張澤松， 王祥珍，馬娜娜， 廖海彬

(1.深圳市南山區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518052；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453100； 3.深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518106)

宮腔粘連(intrauterine adhesions, IUAs) 又稱Asherman 綜合征，是指由于各種因素所致宮腔或頸管基底層內(nèi)膜損傷后，宮腔肌壁和(或) 頸管的相互粘連[1]，感染、手術(shù)等任何引起子宮內(nèi)膜破壞的因素都可引起IUAs[2]。最新研究顯示，IUAs發(fā)病率約19.1%[3]，IUAs患者可出現(xiàn)月經(jīng)量減少、繼發(fā)閉經(jīng)、腹痛、習(xí)慣性流產(chǎn)、胎盤植入甚至不孕等臨床問題，嚴(yán)重影響育齡婦女的生殖健康[4-5]。熱休克蛋白47(heat shock protein 47，HSP47)是一類小分子多肽蛋白，為機體受到外界不良因素侵犯時產(chǎn)生的一種保護性應(yīng)激蛋白，普遍存在于自然界的原核和真核細胞中。宮腔粘連為宮腔損傷后的繼發(fā)疾病，可能與宮腔內(nèi)HSP47的激活和過度表達密切相關(guān)。HSP47與宮腔粘連的關(guān)系以及粘連宮腔對生育力的影響目前研究不多。本試驗通過研究宮腔粘連動物模型子宮內(nèi)膜HSP47和HSP47mRNA的變化，探討HSP47在宮腔粘連中的作用及宮腔粘連對生育能力的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器

兔抗HSP47單克隆抗體，SP 試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色劑，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的兔二抗(北京中杉金橋有限公司)，水合氯醛(國藥集團，批號20121026)，苯酚(廣州金華大化學(xué)試劑有限公司，批號 20130110)，阿拉伯樹膠(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號 201000710)，Masson染色試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(日本TAKARA公司)，LEICA 顯微鏡(德國)。

1.2實驗動物與宮腔粘連模型建立

廣東醫(yī)學(xué)院動物中心提供健康性成熟S-D大鼠90只，其中雄性大鼠30只，雌性大鼠 60 只，體重 180～200g，常規(guī)喂養(yǎng)2周。雌性大鼠隨機分為造模組30只，假手術(shù)組 15只，正常組15只。將造模組雌性大鼠麻醉后，于下腹部正中和尿道上端約1.00cm處切開皮膚，暴露子宮，用4號針頭于子宮分叉處向左卵巢方向緩慢注入25%苯酚膠漿0.04mL(液化苯酚5mL，阿拉伯樹膠1g，甘油4mL，加蒸餾水至20mL，配成25%的苯酚膠漿)。將假手術(shù)組雌性大鼠開腹后，向右側(cè)子宮注入0.04mL生理鹽水。正常組雌性大鼠不做任何處理。術(shù)后10天，隨機選取造模組15只，假手術(shù)組及正常組各7只處死，取出各組大鼠的子宮，肉眼觀察其宮腔改變，蘇木精-伊紅(hematoxylin-Eosin, HE)染色觀察病理變化，免疫組化染色檢測大鼠子宮內(nèi)膜HSP47的表達，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測HSP47 mRNA的表達?？梢娫炷＝M子宮凹凸不平，部分遠端積水，石蠟包埋切片見宮腔狹窄、變形、宮腔消失、纖維組織增生,見圖1。余下的雌性大鼠，隨機將造模組、假手術(shù)組和正常組與雄性大鼠一對一合籠飼養(yǎng)，次晨行雌鼠陰道細胞涂片，以涂片發(fā)現(xiàn)精子當(dāng)日為妊娠第1 天(D1)，妊娠第10天(D10)開腹，計數(shù)雙側(cè)宮腔的妊娠胚胎數(shù)目作為生育力評價指標(biāo)。

注：A為正常子宮；B為假手術(shù)子宮；C為宮腔粘連子宮。

圖1造模后子宮大體觀察

Fig.1Overall observation on various uterus after modeling

1.3 HSP47免疫組化檢測

分別取三組大鼠子宮內(nèi)膜組織，制備3μm組織切片進行HE染色和Masson染色。切片脫蠟處理，將切片用0.01mol枸櫞酸鹽緩沖液修復(fù)，PBS沖洗，羊血清封閉，滴加兔抗HSP47(1:100)4°C過夜，PBS沖洗，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對照組用同種血清代替一抗，空白對照組用PBS代替一抗，細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，著色高于背景底色為陽性，細胞漿內(nèi)不著色或呈淺棕色為陰性。400倍顯微鏡下隨機取5個不同視野進行免疫組化評分。

1.4 HSP47 Real Time PCR檢測

取液氮中凍存的大鼠子宮內(nèi)膜組織，按TAKARA公司mRNA試劑盒說明書提取組織總RNA。根據(jù)TAKARA RT-PCR試劑盒說明進行cDNA的合成和PCR的擴增，逆轉(zhuǎn)錄的量不超過1μg，反應(yīng)結(jié)束后統(tǒng)計CT值，根據(jù)熒光定量PCR的計算公式計算其相對表達量。

1.5雙側(cè)宮腔的妊娠胚胎計數(shù)

正常妊娠組胚胎孕囊成串珠狀排列于子宮，單側(cè)孕囊5～8個不等，造模組造模側(cè)子宮無妊娠囊，其正常自身對照側(cè)妊娠囊數(shù)目未見明顯差別，見圖2。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計處理軟件。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

注：A為正常對照組；B為假手術(shù)組；C為造模組 IUA。

圖2宮腔粘連對生育力的影響

Fig.2 Influence of IUA on fertility

2結(jié)果

2.1各組子宮內(nèi)膜組織HE染色和Masson染色情況

造模術(shù)后第 10 天，造模側(cè)HE染色可見子宮腔狹窄，幾近閉塞，子宮內(nèi)膜上皮消失。Masson染色可見間質(zhì)內(nèi)膠原纖維增多，排列紊亂，證實造模成功。宮腔粘連組右側(cè)子宮作為自身對照，大體形態(tài)、病理學(xué)表現(xiàn)與正常組基本無異，見圖3、圖4、圖5。

注：A為HE染色(40×)；B為HE染色(400×)；C為Masson染色(40×)；D為Masson染色(400×)。

圖3正常和宮腔粘連子宮組織在HE和Masson染色后不同放大倍數(shù)組織學(xué)觀察

Fig.3 Histological observation on normal uterus and IUA uterus tissues under different magnification times after HE and Masson staining

注(A：正常對照組，G造模后 J未造模 B：假手術(shù)組 H造模后 K未造模 C：宮腔粘連組 I造模后 L未造模)

圖4HE染色(400×)后各組組織觀察與對比

Fig.4Histological observation and comparison after HE staining (400×)

注：(A：正常對照組，G造模后 J未造模 B：假手術(shù)組 H造模后 K未造模 C：宮腔粘連組 I造模后 L未造模)

圖5Masson染色(400×)后各組組織觀察與對比

Fig.5 Histological observation and comparison after Masson staining (400×)

2.2子宮內(nèi)膜HSP47的表達

HSP47陽性為黃棕色顆粒，定位于胞核，少數(shù)定位于細胞漿。免疫組化陽性細胞比例評分標(biāo)準(zhǔn)：I級0分，≤10%；Ⅱ級1分，11%～25%；Ⅲ級2分，25%～50%；Ⅳ級3分，> 50%。染色強度評分標(biāo)準(zhǔn)：無染色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；深棕色為3分。免疫組化結(jié)果根據(jù)染色陽性細胞數(shù)和染色強度分別評分，兩者乘積0～1分為陰性(-)；2～4分為弱陽性(+)；5～6分為陽性(++)；6分以上為強陽性(+++)。其中(-)和(+)記為低表達，(++)和(+++)記為高表達。左側(cè)子宮HSP47的表達，宮腔粘連組最高，與假手術(shù)組和正常組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.07，P<0.05)，宮腔粘連組的高表達陽性率為80.00%，正常組和假手術(shù)組的高表達陽性率均為14.29%。假手術(shù)組和正常組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.19，P>0.05)，正常組和假手術(shù)組的高表達陽性率均為14.29%。右側(cè)子宮HSP47的表達，宮腔粘連組高于假手術(shù)組和正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.14，P=<0.05)，宮腔粘連組的高表達陽性率為66.67%，正常組和假手術(shù)組的高表達陽性率均為14.29%。假手術(shù)組正常組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.00，P>0.05)，正常組和假手術(shù)組的高表達陽性率均為14.29%。宮腔粘連組左、右側(cè)子宮HSP47的表達均增高，二者相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.00，P>0.05)，左側(cè)子宮高表達陽性率為80%，右側(cè)子宮高表達陽性率為66.67%，見表1，表2。

表1HSP47在實驗各組對照側(cè)和造模側(cè)子宮內(nèi)膜的表達(n)

Table 1HSP47 expression in endometrium at control side and modeling side uterus among groups(n)

組別例數(shù)　　　HSP47的表達　　　-++++++高表達陽性率(++～+++)(%)對照側(cè)　a7331014．29　b7331014．29　c15236466．67造模側(cè)　A7331014．29　B7420114．29　C15126680．00

注：A(a)為正常組；B(b)為假手術(shù)組；C(c)為造模組。

表2HSP47在實驗各組子宮內(nèi)膜的相對表達量(χ±S)

Table 2Relative expression of HSP47 in endometrium in each group(χ±S)

組別例數(shù)(n)右側(cè)表達量左側(cè)表達量正常組71．08±0．501．06±0．28假手術(shù)組71．42±0．19#1．23±0．57#宮腔粘連組156．59±1．38?6．29±1．09?@

注：*為宮腔粘連組和假手術(shù)組、正常組相比P<0.05；#為正常組和假手術(shù)組相比P>0.05；@造模組左側(cè)和右側(cè)相比P>0.05。

2.3子宮內(nèi)膜HSP47 mRNA的表達

左側(cè)子宮HSP47 mRNA的表達，宮腔粘連組最高，與假手術(shù)組和正常組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.04<0.05)，造模側(cè)宮腔粘連組HSP47 mRNA子宮內(nèi)膜的表達2-△△Ct值(χ±S)為(21.206±2.994)，正常組和假手術(shù)組的值分別為(0.992±0.199)和(1.678±0.645)。假手術(shù)組和正常組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.35，P>0.05)，正常組和假手術(shù)組的值分別為(0.992±0.199)和(1.678±0.645)。右側(cè)子宮HSP47 mRNA的表達，宮腔粘連組高于假手術(shù)組和正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.14，P<0.05)，對照側(cè)宮腔粘連組HSP47 mRNA子宮內(nèi)膜的表達2-△△Ct值(χ±S)為(18.371±3.594)，正常組和假手術(shù)組的值分別為(0.989±0.215)和(2.057±1.074)。假手術(shù)組正常組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.35，P>0.05)，正常組和假手術(shù)組的值分別為(0.989±0.215)和(2.057±1.074)。宮腔粘連組左、右側(cè)子宮HSP47 mRNA的表達均增高，二者相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.35，P>0.05)，HSP47 mRNA在左側(cè)子宮組織的相對表達量(χ±S)為(6.70±1.70)，在右側(cè)子宮組織的相對表達量(χ±S)為(6.59±1.38)，見表3、表4。

表3HSP47 mRNA在實驗各組子宮內(nèi)膜的表達(χ±S)

Table 3Expression of HSP47 mRNA in endometrium in each group(χ±S)

組別例數(shù)(n)　　　　　　HSP47mRNA　　　　　　△Ct△△Ct2-△△Ct對照側(cè)　a77．831±0．280140±0．2800．989±0．215　b76．948±0．6630．872±0．7692．057±1．074　c153．908±0．6193．912±0．61918．371±3．594造模側(cè)　A77．824±0．3100．144±0．3100．992±0．199　B77．017±0．5320．663±0．5321．678±0．645　C153．514±7．0174．036±0．56421．206±2．994

注：A(a)為正常組；B(b)為假手術(shù)組；C(c)為造模組。

表4HSP47 mRNA在各組子宮組織的相對表達(χ±S)

Table 4Relative expression of HSP47 mRNA in uterus in each group(χ±S)

組別例數(shù)(n)右側(cè)表達量左側(cè)表達量正常組70．89±1．130．93±0．21假手術(shù)組71．18±0．24#1．10±0．12#宮腔粘連組156．59±1．38?6．70±1．70?@

注：*為宮腔粘連組和假手術(shù)組、正常組相比P<0.05；#為正常組和假手術(shù)組相比P>0.05；@為造模組左側(cè)和右側(cè)相比P>0.05。

2.4三組大鼠雙側(cè)子宮內(nèi)妊娠胚胎數(shù)目比較

妊娠胚胎數(shù)，左側(cè)子宮造模組為(0.20±0.40)個，正常組為(6.30 ±1.80) 個，假手術(shù)組為(6.30 ±2.90)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.83，P<0.001)。右側(cè)子宮造模組為(4.90±2.60) 個，正常組為(5.40±1.60) 個，假手術(shù)組為(5.90±3.00) 個，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.39，P>0.05)。宮腔粘連組左側(cè)子宮為(0.20±0.40)個，右側(cè)子宮為(4.90±2.60)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.92，P<0.001)。正常組和假手術(shù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.57，P>0.05)，造模側(cè)對照組和假手術(shù)組妊娠胚胎數(shù)分別為(6.30±1.80)和(6.30±2.90)，對照側(cè)正常組和假手術(shù)組妊娠胚胎數(shù)分別為(5.40±1.60)和(5.90±3.00)，見表5。

表5各組造模側(cè)和對照側(cè)妊娠胚胎數(shù)目比較(χ±S)

Table 5Comparison of number of embryos at modeling side and control side in each group (χ±S)

子宮側(cè)別正常組假手術(shù)組造模組IUA造模側(cè)6．30±1．806．30±2．900．20±0．40對照側(cè)5．40±1．605．90±3．004．90±2．60

3討論

3.1HSP47與宮腔粘連的關(guān)系

性觀念的開放及無痛人流的廣泛開展，宮腔粘連的發(fā)病率逐年增高，宮腔粘連后子宮內(nèi)膜變少，纖維結(jié)締組織增生，宮腔變形、狹窄、體積縮小，子宮內(nèi)膜供血不足，是引起不孕、體外受精胚胎移植失敗及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的主要原因。近年來宮腔粘連的研究主要集中在治療方面，對宮腔粘連的機制和從分子生物學(xué)水平進行宮腔粘連防治研究較少。

HSP47是一類分子量為47ku的小分子多肽蛋白，是當(dāng)機體受到不良外界因素侵犯時產(chǎn)生的一種保護性應(yīng)激蛋白，為存在于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)上游的一種順式作用元件，調(diào)控纖維蛋白原的生成。其特異性底物是纖維蛋白原，它存在于可以合成膠原纖維的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)參與前膠原的裝配、折疊、修飾、轉(zhuǎn)運、活化、及分泌等過程，被稱為“分子伴侶”[6-7]。

宮腔粘連的形成有許多細胞因子參與，現(xiàn)在比較公認(rèn)的最主要的因子是TGF-β1，該因子可以激活多條信號傳導(dǎo)通路促進纖維蛋白原的異常合成增多[8-9]。周曼萍等[10]的研究也顯示 TGF-β1在 IUA 患者子宮內(nèi)膜組織中的表達明顯高于非 IUA 患者，且隨粘連程度加重而逐漸升高，進一步驗證了 TGF-β1和 IUA 的相關(guān)性，由此推測 TGF-β1的高表達可能參與了IUA 的發(fā)生發(fā)展。

TGF-β1是纖維化發(fā)生、發(fā)展中的啟動因子，對各種組織器官纖維化的形成都具有非常重要的作用，是關(guān)鍵性細胞因子[9]。Kakugawa等[11]研究顯示肺纖維化組織中HSP47與TGF-β1表達均升高，分析TGF-β1在纖維化疾病中可能是通過HSP47表達增多，使細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)纖維蛋白原產(chǎn)生過多。體外TGF-β1可以誘導(dǎo)多種細胞表達HSP47，TGF-β1也可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)HSP47的表達，是促進HSP47 表達的主要因子[9]，特發(fā)性肺纖維化急性加重期血清內(nèi)HSP47含量也增高[11]。

國內(nèi)外眾多學(xué)者研究證實，HSP47 表達與膠原分泌細胞分化及發(fā)育中的膠原蛋白數(shù)量密切相關(guān)[12]。肝纖維化的形成[13]、心衰患者心肌中膠原的合成、多種腎間質(zhì)纖維化相關(guān)疾病[14]以及病理性瘢痕形成機制中，HSP47發(fā)揮著舉足輕重的作用[15-16], HSP47在各種器官膠原異常聚集的纖維性疾病中均有所表達[7]。

本實驗采用大鼠建立宮腔粘連模型，應(yīng)用免疫組化、熒光定量PCR，測定宮腔粘連大鼠子宮HSP47蛋白和HSP47 mRNA在各組子宮內(nèi)膜組織的相對表達，結(jié)果顯示宮腔粘連組和假手術(shù)組、正常組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，假手術(shù)組和正常組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，宮腔粘連組左、右側(cè)子宮內(nèi)膜組織表達均增高，二者相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，排除了手術(shù)影響，提示宮腔粘連大鼠HSP47表達增高，進一步表明HSP47在宮腔粘連的病理過程中發(fā)揮了重要作用，HSP47可以作為膠原相關(guān)疾病治療的潛在位點，為研究防治宮腔粘連的藥物提供了新的方向。

3.2宮腔粘連對生育力的影響

宮腔粘連引起的繼發(fā)不孕是不少患者就診的首要原因。此方法造模后病理結(jié)果顯示造模側(cè)的子宮腔縮小甚至消失，膠原纖維增多，符合宮腔粘連的病理改變。

在本實驗中發(fā)現(xiàn)，交配后陰栓出現(xiàn)的時間各個組間差異不大，大鼠的造模側(cè)基本不孕，其自身對照側(cè)正常妊娠， 胚胎數(shù)目和正常的大鼠無差異，造模側(cè)和自身對照側(cè)HSP47表達差異卻沒有統(tǒng)計學(xué)差異，似乎存在矛盾。

宮腔粘連及妊娠都有眾多的細胞因子參與，各自的作用機制至今仍有很多疑問，比如NF-κB 與TGF-β1因子在妊娠、炎癥期間，都有異常的表達，但二者均有雙向調(diào)節(jié)作用，TGF-β1在誘導(dǎo)纖維化的同時也具有抗炎的作用，有報道缺乏TGF-β1的小鼠會死于廣泛的炎癥。NF-κB在多種基因的轉(zhuǎn)錄過程中起到調(diào)控作用，這些基因與免疫應(yīng)答、胚胎發(fā)育、炎癥、細胞凋亡及腫瘤等多種病理過程相關(guān)，因此與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。NF-κB是由Rel蛋白家族中兩個成員構(gòu)成的二聚體復(fù)合物。Rel蛋白家族共有5個成員，分別為RelA(P65)、NF-κB1(P50/PL05)、原癌基因C-Rel、NF-κB2(P52/PL00)、RelB，其中最常見的是P65/P50異二聚體，也是其活性的主要形式。NF-κB可促進細胞因子如TNF、IL-1等的基因轉(zhuǎn)錄，在炎癥反應(yīng)中的作用至關(guān)重要，而P50和P52同型二聚體可以抑制轉(zhuǎn)錄，因為它們不存在轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域。NF-κB活化在炎癥反應(yīng)起始階段通過促炎性基因表達可加重炎癥反應(yīng)，而在炎癥消散期，通過促凋亡基因、抗炎性基因等的表達，NF-κB活化可減輕炎癥反應(yīng)。張全等[17]研究發(fā)現(xiàn)大鼠重癥急性胰腺炎的肺損傷中細胞凋亡增加可能與NF-κB活性升高有關(guān)。杜趙康等[18]通過研究Bax、Bel-2和NF-κB在肝再生早期中的表達結(jié)果表明，NF-κB表達可能與激活Bel-2抑制肝細胞凋亡從而促進肝細胞再生有關(guān)。在雪旺細胞中，NF-κB可被神經(jīng)生長因子通過神經(jīng)營養(yǎng)受體P75激活，而P75受體在細胞生存、細胞死亡中均有作用，因此確定在這種神經(jīng)膠質(zhì)細胞中NF-κB具有抑制凋亡和促進凋亡的雙向作用[19]。

大鼠子宮有兩個獨立的宮腔，它們相對獨立又相互統(tǒng)一，在粘連與妊娠的過程中這些神秘的細胞因子如何發(fā)揮作用，還有待于更加深入的研究探索。

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