涂春艷，金愷迪，邵誠臣，劉寶年，張雅琪，謝建輝，沈憶文

（復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系，上海 200032）

環(huán)狀 RNA（circular RNA，circRNA）[1]呈環(huán)狀，是一類新發(fā)現(xiàn)的特殊RNA分子，由前體RNA轉(zhuǎn)錄后反向剪接產(chǎn)生，參與基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用。二代測序及分析技術(shù)的快速發(fā)展，使我們認(rèn)識到circRNA在生物體內(nèi)廣泛表達(dá)，可能發(fā)揮著重要的功能。circRNA穩(wěn)定，具有組織表達(dá)特異性，是分子生物學(xué)領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。近年來，circRNA作為分子生物標(biāo)記用于臨床疾病機(jī)制研究以及疾病診斷的研究報(bào)道較多，現(xiàn)對circRNA作為生物標(biāo)記用于臨床研究的現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，并對其幫助解決某些法醫(yī)學(xué)難題的應(yīng)用進(jìn)行展望，希望為circRNA在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 circRNA的一般情況

1.1 circRNA的發(fā)現(xiàn)歷程

circRNA最初發(fā)現(xiàn)于植物病毒體內(nèi)，隨后相繼在肝炎病毒及其他動物病毒中發(fā)現(xiàn)[2]，因而曾經(jīng)被認(rèn)為是病毒中特有的RNA[3]。1979年，HSU等[4]用電子顯微鏡在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了circRNA；1993年，CAPEL等[5]在小鼠精子決定基因SRY中發(fā)現(xiàn)環(huán)狀轉(zhuǎn)錄；2012年，SALZMAN等[6]通過RNA-Seq方法首次報(bào)道了人大量基因表達(dá)circRNA。至此，高通量測序技術(shù)證實(shí)了circRNA表達(dá)。隨后，大量的circRNA分子被相繼發(fā)現(xiàn)，如JECK等[7]在人類成纖維細(xì)胞中檢測出了高達(dá) 25 000多種的 circRNA；而 MEMCZAK等[8]通過RNA-seq測序結(jié)合人白細(xì)胞數(shù)據(jù)庫鑒定出1 950種人類circRNA、1903種小鼠circRNA（其中81種與人類circRNA相同）和724種線蟲circRNA。此后，關(guān)于circRNA的研究報(bào)道不斷豐富了人們對于circRNA的認(rèn)識[9-13]。

1.2 circRNA的形成機(jī)制、生物學(xué)特性和功能

circRNA呈閉合環(huán)狀；大部分屬于非編碼RNA，主要由外顯子衍生而來，且由一個(gè)或多個(gè)外顯子反向剪接形成（圖1A）；同一基因位點(diǎn)可通過選擇性環(huán)化產(chǎn)生多種circRNA（圖1B）；環(huán)化過程與mRNA剪接過程彼此競爭；缺少5′末端和3′polyA尾。因此，circRNA不易被RNA核酸外切酶等核酸酶降解，具有相對穩(wěn)定性[14]。circRNA廣泛存在于人體細(xì)胞中，JECK等[7]通過高通量測序在人的成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩千多種circRNA中，部分circRNA的表達(dá)量是線性mRNA的10倍。circRNA相對保守，在古生菌與真核細(xì)胞中均有表達(dá)。此外，EBERT等[15]的研究表明：部分circRNA分子含miRNA應(yīng)答元件，可充當(dāng)競爭性內(nèi)源RNA，與miRNA結(jié)合，在細(xì)胞中起到miRNA海綿的作用，進(jìn)而解除miRNA對靶基因的抑制作用，上調(diào)靶基因的表達(dá)水平，從而幫助闡明某些疾病的發(fā)病機(jī)制；circRNA有較高的組織表達(dá)特異性[6]，在不同組織器官中差異表達(dá)，可以根據(jù)circRNA表達(dá)變化幫助診斷相應(yīng)的組織器官疾病。然而，由于傳統(tǒng)分子檢測技術(shù)的局限性[16]，不能探查到circRNA分子。新一代測序技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展使circRNA重新走進(jìn)科研工作者的視野，并且成為分子生物標(biāo)記的研究熱點(diǎn)。

圖1 circRNA形成方式

1.3 circRNA的預(yù)測及分析

自從人們意識到circRNA的重要性以來，circRNA的預(yù)測分析技術(shù)不斷發(fā)展，現(xiàn)對其中重要并且常用的分析工具和方法進(jìn)行介紹。

1.3.1 RNA-Seq技術(shù)

最初的轉(zhuǎn)錄組研究主要以基因芯片微陣列技術(shù)為基礎(chǔ)，由于基因芯片技術(shù)的檢測范圍取決于芯片上的探針信息，所以只能檢測已知序列的特征，缺少發(fā)現(xiàn)新基因的能力。小RNA由于序列較短，同源性較高，單純利用基因芯片技術(shù)檢測非常困難。RNA-Seq測序技術(shù)由于通量高、可重復(fù)性好、檢測范圍寬、定量準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)，可以很好地彌補(bǔ)基因芯片技術(shù)在這方面的不足。RNA-Seq測序在過去十年中快速發(fā)展，促使關(guān)于生物的功能基因組研究日益興起[17]，人們利用高通量測序技術(shù)研究了從簡單模式生物（如酵母、擬南芥、水稻等）到人等一些高等物種的基因組中DNA修飾和RNA的定性定量變化等動態(tài)的基因組位點(diǎn)的特性，成為發(fā)現(xiàn)識別小RNA分子的革命性技術(shù)。

1.3.2 常用的circRNA分析工具和數(shù)據(jù)庫

目前對circRNA分子的研究還不太成熟，建立有價(jià)值的circRNA數(shù)據(jù)庫可為后續(xù)研究提供一定的參考，推動相關(guān)研究[18]。目前，較常用的circRNA分析工具很多，CIRCexplorer[19]（http://yanglab.github.io/CIRC explorer）是其中一種circRNA檢測工具，通過過濾出Tophat（一個(gè)將RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行快速剪接映射的程序）無法比對上的核酸序列，再把這些序列用Tophat-Fusion比對到基因組上。那些用Tophat-Fusion比對到基因組上的非線性候選位置的序列就是潛在的反向剪接位點(diǎn)。這些序列會在有基因注釋的幫助下，確定更加精確的供體、受體位置，最后，對circRNA進(jìn)行注釋。其優(yōu)點(diǎn)是具有高度的準(zhǔn)確性和敏感性，但是分析速度慢。

circRNA 常用數(shù)據(jù)庫主要有：（1）circBase[20]（http://www.circbase.org），由GLAZAR等開發(fā)的一個(gè)數(shù)據(jù)庫，收集并合并了大量包括人、小鼠、腔棘魚、線蟲、果蠅等成套的circRNA相關(guān)數(shù)據(jù)資料，能夠?yàn)g覽訪問和下載相關(guān)數(shù)據(jù)資料。該數(shù)據(jù)庫能夠鑒定RNA測序結(jié)果中目前已知的circRNA，可以通過互聯(lián)網(wǎng)免費(fèi)訪問網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫，但該數(shù)據(jù)庫更新不夠及時(shí)，所收錄的基因種屬種類不夠多、組織來源不夠全面。（2）Circ2Traits[21]（http://gyanxet-beta.com/circdb），是一個(gè)收集與疾病或性狀相關(guān)的circRNA數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫識別與miRNA相關(guān)的疾病和circRNA的相互作用，然后計(jì)算circRNA與疾病相關(guān)的可能性。針對特定疾病，該數(shù)據(jù)庫可以構(gòu)建預(yù)測的miRNA與蛋白編碼基因、非編碼基因以及circRNA基因的相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。此外，數(shù)據(jù)庫還能比對出疾病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）在 circRNA 上的位置，然后通過Ago分析兩者之間的相互作用。（3）deepBase[22]（http://rna.sysu.edu.cn/deepBase/），是一個(gè)研究非編碼RNA的綜合數(shù)據(jù)庫，同時(shí)收錄小RNA、長非編碼RNA以及circRNA等非編碼RNA的數(shù)據(jù)，旨在研究深度測序發(fā)現(xiàn)的各種非編碼RNA的表達(dá)形式與功能，包含了大約15萬的circRNA基因（人、鼠、果蠅、線蟲等），構(gòu)建了最全面的circRNA表達(dá)圖譜。

2 circRNA參與的生物學(xué)功能

2.1 circRNA在生物生長發(fā)育過程中的變化規(guī)律

circRNA具有組織表達(dá)特異性和發(fā)育階段的差異表達(dá)。circ-FoxO3是由轉(zhuǎn)錄子轉(zhuǎn)錄而來，在老年病人心臟樣本中高表達(dá)。DU等[23]的研究表明，circ-FoxO3作用于抗衰老因子 tID-1、E2F1、FAK和 HIF1a，抑制后者作用。GRUNER等[24]發(fā)現(xiàn)，circRNA在老齡化的小鼠大腦中富集，而所對應(yīng)的心臟中表達(dá)的circRNA沒有發(fā)現(xiàn)明顯的富集效應(yīng)，說明circRNA在腦中的富集行為可能在生長發(fā)育過程中具有特定的功能。DONG等[25]發(fā)現(xiàn)伴隨著進(jìn)化進(jìn)程，短散在核重復(fù)序列（short interspersed element，SINE）的數(shù)目明顯增多，互補(bǔ)配對的能力也逐漸提高，與此對應(yīng)的是circRNA的種類和表達(dá)量均有提高，說明circRNA與進(jìn)化過程有關(guān)。LI等[26]利用芯片技術(shù)篩選出與大鼠肝再生過程密切相關(guān)的6種關(guān)鍵circRNA分子：circ432、circ2077、circ1366和 circ15分別對應(yīng)調(diào)控 MAPK14、FN1、TNFRSF21和GOT1的表達(dá)，circ137與circ2270通過調(diào)控miR-127影響肝再生過程。

2.2 circRNA參與疾病發(fā)生的機(jī)制

以下研究表明，circRNA主要通過調(diào)節(jié)miRNA（即miRNA海綿作用）調(diào)控疾病的發(fā)生發(fā)展過程。LI等[27]對與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)的circRNA研究發(fā)現(xiàn)，ciRS-7和circSry作為miRNA海綿在阿爾茨海默病 （Alzheimer’s disease，AD）、帕金森?。≒arkinson disease，PD）等神經(jīng)退行性疾病或腦部腫瘤中致??；circMbl與強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良癥發(fā)病有關(guān)；cANRIL與腦血管疾病相關(guān)；hsa-circRNA 2149、has-circRNA 100783及circSry在神經(jīng)系統(tǒng)免疫性疾病中發(fā)揮作用等。BONIZZATO等[28]介紹了經(jīng)常導(dǎo)致血液系統(tǒng)腫瘤的染色體易位突變引入的融合性circRNA （f-circRNAs）在血液系統(tǒng)腫瘤中的作用，circRNA表現(xiàn)出的組織和細(xì)胞類型特異性特征與所對應(yīng)的基因與細(xì)胞增殖、凋亡等信號通路關(guān)系密切。ZHU等[29]通過基因敲除發(fā)現(xiàn)，circBANP在結(jié)腸癌中高表達(dá)，敲除circBANP可明顯影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。TANG等[30]描述了一個(gè)circRNA-000203調(diào)控心肌纖維化的信號通路：miR-26b-5p通過結(jié)合Col1a2和CTGF的3′UTR區(qū)，阻止后者的基因表達(dá)，CircRNA_000203結(jié)合miR-26b-5p，促進(jìn)了心肌纖維化作用有關(guān)基因的表達(dá)。WENG等[31]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸直腸癌中ciRS-7明顯高表達(dá)，且與患者的預(yù)后相關(guān)，表達(dá)高的患者預(yù)后較差，在HCT116和HT29細(xì)胞中可阻止miR-7的抑癌作用，并激活EGFR和RAF等癌基因的功能，因此認(rèn)為，ciRS-7可作為結(jié)直腸癌的標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

2.3 circRNA作為疾病診斷標(biāo)記的研究

circRNA所具有的穩(wěn)定性、組織表達(dá)特異性以及強(qiáng)大的疾病調(diào)控作用引起了臨床科研工作者對其作為某些臨床診斷困難疾病的診斷標(biāo)記的關(guān)注。高通量測序技術(shù)結(jié)合強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)分析技術(shù)以及實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)為circRNA應(yīng)用于疾病生物學(xué)標(biāo)記的研究提供了有力的技術(shù)支持。2016年，KULCHESKI等[32]對circRNA作為疾病診斷標(biāo)記進(jìn)行了可行性分析，認(rèn)為circRNA作為miRNA海綿功能分子與關(guān)節(jié)炎、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及某些類型的腫瘤均有密切關(guān)系，其相對更高的穩(wěn)定性及組織和疾病相關(guān)的差異性表達(dá)特性，可能成為相關(guān)疾病穩(wěn)定且特異的診斷標(biāo)記。同年，VAUSORT等[33]發(fā)現(xiàn)了一種心肌梗死特征性的circRNA，在外周血中檢測該circRNA可以預(yù)測左心室的功能。NAIR等[34]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA與乳腺癌分型有關(guān)，不同類型的乳腺癌特征性circRNA的差別較大，可能輔助診斷乳腺癌類型。隨后，DONG等[35]的研究有了巨大突破，該研究團(tuán)隊(duì)通過芯片技術(shù)在精液、血漿中發(fā)現(xiàn)大量全新的circRNA，其中10792種為首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，這開辟了新的circRNA研究方向，也為無創(chuàng)診斷提供了新的探索方向。CHEN等[36]在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，circPVT1可作為胃癌預(yù)后指標(biāo)，并獨(dú)立于腫瘤大小、分期等指標(biāo)，如果腫瘤分期結(jié)合circPVT1表達(dá)情況一起作為預(yù)后分析的指標(biāo)將更有價(jià)值。2017年，CHEN等[37]的研究表明，組織和血漿中hsa_circ_0000190表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析診斷可信度分別可達(dá)到0.75和0.60，而將兩者聯(lián)合后可信度可達(dá)到0.775。

3 circRNA在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用展望

死亡原因分析和死亡時(shí)間判斷是法醫(yī)病理學(xué)研究的兩大主要問題，而個(gè)體識別是法醫(yī)物證學(xué)研究的主要內(nèi)容之一。由于法醫(yī)學(xué)的研究對象主要是尸體，而機(jī)體在死后會發(fā)生各種代謝變化，這對法醫(yī)尋求可靠的分子標(biāo)記以判斷死因、推斷死亡時(shí)間以及個(gè)體識別是一大挑戰(zhàn)。circRNA具有較一般核酸分子穩(wěn)定的特性，應(yīng)該引起法醫(yī)學(xué)工作者對circRNA分子研究的重視，尋求應(yīng)用circRNA解決法醫(yī)學(xué)相關(guān)問題。

3.1 circRNA在法醫(yī)學(xué)晚期死亡時(shí)間推斷中的應(yīng)用

死亡時(shí)間推斷是法醫(yī)學(xué)鑒定中需要解決的重要問題之一。尋找靈敏、特異的檢測指標(biāo)是死亡時(shí)間特別是晚期死亡時(shí)間推斷的新思路[38-40]。核酸存在于細(xì)胞內(nèi)，所處環(huán)境相對穩(wěn)定，張志宏等[41]的研究發(fā)現(xiàn)，核酸等體內(nèi)有機(jī)物質(zhì)的降解隨著死亡時(shí)間的延長呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，因此利用分子生物學(xué)技術(shù)研究核酸降解規(guī)律用于死亡時(shí)間推斷成為近年來死亡時(shí)間推斷研究的熱點(diǎn)。mRNA雖然沒有DNA穩(wěn)定，但可以很好地彌補(bǔ)檢材缺少細(xì)胞核而檢不出DNA的問題。呂葉輝等[42-43]研究mRNA的降解規(guī)律和死亡時(shí)間的關(guān)系，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對死后不同時(shí)間的靶基因進(jìn)行定量，嘗試建立死亡時(shí)間模型以期望將該方法用于法醫(yī)學(xué)死亡時(shí)間推斷實(shí)踐中。但該研究發(fā)現(xiàn)，一般核酸分子在機(jī)體死后其含量的變化容易受環(huán)境溫度、淤血程度、細(xì)菌繁殖、疾病等的影響，這些影響會對推斷造成一定的偏差。circRNA由于自身結(jié)構(gòu)呈環(huán)狀，相對穩(wěn)定，較少受這些因素的影響，并且，這種穩(wěn)定性會使circRNA降解更緩慢[44]。因此，circRNA有望成為法醫(yī)學(xué)死亡時(shí)間推斷的可靠分子生物學(xué)標(biāo)記。

3.2 circRNA應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)疑難死因分析中的展望

一般情況下，致命性損傷、重要器官的嚴(yán)重病變或者衰老等導(dǎo)致的死亡，通過全面系統(tǒng)的尸體檢驗(yàn)以及毒（藥）物檢驗(yàn)等即能明確死因。但是，對于某些缺乏明顯病理學(xué)改變的疾病，如糖尿病等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的死亡，特別是猝死，死因分析就較為困難，此類案件往往由于缺乏明確的臨床檢查資料以及法醫(yī)病理學(xué)證據(jù)而引起糾紛。分子生物學(xué)標(biāo)記診斷是缺乏特征性病理學(xué)改變或者病理學(xué)證據(jù)不明確時(shí)的重要輔助診斷工具，這啟發(fā)法醫(yī)工作者，進(jìn)行特殊死因分析時(shí)，可探索運(yùn)用表達(dá)特異且相對穩(wěn)定的circRNA分子作為死因判斷的輔助證據(jù)。2017年，ZHAO等[45]的研究表明，檢驗(yàn)外周血中的hsa-circ-0054633可以幫助診斷糖尿病，該研究提示circRNA有助于法醫(yī)學(xué)診斷。心臟性猝死一直是法醫(yī)病理學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，因?yàn)榇祟愃劳鲚^常見，且常常缺乏明顯的、致命的病理學(xué)改變。ZHAO等[46]利用芯片法篩選到了22種變化明顯的circRNA，挑選了5種circRNA進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，hsa-circ-0124644可以作為冠狀動脈疾病診斷的標(biāo)志物。法醫(yī)學(xué)工作者可以利用此類circRNA作為生物標(biāo)記，幫助明確部分疑難案件的死因。

3.3 circRNA應(yīng)用于生物檢材來源鑒別的研究

法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，有時(shí)會遇到不明來源的組織或者疑似體液的生物檢材，一般情況下，器官和組織的來源可以通過觀察大體標(biāo)本或者組織切片進(jìn)行判斷。相比之下，體液鑒別較為困難，如果獲得的組織較少或者腐敗嚴(yán)重，組織來源就更難以判斷[47]。因此，法醫(yī)學(xué)工作者需要探索更靈敏特異的方法用于鑒別生物檢材的來源。傳統(tǒng)的生物化學(xué)和免疫分析法鑒別組織來源簡便快捷，但會破壞檢材且特異性較低。DNA沒有組織特異性，mRNA雖然靈敏性和特異性高，但相對不穩(wěn)定，不適用于陳舊或腐敗樣本[48]。由于circRNA的穩(wěn)定性和組織表達(dá)特異性，可以用于不同生物檢材的來源鑒定[49]，例如，Y染色體性別決定區(qū)特異表達(dá)的circRNA可以用于性別鑒別[50]。因此，circRNA對于生物檢材來源鑒別，特別是對于陳舊的或降解生物檢材檢測可能具有極大的應(yīng)用前景。

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