分別含61 bp和18 bp的非編碼區(qū)(UTR)，開放閱讀框(ORF)為1089 bp，共編碼362個氨基酸，其中，在42~74位氨基酸和103~135位氨基酸處分別為EGF like和EGF結構域。同源性分析顯示，與家山羊()和小鼠()的相似性最高，分別為37%和36%；利用SignalP軟件預測發(fā)現(xiàn)，基因編碼區(qū)前22位氨基酸序列為信號肽序列(圖1)。ExPASy預測重組后的基因編碼蛋白的理論等電點約為4.98，分子量大小為30.0 kDa。

2.2 SgβInt基因系統(tǒng)進化分析

使用MEGA 4.1軟件的鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，所用Integrin的GenBank登錄號如下：家蠶(NP_001161754.1)、通訊鰲蝦(CAA67357.1)、紫海膽(XP_011679515.1)、雙臍螺(AF060203.1)、凡納濱對蝦(ADK56123.1)、中華絨螯蟹(AKJ26284.1)、果蠅(AAC37169.1)、岡比亞按蚊(AAM11657)、仿刺參(AMR60824.1)、鴨嘴海豆芽(XM_013560388.1)、小菜蛾(GQ178290.1)、豌豆蚜(XM_003244399.3)、長牡蠣(EKC27174.1)、瓜實蠅(XP_011182368.1)、地中海實蠅(XP_004521716.1)、意大利蜂(XP_006564503.1)、華支睪吸蟲(GAA31131.2)、粘蟲(BAJ16205.1)、大乳頭水螅(XP_002159375.2)。

用MEGA 4.1軟件構建出編碼的氨基酸與20個物種的-Integrin基因編碼的氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹，結果顯示，編碼氨基酸與長牡蠣-Integrin編碼氨基酸的親緣關系最近，二者構成軟體動物分支(圖2)。

圖1 SgβInt基因的核苷酸及其編碼的氨基酸序列

黑體加粗表示起始密碼子和終止密碼子；下劃線表示信號肽；陰影部分表示Integrin結構域。

The start and stop codons are marked in bold, the signal peptide sequence is underline and the Integrin is shaded.

2.3 SgβInt編碼氨基酸的三級結構預測

使用SWISS-MODEL預測SgβInt中EGF-like、EGF和Integrin-β-tail三個結構域的三級結構，由圖3可以看出，編碼氨基酸的三維結構包括1個α-螺旋和9個β-折疊，α-螺旋靠近其中3個β-折疊，另外6個β-折疊每2個形成1組。

2.4 SgβInt基因的mRNA在健康大竹蟶各組織中的表達譜

運用熒光定量PCR方法檢測了基因在健康大竹蟶不同組織中的表達規(guī)律，基因在健康大竹蟶的各個組織中均有表達，在鰓中表達量最高，是性腺的487.5倍；在肌肉、外套膜、血細胞和肝胰腺的表達量分別為性腺表達量的105.7、28.3、21.0、14.9倍；在性腺中表達量最低(圖4)。

2.5 SgβInt基因的mRNA在大竹蟶受到PAMPs刺激后血細胞的表達規(guī)律

熒光定量PCR法檢測LPS、PGN和Glucan刺激后大竹蟶血細胞中基因的表達規(guī)律，結果顯示，基因的表達量在各種PAMPs刺激后均呈現(xiàn)上升趨勢，并且都在刺激后3 h表現(xiàn)出極顯著升高。其中，受到LPS刺激后，基因表達量在3 h達到最高(<0.01)，為空白對照的4.8倍，隨后逐漸降低，在12 h達到最低(<0.01)，為空白對照的0.4倍；PGN刺激使基因的表達量上調幅度最大，繼在刺激3 h時上升為空白組的10.8倍后(<0.01)，在6 h達到最高，是空白對照的35.3倍(<0.01)，隨后顯著降低；Glucan刺激也能誘導基因的表達量出現(xiàn)上調，在刺激3 h時為空白對照的3.2倍(<0.01)，隨后逐漸降低，但與LPS、PGN刺激后的表達模式不同的是，在24 h時再次出現(xiàn)顯著升高(<0.05)，并在48 h達到峰值，為空白對照的44.1倍(<0.01)(圖5)。

圖2 SgβInt與其他物種β-Integrin的系統(tǒng)進化樹

圖3 SgβInt蛋白的三級結構

藍色：β-折疊；紅色：α-螺旋
Blue: β-sheets; Red: α-helices

2.6 SgβInt基因在大腸桿菌中的重組表達分析

SDS-PAGE分析對比誘導前后的SgβInt蛋白重組菌株，誘導菌株的泳道明顯看到誘導蛋白的條帶，重組蛋白的分子量大小約為30 kDa，與預測的結果相一致，證明基因編碼蛋白被誘導表達(圖6)。

圖4 SgβInt mRNA在不同組織中的表達譜

3 討論

整合素是細胞膜上粘附因子的一種，屬于具有保守αβ異構體的細胞表面受體大家族(Hagen, 2001)。高等動物的整合素Integrin已被證明可作為人腸道弧菌病毒、腺病毒、手足口病毒、乳頭瘤病毒等多種病毒的受體。近幾年，陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，無脊椎動物整合素Integrin也參與多種免疫反應。而有關海洋無脊椎動物整合素Integrin的研究還相對較少。本研究以大竹蟶為研究對象，克隆得到了-Integrin基因的cDNA全長。通過Blast分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼蛋白與家山羊和小鼠等脊椎動物的-Integrin基因編碼蛋白相似，而分析基因編碼蛋白的序列特點發(fā)現(xiàn)，在以鄰接法構建的與其他物種-Integrin的系統(tǒng)進化樹中，與長牡蠣-Integrin構成了軟體動物分支；并且其三級結構包括1個α-螺旋和9個β-折疊，與孔雀魚()和紅鰭東方鲀()的-Integrin基因編碼蛋白三維結構相似。綜合以上分析結果，SgβInt為-Integrin家族成員。

圖5 血細胞中SgβIntmRNA在PAMPs刺激后的表達水平

圖6 重組SgβInt的SDS-PAGE分析

M: 蛋白質分子量標準；1: 未誘導的重組SgβInt；2: 誘導的重組SgβInt

M: Protein molecular standard; 1: Negative control for recombinant SgβInt (without induction); 2: IPTG induced recombinant SgβInt

仿刺參、長牡蠣、凡納濱對蝦等海洋無脊椎動物的Integrin基因具有組織分布廣泛的特點，與以上報道類似，本研究發(fā)現(xiàn)，在所有檢測組織中均有表達。組織表達譜廣與-Integrin在機體的生命活動中參與多種過程密切相關。但是，這些物種的-integrin基因的組織表達譜存在差異，尤其是它們呈現(xiàn)高表達量的組織部位不同，如仿刺參-integrin在肌肉中的表達量最高(Wang, 2016)，而長牡蠣和凡納濱對蝦-integrin則分別在性腺和血細胞中表達量最高(Lin, 2013; Jia, 2015)。在鰓的表達量最高，由于鰓是大竹蟶用于濾食和氣體交換的器官，與水環(huán)境直接接觸，考慮到水環(huán)境中存在多種外源微生物，基因在鰓中的高表達暗示其可能在大竹蟶抵御外源微生物的過程中發(fā)揮重要作用。

為分析是否參與大竹蟶抵御外源微生物的過程，本研究用LPS、PGN和Glucan等微生物多糖刺激大竹蟶，并檢測血細胞中mRNA的表達規(guī)律。微生物多糖LPS、PGN和Glucan是微生物表面某些共有的高度保守的分子結構，宿主細胞不能自主產(chǎn)生這些多糖，為微生物所特有，是微生物生存或致病必需的。LPS、PGN和Glucan刺激都能誘導在大竹蟶血細胞中的表達顯著上調，揭示參與大竹蟶抵御多種外源微生物的免疫過程。其中，PGN和Glucan刺激后，的表達量上調最為顯著，說明可能更容易被革蘭氏陽性菌和真菌誘導。中華絨螯蟹(Huang, 2015)和長牡蠣(Jia, 2015)的-Integrin在受到LPS刺激后6 h時達到最高表達量，而本研究中，一方面的表達量在3 h時達到最高，大竹蟶對于LPS的響應時間早于中華絨螯蟹和長牡蠣Integrin。另一方面，在大竹蟶受到PGN和Glucan刺激后達到最高表達量的時間不一致，其對于不同微生物多糖的響應時間不同，推測其清除作用機制存在差異。

重組的基因編碼蛋白是研究基因功能的有利工具。利用制備的重組蛋白，已有研究發(fā)現(xiàn)，中華絨螯蟹的-Integrin可以包括凝集金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、大腸桿菌在內的多種細菌，并能夠協(xié)助機體清除副溶血弧菌等致命菌(Huang, 2015)；而長牡蠣和仿刺參的-Integrin都對LPS有較高的親和力(Lin, 2013; Wang, 2016)；構建SgβInt編碼蛋白的重組載體，為獲得SgβInt重組蛋白，制備抗Integrin重組蛋白抗體，進一步分析SgβInt編碼蛋白的功能提供了必要的實驗材料。SgβInt編碼蛋白對于外源微生物的作用方式還不明確，有待于進一步研究。

本研究中基因的克隆、特性分析及其重組載體的構建，揭示了基因的序列特點及其對于PAMPs的響應規(guī)律，為了解大竹蟶對外源微生物的免疫防御機理和進一步分析其作用機制奠定了基礎。

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(編輯 馮小花)

Recombinant Expression and Characterization of the-Integrin Gene of

LIU Jiale1,2, WEI Xiumei3, YANG Dinglong3, TONG Tong1, LIU Xiangquan3①

(1. Guangxi Institute of Oceanology, Key Laboratory of Marine Biotechnology of Guangxi, Beihai 536000; 2. College of Fisheries and Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3. Key Laboratory of Marine Ecological restoration, Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006)

Integrins are heterodimeric cell surface receptors that consist of α and β subunits to regulate cell adhesion, migration, proliferation, apoptosis and phagocytosis. The present study identified the-integrin gene from() and analyzed the characterization of its encoded protein. The phylogenetic tree was constructed by the neighbor-joining method and the three-dimensional structure was predicted with SWISS-MODEL. The full-length cDNA ofwas 1168 bp, containing a 61 bp 5′UTR, 18 bp 3′UTR and an open reading frame (ORF) of 1089 bp that encodes a polypeptide of 362 amino acids with an estimated molecular mass of 30.0 kDa. The encoded protein ofshared significant similarities with that inand. The phylogenetic tree indicated thathad a close genetic relationship withto form a mollusk branch. The three-dimensional structure of SgβInt consisted of one α-helice and nine β-sheets as a member of integrin superfamily.expressed in all tested tissues, including mantle, gill, hemocyte, gonad, muscle and hepatopancreas, with the highest expression in gill which was 487.5 times higher than gonad.was induced by all the three pathogen associated molecular patterns (PAMPs) including LPS, PGN and glucan with the peak level at 3 and 48 h post LPS and glucan stimulation, respectively.expression reached the maximal level at 6 h post PGN stimulation with 53.5-fold induction. All the results revealed thatmight regulate the immune response ofto microorganism. This study shed new light on the research of-integrin in mollusk and immune defense mechanism of.

; Integrin; Immune response; Real-time PCR

LIU Xiangquan, E-mail: lxq6808@163.com

2016-12-26,

2017-01-14

S968.3

A

2095-9869(2018)01-0120-08

10.11758/yykxjz.20161226001

http://www.yykxjz.cn/

* 廣西海洋生物技術重點實驗室開放基金資助課題資助[This work was supported by Open Research Fund Program of Guangxi Key Laboratory of Marine Biotechnology (GLMBT-201504)]. 劉佳樂, E-mail: liujlwz@163.com

劉相全，副研究員，E-mail: lxq6808@163.com

劉佳樂, 韋秀梅, 楊頂瓏, 童潼, 劉相全. 大竹蟶整合素基因的特性分析和重組表達. 漁業(yè)科學進展, 2018, 39(1): 120–127

Liu JL, Wei XM, Yang DL, Tong T, Liu XQ. Recombinant expression and characterization of the-integrin gene of. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(1): 120–127