張 斌, 劉曉志, 周敬華, 魏敬雙, 高 健, 王志明*

1.華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司, 抗體藥物研制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 石家莊 050015; 2.河北省計(jì)劃生育科學(xué)研究院男科實(shí)驗(yàn)室, 石家莊 050000

蛋白質(zhì)糖化反應(yīng)是發(fā)生在蛋白質(zhì)氨基基團(tuán)上的一種非酶催化過(guò)程，主要發(fā)生在賴氨酸側(cè)鏈的α-氨基胺和ε-氨基胺末端，同還原型糖如葡萄糖、果糖和半乳糖等發(fā)生反應(yīng)。1912年，Maillard第一次對(duì)這種發(fā)生在氨基酸和還原糖之間的反應(yīng)進(jìn)行了描述。還原型糖的醛基可逆的聚集在胺基周圍，兩個(gè)基團(tuán)間形成一種不穩(wěn)定的希夫堿中間體，并自發(fā)多級(jí)Amadori重排反應(yīng)，形成更穩(wěn)定的氨基酮共價(jià)鍵。在一定條件下，氨基酮產(chǎn)物可以將結(jié)合的糖殘基解離。例如，高度糖化的抗體藥物在37℃、pH 7、沒(méi)有葡萄糖的磷酸鹽緩沖液中孵育100 h，總糖基化水平從42%下降到20%，這說(shuō)明糖化反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)。

正電荷的伯胺多分布在蛋白質(zhì)分子表面，但這些位點(diǎn)中只有一部分可以和還原糖分子發(fā)生特異反應(yīng)。研究顯示，沒(méi)有特定氨基酸序列與糖化反應(yīng)相關(guān)。但是，蛋白質(zhì)局部的三維結(jié)構(gòu)可以影響糖化反應(yīng)形成。某些蛋白質(zhì)(例如肝醇脫氫酶、RNase A、 DNaseⅠ、白蛋白、血紅蛋白)的組氨酸殘基或堿性氨基酸殘基(精氨酸和賴氨酸)可能和糖化反應(yīng)相關(guān)。重組人源化單克隆抗體同抗原結(jié)合片段的建模實(shí)驗(yàn)表明，在49位賴氨酸殘基處通常發(fā)生高水平的糖化反應(yīng)，49位賴氨酸殘基接近互補(bǔ)決定區(qū)2(CDR2)被輕鏈CDR1的一個(gè)天冬氨酸殘基進(jìn)行了催化。同樣位于其他重組人源化單克隆抗體重鏈99位的賴氨酸殘基優(yōu)先發(fā)生糖化，因?yàn)槭艿搅肃徑人岬拇呋?/p>

在高溫氧化條件下(包括體內(nèi)循環(huán))，含有Amadori的糖化蛋白可能被緩慢降解形成晚期糖化終產(chǎn)物(AGEs)。晚期糖化終產(chǎn)物包括羧甲基賴氨酸(CML)、戊糖、吡咯啉和咪唑啉酮。AGEs與某些病理反應(yīng)有關(guān)，如糖尿病、關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)淀粉樣變性以及衰老等。生理性的AGEs形成與氧化和炎癥過(guò)程相關(guān)，而與葡萄糖水平無(wú)關(guān)，這個(gè)過(guò)程可能持續(xù)幾個(gè)月或幾年。在體內(nèi)，晚期糖基化修飾的蛋白可誘發(fā)AGEs特異性受體的表達(dá)，觸發(fā)抗AGEs蛋白的免疫反應(yīng)，改變細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞功能。AGEs損壞蛋白具有高生物活性，如交聯(lián)、結(jié)構(gòu)改變以及高度的聚集，這些非正常的結(jié)構(gòu)蛋白可以對(duì)許多細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、視網(wǎng)膜和白細(xì)胞)產(chǎn)生毒副作用，并且和很多嚴(yán)重疾病相關(guān)[1]。許多研究表明糖化血紅蛋白水平升高與心血管疾病及動(dòng)脈粥樣硬化有著密切關(guān)系[2]。人體的血漿蛋白，如白蛋白、球蛋白、纖維蛋白和膠原蛋白也可能被糖化，進(jìn)而形成AGEs，AGEs參與了糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病過(guò)程，糖尿病并發(fā)癥包括視網(wǎng)膜病變、白內(nèi)障、神經(jīng)病變、腎病和心肌病等[3]。有研究認(rèn)為，高血糖可能在這些疾病的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，通過(guò)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)糖化，從而使蛋白質(zhì)功能喪失、聚集或沉積。在帕金森病患者的大腦中檢測(cè)到糖化的Lewy小體。在阿爾茨海默病患者中，β淀粉樣肽的糖化加劇了其毒性，加速了神經(jīng)退行性病變。另外，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病是多種神經(jīng)退行性疾病的危險(xiǎn)因素，包括帕金森病和阿爾茨海默病。因此，蛋白質(zhì)糖化成為神經(jīng)保護(hù)治療干預(yù)帕金森和阿爾茨海默氏病的一個(gè)新的戰(zhàn)略發(fā)展方向[4]。在治療性重組抗體藥物生產(chǎn)中，無(wú)論蛋白質(zhì)的糖化水平高低，都沒(méi)有觀察到AGEs的形成。

對(duì)于治療性抗體藥物，蛋白質(zhì)糖化可能對(duì)藥物產(chǎn)生潛在影響，如阻滯生物學(xué)功能或誘導(dǎo)聚集，因此，蛋白質(zhì)糖化是潛在的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)。因此需要進(jìn)行深入研究，以揭示抗體藥物糖化結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。本文綜述了抗體糖化相關(guān)的修飾反應(yīng)、抗體糖化檢測(cè)方法以及對(duì)于生物功能的潛在影響，以期為藥物的開發(fā)、優(yōu)化及貯存條件研究提供參考。

1 治療性抗體的糖化原因

由于治療抗體生產(chǎn)過(guò)程復(fù)雜，抗體藥物糖化反應(yīng)并不多見(jiàn)，其反應(yīng)動(dòng)力學(xué)以及糖化水平不易預(yù)測(cè)?？贵w藥物糖化反應(yīng)多發(fā)生在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液中的葡萄糖是工程細(xì)胞的重要能量來(lái)源。糖化水平和細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中總糖的含量相關(guān)。為了維持培養(yǎng)基生理?xiàng)l件，培養(yǎng)時(shí)需要對(duì)培養(yǎng)的溫度、pH、時(shí)間、離子強(qiáng)度等進(jìn)行調(diào)控，這可能對(duì)動(dòng)力學(xué)以及糖化程度產(chǎn)生影響。其中，己糖可以和氨基發(fā)生特異反應(yīng)影響蛋白質(zhì)糖化，進(jìn)而增加了抗體藥物的異質(zhì)性[5]。

藥物儲(chǔ)存過(guò)程中，制劑中的還原糖可能通過(guò)糖化反應(yīng)加入到抗體藥物中。甚至在冷凍干燥后的固體狀態(tài)藥物，制劑中的還原糖也可以和抗體藥物發(fā)生糖化反應(yīng)。制劑中酸度和溫度升高會(huì)加速蔗糖水解，產(chǎn)生還原性糖，進(jìn)而導(dǎo)致糖化反應(yīng)發(fā)生。糖化反應(yīng)的速度也取決于制劑中緩沖鹽成分和糖的類型。然而，在優(yōu)化的存儲(chǔ)條件下，藥物整體糖化水平很小甚至沒(méi)有。而有研究顯示，制劑溶液的儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間可能影響藥物的糖化水平，如4～5℃，1～21個(gè)月的制劑溶液穩(wěn)定性數(shù)據(jù)顯示，藥物糖化水平很低；相同制劑儲(chǔ)存溫度從29℃調(diào)整到37℃，1～21個(gè)月的數(shù)據(jù)顯示糖化水平顯著升高[6]。

抗體藥物上有一些潛在的糖化反應(yīng)位點(diǎn)，但其整體糖化水平通常很低，這給抗體藥物的糖化分析和鑒定帶來(lái)了諸多挑戰(zhàn)。為了研究糖化抗體的特性，有研究者利用在抗體易感位點(diǎn)進(jìn)行強(qiáng)制糖化反應(yīng)。在強(qiáng)制糖化反應(yīng)中，抗體藥物會(huì)和高濃度的還原糖(如葡萄糖或蔗糖)一起高溫孵育，高溫和低pH會(huì)誘使糖化反應(yīng)加速[7]。

抗體藥物在體內(nèi)循環(huán)的過(guò)程中也會(huì)發(fā)生糖化反應(yīng)。人體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中內(nèi)源性IgG的含量大約為10 mg/mL，健康人內(nèi)源性IgG測(cè)定糖基化水平之間的差別很大，每個(gè)IgG含有0.14～5個(gè)葡萄糖，對(duì)應(yīng)的整體糖化水平為14%～500%。治療性抗體藥物循環(huán)系統(tǒng)通常的含量為0.2 mg/mL，對(duì)應(yīng)的整體糖化水平為10%～25%。賴氨酸殘基的平均糖化水平接近治療性抗體，內(nèi)源性IgG或是人血白蛋白在循環(huán)系統(tǒng)中的濃度。在內(nèi)源性條件下，若IgG不包含高活性糖化位點(diǎn)，那么糖化反應(yīng)將擴(kuò)散到整個(gè)分子，在所有潛在糖基化位點(diǎn)進(jìn)行低水平的糖化反應(yīng)[8]。

2 抗體糖化的分析方法

2.1 硼酸親和色譜

硼酸親和色譜(boronate affinity chromatography, BAC)是一種分離和富集順式二醇化合物的技術(shù)。堿性pH條件下，固定相中硼酸官能團(tuán)會(huì)形成一個(gè)陰離子四面體，這個(gè)四面體可以和糖分子的順式陣列結(jié)構(gòu)相互作用，進(jìn)而分離含糖化合物。然后，可以使用降低pH或增加競(jìng)爭(zhēng)羥基(如山梨醇)的方法洗脫含糖化合物。由于該方法需要檢測(cè)樣品少，并可常溫檢測(cè)，因此BAC常用于抗體糖化的定性和定量檢測(cè)分析。使用BAC檢測(cè)治療性抗體藥物時(shí)，先洗脫下來(lái)的是非糖化峰，最后洗脫出的是糖化峰。為了防止抗體藥物同分析柱固相填料之間的非特異性結(jié)合，一般在流動(dòng)相中加入隔離試劑，如Tris等。對(duì)隔離試劑濃度、pH和緩沖鹽組分進(jìn)行優(yōu)化，確定原料藥中可以允許的糖化水平。利用BAC結(jié)合其他方法可以對(duì)收集分離組分的糖化成分進(jìn)行進(jìn)一步的研究[9,10]。雖然，BAC被廣泛的應(yīng)用于糖化成分的富集，但它有一定的局限性，因?yàn)槟承┨腔煞謺?huì)產(chǎn)生非特異性結(jié)合[11]。BAC的定量檢測(cè)也是估算，因?yàn)樗荒軐?duì)蛋白質(zhì)的單糖化和多糖化進(jìn)行區(qū)分。

2.2 基于電荷的方法

由于糖化位點(diǎn)正電荷的缺失，可以使用毛細(xì)管等電聚焦(capillary isoelectric focusing, cIEF) 或毛細(xì)管等電聚焦成像(imaged capillary electric focusing, icIEF)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。將酸性區(qū)域充分糖化，將保留硼酸組分同非糖化、非保留酸組分進(jìn)行比較。毛細(xì)管等電聚焦成像檢測(cè)糖化抗體的分辨率為0.05 pI單位，而理論上一個(gè)封閉的賴氨酸殘基的差異是0.09 pI單位。這些電荷差分離方法也可以在混合糖化中觀察到非糖化硼酸組分。

離子交換色譜法(IEC)也可以檢測(cè)糖化和非糖化蛋白表面的電荷差異。線性梯度洗脫時(shí)，糖化硼酸組分表現(xiàn)為相對(duì)主峰的一個(gè)特異性遷移。IEC洗脫的酸性變體在一定程度上被富集。Quan等[12]觀察到，與最初的普通抗體相比，完全糖化的硼酸抗體已遷移到酸性區(qū)域。這個(gè)遷移量相當(dāng)于線性梯度中0.5 mmol/L的氯化鈉。對(duì)于糖化硼保留片段的IEC峰也明顯變寬，而對(duì)于非片段起始物，非糖化硼保留片段(非糖化)IEC峰變窄。

總體而言，對(duì)于從起始物種分離糖化成分，IEC方法似乎沒(méi)有足夠的分辨率，因?yàn)檎麄€(gè)分子低水平糖化多個(gè)位點(diǎn)具有結(jié)合電荷效應(yīng)。相比之下，由于同樹脂獨(dú)特的相互作用，羧基末端上不結(jié)合，以及結(jié)合1個(gè)或是2個(gè)分子賴氨酸殘基，使用IEC方法可以將他們依次分離鑒定。

2.3 液相色譜-質(zhì)譜法

自頂向下質(zhì)譜常用于分析完整的或酶切抗體分析，也可以用于糖化水平分析。另外，基質(zhì)輔助激光解吸離子化技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization,MALDI)和電離噴霧(electrospray ionization,ESI)技術(shù)也可以用于糖化水平分析。由于每個(gè)糖化位點(diǎn)會(huì)增加162 Da的質(zhì)量位移，自頂向下質(zhì)譜常用于抗體糖化水平的快速評(píng)估。去糖化和C-末端賴氨酸后，用質(zhì)譜法測(cè)定糖化水平，方法的檢測(cè)限為1%，定量限為3%，這結(jié)果同BAC方法基本一致[13]。

自頂向下質(zhì)譜肽圖方法被用于糖基化位點(diǎn)的確定。由于賴氨酸殘基的糖化可以抑制胰蛋白酶的活性，胰蛋白酶活性被抑制并且增加162 Da的分子量，意味著這是一個(gè)糖化的賴氨酸位點(diǎn)。BAC截留片段或強(qiáng)制糖化樣品的胰蛋白酶肽譜，結(jié)果可以顯示整個(gè)抗體的易糖化位點(diǎn)[14]。

傳統(tǒng)質(zhì)譜方法存在的問(wèn)題是敏感性低，特別是當(dāng)用于檢測(cè)低豐度的糖化抗體藥物時(shí)。在檢測(cè)多肽時(shí)，問(wèn)題更加突出，因?yàn)樘腔磻?yīng)通常發(fā)生在多個(gè)賴氨酸殘基上。使用傳統(tǒng)質(zhì)譜-自頂向下質(zhì)譜肽圖方法的另一個(gè)問(wèn)題是，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)實(shí)驗(yàn)時(shí)，糖分子的碰撞誘導(dǎo)解離反應(yīng)致使中性水分子不同程度丟失，這對(duì)于低水平糖化位點(diǎn)的檢測(cè)帶來(lái)了更大的挑戰(zhàn)。另一種質(zhì)譜裂解方式是電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)。裂解方法比較的研究顯示，ETD方法提供完整的序列片段，沒(méi)有中性水分子丟失。這些需要更多的糖化分析實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)和驗(yàn)證。另外，減少硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉的使用，再使用胰蛋白酶進(jìn)行酶切，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)技術(shù)進(jìn)行肽圖分析，這樣可以更好的提高檢測(cè)的靈敏度并減少糖肽的中性丟失。在這種方法中，由于糖化糖減少，碳水化合物和肽之間的化合鍵穩(wěn)定，可以達(dá)到串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS/MS)串聯(lián)是研究AGEs的常用方法。通過(guò)肽圖對(duì)潛在糖化位點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)而檢測(cè)AGEs水平[15,16]。一些主要的AGEs(如CML 和CEL)可以通過(guò)，修飾肽和所有電荷狀態(tài)的野生型肽的肽圖面積比進(jìn)行定量。由于AGEs的種類很多，每一種AGEs都需要進(jìn)行單獨(dú)定量。除賴氨酸外，精氨酸殘基也是抗體藥物發(fā)生修飾的潛在位點(diǎn)[17]。對(duì)α-晶狀體球蛋白進(jìn)行水解，并利用LC-MS對(duì)蛋白糖化分布進(jìn)行分析，結(jié)果顯示體外與體內(nèi)的糖化蛋白中賴氨酸殘基的糖化修飾不同[18]。

同位素標(biāo)記也被應(yīng)用于抗體糖基化分析。有研究者使用抗體藥物同12C/13C6還原糖進(jìn)行1∶1混合，37 ℃孵育進(jìn)行強(qiáng)制糖化反應(yīng)。胰蛋白酶對(duì)糖化的樣品和對(duì)照品進(jìn)行消化，利用LC-MS/MS對(duì)樣品進(jìn)行糖化分析。通過(guò)給予具有強(qiáng)度相當(dāng)(相差6.018 Da)的兩分子離子一個(gè)特異標(biāo)記，將LC/MS分析胰蛋白酶消化糖肽洗脫產(chǎn)物的方法進(jìn)行了簡(jiǎn)化。對(duì)強(qiáng)化糖化樣品中所有糖化位點(diǎn)進(jìn)行分析，天然樣品中檢測(cè)糖化肽的分析是簡(jiǎn)化的。這種方法能夠識(shí)別特異性糖化位點(diǎn)，不僅檢測(cè)速度快，還提高了檢測(cè)靈敏度，糖化水平在0.5%以下也能夠被檢測(cè)[19]。

另一種同位素標(biāo)記方法包括硼氫化鈉還原步驟。在該方法中，樣品被分為A和B兩等份，分別使用硼氫化鈉和硼氘化鈉進(jìn)行還原，再進(jìn)行胰蛋白酶消化，這導(dǎo)致在糖化肽上分別有2 Da或3 Da分子量的增加。利用LC-MS/MS對(duì)1∶1混合的A和B的樣品進(jìn)行分析， 1 Da的分子量差異被用于確認(rèn)糖化的多肽并計(jì)算糖化的相對(duì)含量。這些結(jié)果表明，當(dāng)同位素穩(wěn)定分布并考慮峰重疊時(shí)，1 Da的分子量差異足以進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2.4 比色法

抗體糖化形成的氨基酮可以用硝基四氮唑藍(lán)(NBT)還原法進(jìn)行定量檢測(cè)。1983年，Johnson等[20]首次對(duì)檢測(cè)蛋白糖化的NBT還原法進(jìn)行了介紹，糖化蛋白的氨基酮組分被NBT還原，從而導(dǎo)致525 nm處吸光值改變。該方法已用于多賴氨酸和糖化白蛋白的檢測(cè)。2012年，Ahmad等[21]把該方法應(yīng)用于糖化抗體的檢測(cè)。最近，Butko等[22]報(bào)道了在重組抗體生產(chǎn)中產(chǎn)生的一些AGEs，同抗體溶液的顏色變化密切相關(guān)。另外，利用靶向特異AGEs的生物素標(biāo)記抗體，設(shè)計(jì)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法也可用于AGEs檢測(cè)。

3 對(duì)抗體藥物生物學(xué)功能的影響

研究糖化修飾對(duì)單克隆抗體功能影響的報(bào)道結(jié)果差異巨大，這可能與糖化的數(shù)量和位置有關(guān)。在一些糖化位點(diǎn)上，強(qiáng)制條件下(總糖化95.4%)或抗體生產(chǎn)細(xì)胞生理?xiàng)l件下(糖化10%～40%)發(fā)生糖化反應(yīng)。有研究證實(shí)，高糖化水平與高糖溶液下的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、高溫儲(chǔ)存以及存放時(shí)間等條件有關(guān)。在正常的細(xì)胞培養(yǎng)條件(如溫度和pH)下，提高葡萄糖濃度，生產(chǎn)得到的抗體的糖化位點(diǎn)與內(nèi)源性抗體相似。雖然單克隆抗體糖化通常不會(huì)對(duì)抗體結(jié)合活性產(chǎn)生較大影響，但也可能造成一些抗體活性的喪失?？贵wAGEs對(duì)活性的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，但是AGEs可能降低了干擾素a-1的治療效果。強(qiáng)制糖化抗體的FcRn結(jié)合活性研究及小鼠體內(nèi)模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，一定程度的糖化水平對(duì)抗體動(dòng)力學(xué)不產(chǎn)生影響[23]。另外，糖化的核糖核酸酶A無(wú)法同核糖核酸酶抑制劑(RI)和DNA結(jié)合。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，這種糖化蛋白不能參與DNA的解鏈過(guò)程[24]。

在免疫原性和安全性方面，典型治療性單克隆抗體和內(nèi)源性抗體的恒定區(qū)域通常非常相似，所以單克隆抗體的恒定區(qū)域的糖化被認(rèn)為同內(nèi)源性單克隆抗體類似，因此關(guān)注較少。據(jù)推測(cè)，在抗體恒定區(qū)域的賴氨酸殘基已經(jīng)進(jìn)化為抗糖化形式。關(guān)于治療性抗體糖化的一個(gè)擔(dān)憂是免疫原性問(wèn)題，尤其是AGEs，AGEs具有較正常抗體更高的免疫原性[21]。

由于炎癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中發(fā)現(xiàn)了AGEs的存在。AGEs破壞性抗體能夠觸發(fā)RA患者免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗IgG自身抗體。AGEs破壞性抗體是一個(gè)有效免疫原，可以觸發(fā)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者抗原驅(qū)動(dòng)的自身抗體產(chǎn)生[2,25]。然而，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化，在抗體藥物中AGEs含量非常低或沒(méi)有[22]。

抗體聚體對(duì)于免疫原性和安全性是一個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性。關(guān)于糖化水平和聚集相關(guān)性，各報(bào)道結(jié)論不一，有研究顯示二者相關(guān)，另有研究將糖化抗體同對(duì)照抗體40℃存放1周，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)聚體水平差異。對(duì)于AGEs，有研究顯示AGEs和治療性抗體降解和交聯(lián)有關(guān)[26]。

4 展望

糖化是一種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾反應(yīng)，常發(fā)生在治療蛋白(如，抗體)的生產(chǎn)和儲(chǔ)存過(guò)程中。BAC和LC-MS是目前分析抗體整體糖化水平的標(biāo)準(zhǔn)方法。由于個(gè)別位點(diǎn)的糖化水平很低，因此使用強(qiáng)制糖化方式識(shí)別糖化位點(diǎn)。糖化修飾位置影響蛋白的生物活性，并且是抗體特異性的。研究顯示，抗體糖化對(duì)Fc結(jié)合或PK沒(méi)有造成顯著影響[27,28]。為了降低糖化和AGEs形成風(fēng)險(xiǎn)，確保治療藥物的安全性和有效性，應(yīng)該開發(fā)和優(yōu)化相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)、制劑和貯存條件。

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