戈文舜，任麗芳，李美平，魯　波，張　鵬，蔡紅光，楊惠英，包　磊

(浙江省紹興市婦幼保健院病理科，浙江 紹興 312000)

宮頸癌作為發(fā)病率第二的婦科惡性腫瘤，與高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavir-uses，HPV)持續(xù)感染相關(guān)，隨著宮頸癌篩查的廣泛開展，很多宮頸癌前病變的早發(fā)現(xiàn)早治療，大大降低宮頸癌的發(fā)病和死亡率。因此，對宮頸癌前病變的準確診斷及分級對于臨床下一步治療至關(guān)重要。2014年，第4版世界衛(wèi)生組織(World Health Organiza￣tion，WHO)女性生殖系統(tǒng)腫瘤[1]分類用低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesions， LSIL)和高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)替代第3版WHO乳腺及女性生殖器官腫瘤病理學及遺傳學中宮頸上皮內(nèi)瘤變的三級分類法(CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ)。對于宮頸LSIL，臨床醫(yī)師普遍采取定期復查、密切隨訪等處理措施，而HSIL則行宮頸環(huán)形電切術(shù)(loop electrosurgical excision procedure，LEEP)進行治療。但在日常工作中，病理診斷會經(jīng)常碰到鏡下病變介于HSIL與LSIL之間(CINⅠ～Ⅱ)的情況，所以如何明確這種情況下的病變等級就成了首要解決的問題。近年來大量文獻報道， p16INK4a和ki67在HSIL中陽性表達且陽性程度隨病變的加重而升高。因此，本研究通過對CINⅠ～Ⅱ標本進行免疫組化p16INK4a和ki67檢測，分析其表達情況與宮頸病變等級的關(guān)系及在病理診斷中的作用與意義。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2012年1月至2015年12月在紹興市婦幼保健院門診行陰道鏡檢查，活檢病理診斷為CINⅠ～Ⅱ同時行免疫組化p16INK4a和ki67檢測，后續(xù)治療均行LEEP病例53例?；颊吣挲g為26～56歲，平均39歲。組織學切片由3位高年資病理醫(yī)生復閱全部病理切片，至少2位醫(yī)師意見一致則確定為最后診斷。診斷標準參照2014年WHO女性生殖系統(tǒng)腫瘤病理學和遺傳學分類標準。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學染色

標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，2～3μm厚石蠟切片，常規(guī)脫水、石蠟包埋切片。一抗p16(6H12)試劑、ki67(MIB-1)試劑、Envision試劑盒均購自Dako。免疫組化操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.2免疫組織化學陽性標準

p16INK4a：病變層細胞核與/或胞漿連續(xù)強陽性表達標記為(++)；基底與/或副基底層細胞不連續(xù)或連續(xù)弱或至中等強度表達(+)；完全不表達標記為(-)。ki67：陽性信號位于胞核，以陽性細胞百分比數(shù)來體現(xiàn)細胞增殖指數(shù)。其表達程度借鑒組織學診斷標準(上皮下1/3為界)以30%為界限區(qū)分HSIL、LSIL(+，>30%；+，≤30%)。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行χ2檢驗和χ2分割法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 CINⅠ～Ⅱ顯微鏡下組織學表現(xiàn)

本組資料中陰道鏡活檢病理診斷CINⅠ～Ⅱ的病例53例，其組織學表現(xiàn)，如下：①鱗狀上皮基底及副基底層細胞輕度-中度異型增生，增殖細胞一般不超過上皮下1/3層，上皮上1/2層或上2/3層往往存在HPV感染表現(xiàn)(挖空細胞)，細胞核大小不等、染色質(zhì)細顆粒狀、均勻分布、輕度深染、界限清楚，見圖1A、D、G；②少數(shù)病例為不典型鱗化和萎縮(鱗化、萎縮基礎(chǔ)上基底及副基底細胞存在異型增生)，細胞層次一般10～15層，細胞異型程度同①,少許細胞核大、深染、核漿比較高,核膜規(guī)則。上皮薄、層次少，病變程度較難確定，見圖1D；③個別病例因包埋切面的關(guān)系造成上皮腳較深長或者累腺處病變較重(上皮層總體病變?yōu)長SIL)，細胞異型程度同①，見圖1。

2.2 CINⅠ～Ⅱ后續(xù)LEEP術(shù)結(jié)果

53例CINⅠ～Ⅱ患者后續(xù)LEEP術(shù)結(jié)果：LSIL 22例(41.51%，22/53)、HSIL 31例(58.49%，31/53，包含1例早期浸潤性鱗狀細胞癌)，見表1。

2.3 p16INK4a及其聯(lián)合ki67檢測的統(tǒng)計學意義

53例p16INK4a蛋白檢測者，36例(67.92%，36/53)(++)，見圖1H和17例(32.08%，17/53)(+)，見圖1B、F；p16INK4a(++)聯(lián)合ki67檢測者，23例ki67(+，>30%)(63.89%，23/36)見圖1C、I和13例ki67(+，≤30%)(36.11%，13/36)(見圖1F)；兩者陽性表達情況與宮頸病變分級明顯相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。單純行ki67或聯(lián)合p16INK4a(+)者，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.4 p16INK4a聯(lián)合ki67檢測預測HSIL的價值

p16INK4a(++)聯(lián)合ki67(+，>30%)檢測和單純行p16INK4a檢測在CINⅠ～Ⅱ中預測HSIL的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別為76.00%(19/25)和80.65%(25/31)、63.64%(7/11)和50.00%(11/22)、82.61%(19/23)和69.44%(25/36)、53.85%(7/13)和64.71%(11/17)。

注：A、D、G為陰道鏡活檢組織學診斷CINⅠ～Ⅱ，其中圖A累腺處病變程度較重 ；圖D上皮層次較少、薄；A、G上皮上1/2或2/3存在明顯的HPV感染；G在LEEP中上皮上1/2存在分化現(xiàn)象 (后續(xù)LEEP結(jié)果分別為LSIL、LSIL、HSIL伴早期浸潤性鱗狀細胞癌);HE 中倍放大；B、E、H分別為A、D、G的p16INK4a結(jié)果(+、+、++)，中倍放大；C、F、I分別為A、D、G的ki67結(jié)果(>30%、≤30%、>30%)，中倍放大。

圖1CINⅠ～Ⅱ及其相應p16INK4a和ki67在顯微鏡下的表達

Fig.1Expressions of CIN Ⅰ-Ⅱ and its corresponding p16INK4a and ki67 under microscope

表1p16INK4a聯(lián)合ki67檢測與后續(xù)LEEP術(shù)病理診斷結(jié)果對照表[n(%)]

Table 1 Comparison of results of p16INK4acombined with ki67 detection and follow-up LEEP pathological diagnosis[n(%)]

檢測項目　LEEP術(shù)病理診斷結(jié)果　HSIL(n=31)LSIL(n=22)χ2Pp16INK4a5．5470．019　(++)25(47．18)11(20．75)　(+)6(11．32)11(20．75)ki673．5010．061　(+，≤30%)9(16．99)12(22．64)　(+，>30%)22(41．51)10(18．86)p16INK4a(++)5．2020．023　ki67(+，≤30%)6(16．67)7(19．44)　ki67(+，>30%)19(52．78)4(11．11)p16INK4a(+)0．0320．858　ki67(+，≤30%)3(17．65)5(29．41)　ki67(+，>30%)3(17．65)6(35．29)

3討論

3.1 p16INK4a與ki67在CINI～Ⅱ中差異性表達的機制及統(tǒng)計學意義

p16INK4a是細胞周期蛋白依賴性激酶CDK的抑制因子，負調(diào)控細胞周期，特別是在高危型HPV感染的HSIL和子宮頸癌組織中常?？蓹z測到強陽性表達，原因是HPV E6、E7蛋白在子宮頸細胞內(nèi)表達，競爭性抑制細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)與視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(Rb)的結(jié)合，使Rb失活，激活轉(zhuǎn)錄因子E2F，造成p16INK4a蛋白過表達[2]。ki67是一種細胞增殖活性相關(guān)抗體，其陽性比例反映出細胞增殖指數(shù)。大量研究顯示，p16INK4a及Ki67的陽性程度隨CIN級別提升而增加，可以很好地輔助病理診斷[2-6]。但在宮頸病變細胞中p16INK4a陽性判讀標準，查閱大量文獻，各有不同。本實驗通過觀察p16INK4a蛋白和ki67在CINⅠ～Ⅱ中表達的差異性，對比后續(xù)LEEP結(jié)果(LSIL 、HSIL)尋找其陽性規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p16INK4a(++)和(+)，兩者在病變分級中存在差異性，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。有關(guān)ki67的表達程度借鑒組織學診斷標準(上皮下1/3為界)以30%為界限區(qū)分HSIL與LSIL，雖然在CINⅠ～Ⅱ的基礎(chǔ)病變中ki67增殖指數(shù)主要集中在30%左右,但是其中LEEP結(jié)果為LSIL(特別是濕疣)的病例ki67(+，>30%)所占的比重不低(45.45%，10/22)，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但是在p16INK4a(++)的基礎(chǔ)上結(jié)合ki67檢測，ki67(+，>30%)與(≤30%)之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而且p16INK4a(++)結(jié)合ki67(+，>30%)對比單純p16INK4a(++)，就預測HSIL而言，敏感性及陰性預測值相差不大，特異性和陽性預測值卻有顯著提高。

3.2 p16INK4a結(jié)合ki67在CINⅠ～Ⅱ中差異性表達的診斷意義及預測價值

CINⅠ～Ⅱ患者，本身存在基底及副基底層細胞異型增生的基礎(chǔ)病變，這部分病變層細胞如果表達p16INK4a(++)及ki67(+,>30%)，那么其后續(xù)為HSIL的可能性大大增加，這也符合p16INK4a及ki67的陽性率隨病變級別提升而增加的特點。然而，有學者認為超過30歲的LSIL患者進展的風險更高，其預后與p16INK4a過表達無關(guān)，而是年齡[7]；也有學者認為p16INK4a在CINⅠ患者中陽性表達存在一定預測價值，應進行重點隨訪[8]。

p16INK4a在LSIL中確實存在陽性表達，在CINⅠ～Ⅱ中,特別是p16INK4a(+)，類似乳腺癌CerbB-2在癌組織中表達1+或2+的陽性狀態(tài)，其表達意義和預后情況是否與p16INK4a(-)一致，今后需要進一步大樣本分析?，F(xiàn)階段本實驗結(jié)論：p16INK4a可以作為早期宮頸病變預后的預測因子，在CINⅠ～Ⅱ患者中，若p16INK4a(++)及ki67(+,>30%)則可作為HSIL的輔助診斷。

總之，對不典型鱗化、萎縮及包埋切片造成假象的或者診斷意見不統(tǒng)一等有疑問的CINⅠ～Ⅱ活檢標本可以進行p16INK4a及ki67染色，以提高病理診斷的準確性和可重復性。p16INK4a蛋白病變層細胞核與/或胞漿連續(xù)強陽性表達是LSIL發(fā)展為HSIL的重要信號，聯(lián)合ki67(>30%)檢測可用于分流CINⅠ～Ⅱ，對這類患者臨床應根據(jù)其實際情況選擇密切隨訪或及時治療。

[參考文獻]

[1]沈丹華,陳定寶. 解讀第4版WHO女性生殖器官腫瘤分類中的變化[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2014,49(9):717-720.

[2]Yang Q C,Zhu Y,Liu H B,etal.A cocktail of MCM2 and TOP2A, p16INK4aand ki-67 as biomarkers for the improved diagnosis of cervical intraepithelial lesion[J].Pol J Pathol,2013,64(1):21-27.

[3]Zhong P P,Li J F,Gu Y Q,etal.p16 and ki-67 expression improves the diagnostic accuracy of cervical lesions but not predict persistent high risk human papillomavirus infection with CIN1[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(3):2979-2986.

[4]張燕,王一,王建華,等. p16、ki-67 在440 例宮頸病變中的表達及其病理診斷價值[J].診斷病理學雜志,2013,20(3):171-175.

[5]魯波,包磊,李美平,等.HC2聯(lián)合細胞塊P16技術(shù)在液基細胞診斷中的應用[J].中國婦幼健康研究,2017,28(8):1020-1021.

[6]包磊,蔡紅光,楊惠英,等.p16INK4a蛋白檢測在宮頸癌及CIN篩查中的作用[J].中國婦產(chǎn)科臨床雜志,2008,9(5):386-387,插3.

[7]Quint K D,de Koning M N,Quint W G,etal.Progression of cervical low grade squamous intraepithelial lesions: in search of prognostic biomarkers[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2013,170(2):501-506.

[8]王榮敏,李雪潔,錢敏,等.CINⅠ的轉(zhuǎn)歸及p16INK4a蛋白表達在分流CINⅠ中的臨床意義[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2015,50(3):210-215.