林 琳 ，張素靜 ，徐渭聰 ，3，駱如欣 ，馬 棟 ，沈 敏

（1.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；2.華東政法大學(xué)刑事司法學(xué)院，上海 200042；3.南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510515）

砷化合物可分為有機(jī)砷化合物與無機(jī)砷化合物，砷化合物的毒性因其存在形態(tài)不同各有差異。無機(jī)砷化合物毒性比有機(jī)砷化合物大，且有機(jī)砷中三價砷形態(tài)化合物毒性是五價砷形態(tài)化合物的60倍，是甲基砷化合物（如一甲基砷酸和二甲基砷酸）毒性的70倍[1]。以砷形態(tài)化合物的小鼠半數(shù)致死量（LD50）計(jì)，其毒性順序從大到小依次為：砷化氫（arsenic hydride，AsH3）、亞砷酸鹽［arsenite，As（Ⅲ）］、砷酸鹽 ［arsenate，As（Ⅴ）］、一甲基胂酸（monomethylarsonic acid，MMA）、二甲基胂酸（dimethylarsinic acid，DMA）、三甲基胂氧（trimethylarsine oxide，TMAO）、砷膽堿（arsenocholine，AsC）、砷甜菜堿（arsenobetaine，AsB）[2]，后兩者通常被認(rèn)為無毒[3]。在法醫(yī)學(xué)鑒定實(shí)踐中，一般以總砷含量作為砷中毒判別的依據(jù)。由于不同砷形態(tài)化合物的生物毒性不同[2-3]，僅以檢測總砷含量為手段來評價法醫(yī)毒物層面的砷中毒是不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?。因此，建立以砷形態(tài)化合物含量為基礎(chǔ)的新評價體系對于砷中毒的法醫(yī)學(xué)評價十分必要。

目前砷形態(tài)化合物的檢測技術(shù)通常有原子熒光光譜法[4-6]、等離子體原子發(fā)射光譜法[7]、氫化物發(fā)生-原子吸收光譜聯(lián)用技術(shù)[8]、毛細(xì)管電泳-原子熒光光譜聯(lián)用技術(shù)[9]、離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[10-15]等。高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（high-performance liquid chromatography-inductively coupled plasmamass spectrometry，HPLC-ICP-MS）聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了HPLC對復(fù)雜樣品高效的分離特點(diǎn)與ICP-MS動態(tài)線性范圍寬、檢測靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在砷化合物檢測及形態(tài)分析中得到廣泛應(yīng)用。因此，本研究擬采用該技術(shù)建立以人體生物樣本（血液、尿液）為檢材的6種砷形態(tài)化合物的分析方法，為相關(guān)案件的解決提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

7500Ce電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國Agilent公司），Infinity 1260液相色譜儀（美國Agilent公司），Milli-Q Advantage A10超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore公司），TDZ4-WS離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司），Centrifuge 5810R冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），15 mL聚丙烯試管（美國Corning公司），SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵（上海華光儀器儀表廠）。

碳酸銨［ammonium carbonate，（NH4）2CO3］，優(yōu)級純；乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate，EDTA·2Na·2H2O），色譜純；乙腈（acetonitrile），色譜純；曲拉通（triton），色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；砷形態(tài)化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)亞砷酸根離子［As（Ⅲ），1 000 mg/kg，以 As計(jì)］、砷酸根離子［As（Ⅴ），1 000 mg/kg，以 As 計(jì)］、MMA（257 mg/kg，以 As 計(jì) ）、DMA（542 mg/kg，以 As計(jì)）、砷甜菜堿（AsB，426 mg/kg，以 As 計(jì)）、砷膽堿（AsC，315 mg/kg，以 As計(jì)），均購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；空白血液由上海市血液中心提供。

1.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：分別量取 0.5mL As（Ⅲ）、As（Ⅴ）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于15 mL聚丙烯試管，加入4.5 mL 50 mmol/L EDTA·2Na·2H2O 溶液配制成 100mg/L 的 As（Ⅲ）、As（Ⅴ）標(biāo)準(zhǔn)品溶液；量取1mL MMA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于15mL聚丙烯試管，加入 1.57 mL 50 mmol/L EDTA·2Na·2H2O溶液配制成100 mg/L的MMA標(biāo)準(zhǔn)品溶液；量取1 mL DMA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于15 mL聚丙烯試管，加入4.42 mL 50 mmol/L EDTA·2Na·2H2O 溶液配制成100 mg/L的DMA標(biāo)準(zhǔn)品溶液；量取1 mL AsB標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于15 mL聚丙烯試管，加入3.26 mL 50 mmol/L EDTA·2Na·2H2O溶液配制成100 mg/L的AsB標(biāo)準(zhǔn)品溶液；量取1 mL AsC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于15 mL聚丙烯試管，加入 2.15mL 50mmol/L EDTA·2Na·2H2O 溶液配制成100mg/L的AsC標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液：各取0.5mL的砷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，添加 2 mL 50 mmol/L EDTA·2Na·2H2O 溶液配制10mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次添加適量的50mmol/L EDTA·2Na·2H2O 溶液配制成 5、2.5、1、0.5、0.3、0.15、0.1、0.05mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

50 mmol/L EDTA·2Na·2H2O 溶液：稱取 4.65 g EDTA·2Na·2H2O置于250mL容量瓶中，加入超純水溶解并定容至刻度，充分溶解。

50 mmol/L EDTA·2Na·2H2O 溶液（含 0.1%曲拉通）：量取0.5 mL曲拉通置于50 mL容量瓶中，加入超純水至刻度線，配制1%曲拉通溶液；稱取4.65 g EDTA·2Na·2H2O，量取 25 mL 1%曲拉通溶液，置于250mL容量瓶中，加入超純水至刻度，充分溶解。

100mmol/L碳酸銨水溶液（pH=9.5）：稱取碳酸銨9.60g與1000mL超純水?dāng)嚢枞芙?，再加入適量HNO3，調(diào)至pH=9.5。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

HPLC條件：Hamilton PRP-X100陰離子分析柱（4.1 mm×250 mm，10 μm）以及 PRP-X100 預(yù)柱（2.1 mm×20 mm）；以 100 mmol/L 碳酸銨水溶液（pH=9.5）和超純水作為流動相，梯度洗脫程序見表1；流速為1.0mL/min；柱溫為25℃；進(jìn)樣體積為10μL。

表1 流動相梯度洗脫程序 （%）

ICP-MS條件：射頻入射功率1 500 W，載氣為高純氬氣，載氣流速0.88 L/min，輔助氣流速0.1 L/min，射頻電壓1.71 V，采樣深度7.0 mm，泵速0.3 r/s，檢測時間0.08s，分析時間為1220s。

1.4 樣品前處理

取500 μL血液或尿液樣品與500 μL含0.1%曲拉通的50mmol/L EDTA·2Na溶液混合，渦旋30s后超聲 40 min，并以離心半徑 12 cm，3 500 r/min，離心10min，按上清液與乙腈等體積比進(jìn)行混合渦旋5min后，4℃下以離心半徑 9.5cm，14000r/min，離心 5min，取上清液直接進(jìn)樣。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

對所建立的方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，考察其線性、靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性等。

線性關(guān)系、檢測限和定量限：將不同濃度的6種砷形態(tài)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至空白血液、超純水，按1.4節(jié)前處理方法對樣品處理后，用HPLCICP-MS進(jìn)行檢測，以砷形態(tài)化合物濃度的響應(yīng)值（y）為因變量，以相應(yīng)形態(tài)砷含量（x，ng/mL）為自變量，得到各形態(tài)砷化合物的線性回歸方程及決定系數(shù)（R2），按信噪比（S/N）≥3，確定各形態(tài)砷化合物的檢測限[16]，以S/N≥10，同時滿足準(zhǔn)確度和精密度要求的樣品最低濃度為定量限。

方法準(zhǔn)確度和精密度：取空白血液、超純水500 μL，添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別配制成低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，每個質(zhì)量濃度點(diǎn)6份樣品，按照1.4節(jié)前處理方法處理，在1.3節(jié)色譜和質(zhì)譜條件下分析，連續(xù)4d，考察其方法準(zhǔn)確度、日內(nèi)精密度、日間精密度[16]。

提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)：按照MATUSZEWSKI等[17]的方法，選取空白血液為基質(zhì)，采用低、高兩個濃度點(diǎn)，以定量限為低濃度點(diǎn)，以800ng/mL為高濃度點(diǎn)，以空白血液提取后添加混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液與對應(yīng)濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積比值為基質(zhì)效應(yīng)（n=5），以空白血液提取前添加混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液與對應(yīng)濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積比值為提取回收率（n=5）。

穩(wěn)定性：本方法考察室溫穩(wěn)定性[16]，取低、中、高3個濃度點(diǎn)，每個濃度點(diǎn)6個樣品，室溫25℃放置24h，考察其室溫穩(wěn)定性。本方法同時也考察了反復(fù)凍融穩(wěn)定性，取低、中、高三個濃度點(diǎn)，每個濃度點(diǎn)6個重復(fù)質(zhì)控樣品，經(jīng)過3個反復(fù)凍融循環(huán)（-20℃到室溫25℃）：首先-20℃冷凍21 h，然后融化，室溫放置3h。分別按照1.4節(jié)前處理方法處理，在1.3節(jié)色譜和質(zhì)譜條件下分析，根據(jù)當(dāng)日工作曲線檢測樣品濃度。

2 結(jié) 果

2.1 方法優(yōu)化

2.1.1 樣品前處理優(yōu)化

由于尿液中砷形態(tài)化合物個體差異性大，且與飲食密切相關(guān)，另尿液基質(zhì)簡單，其組成95%～97%是水，因此依據(jù)現(xiàn)有HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于尿液分析的相關(guān)研究[18]，本研究以超純水為基質(zhì)添加混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液建立尿液中砷形態(tài)化合物的分析方法。

基于砷化合物易與血紅蛋白相結(jié)合的特性，本方法中的前處理?xiàng)l件中，稀釋血液、尿液樣品采用配制的含 0.1%曲拉通的 50 mmol/L EDTA·2Na·2H2O溶液，其中曲拉通具有破壞細(xì)胞的作用，EDTA·2Na·2H2O可與砷形態(tài)化合物絡(luò)合；針對沉淀血紅蛋白的試劑，分別考察了 5%～10%乙酸[12]、甲醇[2]和乙腈[9]，其中乙腈沉淀效果明顯。故選用0.1%曲拉通與50mmol/L EDTA·2Na·2H2O溶液稀釋絡(luò)合，乙腈沉淀。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

嘗試以磷酸二氫鈉和碳酸銨作為流動相，其中磷酸二氫鈉易殘留磷酸鹽，故選用碳酸銨為流動相A；考察不同濃度（50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200mmol/L）的碳酸銨溶液，結(jié)果見圖1。根據(jù)砷形態(tài)化合物的分離效果，確定流動相為100 mmol/L碳酸銨水溶液（pH=9.5）和超純水，進(jìn)行梯度洗脫。

圖1 不同濃度碳酸銨溶液作為流動相的分離效果

圖2 6種砷形態(tài)化合物的色譜圖

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 選擇性、線性范圍、檢測限、定量限

空白血液中添加6種砷形態(tài)化合物（100ng/mL）的色譜圖見圖2，其 AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）保留時間分別為 1.80、2.30、5.15、5.94、10.95、12.61min。在血液、尿液中相應(yīng)的線性范圍線性良好，其線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)、檢測限、定量限見表2～3。

表2 血液中各砷形態(tài)化合物檢測限、定量限及線性關(guān)系

表3 尿液中各砷形態(tài)化合物檢測限、定量限及線性關(guān)系

2.2.2 準(zhǔn)確度、精密度

本方法在血液和尿液的準(zhǔn)確度分別為97.2%～108.3%、93.0%～110.5%，日內(nèi)精密度分別為0.5%～4.5%、1.0%～6.4%，日間精密度分別為1.3%～6.1%、1.0%～7.1%，具體結(jié)果見表4～5。方法學(xué)驗(yàn)證要求準(zhǔn)確度滿足在85%～115%，方法精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）應(yīng)控制在 15%[16]，本方法準(zhǔn)確度、精密度均符合方法學(xué)驗(yàn)證的要求。

2.2.3 提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)

血液中砷形態(tài)分析采用空白血液直接添加砷形態(tài)化合物標(biāo)準(zhǔn)品，因此需考慮空白血液對砷形態(tài)化合物的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率。本研究結(jié)果顯示，基質(zhì)效應(yīng)為86.4%～118.2%，提取回收率為90.2%～104.7%。

2.2.4 穩(wěn)定性

考察其室溫穩(wěn)定性，血液樣品RSD為1.2%～7.3%，超純水為基質(zhì)添加混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的RSD為0.8%～3.3%。考察其反復(fù)凍融穩(wěn)定性，血液樣品反復(fù)凍融穩(wěn)定性RSD為0.8%～7.3%，超純水為基質(zhì)添加混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的樣品穩(wěn)定性RSD為0.5%～4.2%，表明砷形態(tài)化合物穩(wěn)定性良好。

表4 血液中砷形態(tài)化合物的精密度和準(zhǔn)確度

表5 尿液中砷形態(tài)化合物的精密度和準(zhǔn)確度

2.3 案例應(yīng)用

2.3.1 應(yīng)用一

死者，女，因食海鮮不適送醫(yī)救治，經(jīng)救治無效死亡，就醫(yī)期間曾注射維生素C，家屬通過網(wǎng)絡(luò)查詢，認(rèn)為維生素C與海鮮中含有的砷化合物可形成As（Ⅲ）致死，故抽樣送檢。對所取的血漿進(jìn)行砷形態(tài)檢測，檢出AsB和As（Ⅴ）兩種砷形態(tài)化合物，其中AsB檢出含量低于定量限，As（Ⅴ）含量為34.75ng/mL；采用總砷檢測方法[18]，用硝酸消解后檢測總砷含量為40.05ng/mL。

表6 食用海鮮組尿液中砷形態(tài)化合物含量（ng/mL）

2.3.2 應(yīng)用二

選取20名健康志愿者，年齡為20～30歲，男女性比例為1∶1，分為食用海鮮組和未食用海鮮組，每組男、女性各5名。食用海鮮組在3 d內(nèi)食用過海鮮類食物，未食用海鮮組為兩周內(nèi)未食用過海鮮類食物。收集兩組的尿液，檢測各砷形態(tài)化合物的含量，結(jié)果見表6～7。

表7 未食用海鮮組尿液中砷形態(tài)化合物含量（ng/mL）

2.3.3 應(yīng)用三

患者，男童，因患急性早幼粒細(xì)胞白血病送醫(yī)救治，停止服用砷劑治療2 d后采集其血樣和尿樣，其中總砷方法檢測[18]血樣中總砷含量為10.53ng/mL，尿樣中總砷含量為75.07ng/mL。本形態(tài)分析方法檢出血樣中僅有As（Ⅴ），但低于定量限，尿樣中檢出AsB、DMA、MMA、As（Ⅴ），其中 AsB、MMA、As（Ⅴ）低于定量限，DMA檢出含量為53.21ng/mL。

3 討 論

本研究建立了血液和尿液中6種極性不同的砷形態(tài)化合物的HPLC-ICP-MS檢測方法，方法檢測限低于10 ng/mL，最低定量限低于30 ng/mL，本分析方法可用于砷中毒相關(guān)案件中，結(jié)合傳統(tǒng)的總砷含量測定方法可對相應(yīng)案件進(jìn)行更有效、更準(zhǔn)確的法醫(yī)學(xué)評價。

應(yīng)用一檢測結(jié)果表明：本方法并未檢出毒性強(qiáng)的As（Ⅲ），且檢出的AsB及As（Ⅴ）砷形態(tài)化合物含量未達(dá)到致死量[19]?？偵闄z測方法檢測出的總砷含量與本方法檢測出的各砷形態(tài)化合物含量總和接近。因此，可推論該患者并不是因?yàn)樯橹卸径劳?，此案件中食用海鮮與注射維生素C在體內(nèi)并不會產(chǎn)生As（Ⅲ）。

應(yīng)用二中，食用海鮮組尿液中有2例檢測出As（Ⅲ）砷形態(tài)化合物，但低于定量限，未食用海鮮組尿液中未檢出As（Ⅲ）；食用海鮮組尿液中檢出AsB平均含量是未食用海鮮組的2.38倍，DMA平均含量是未食用海鮮組的1.89倍；食用海鮮組尿液中7例檢出MMA，而未食用海鮮組中僅4例檢出MMA；無嚴(yán)重的砷暴露情況下，尿液中總砷含量為5～50 ng/mL[20]，而食用海鮮組中有1人總砷含量為76.97ng/mL。綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，志愿者尿液中均含有內(nèi)源性的砷形態(tài)化合物，食用海鮮組總砷含量高于未食用海鮮組，證實(shí)食用海鮮類產(chǎn)品會導(dǎo)致尿液中總砷含量增加，尿液中砷形態(tài)化合物含量與食用海鮮存在一定的關(guān)聯(lián)；食用海鮮組尿液中檢出的砷形態(tài)化合物主要是有機(jī)砷化合物，雖有2例檢出As（Ⅲ），但無機(jī)砷化合物總含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于中毒量，從而進(jìn)一步證實(shí)，海鮮中砷化合物90%以上為有機(jī)砷化合物[21]，對人體并不會造成器質(zhì)性損害。

應(yīng)用三的檢測結(jié)果符合文獻(xiàn)報道[20]中研究成果：砷化合物在血液中代謝較為快速，在幾小時后即可消除，而尿液中砷化合物半衰期較長，約為4d。其次，本研究所建立的砷化合物形態(tài)分析方法可闡明注射砷劑［As（Ⅲ）］進(jìn)入人體后的代謝過程。 As（Ⅲ）在人體內(nèi)進(jìn)行甲基化反應(yīng)，代謝產(chǎn)物主要為DMA，符合報道[20]中As（Ⅲ）代謝機(jī)理。本研究證明，該形態(tài)分析方法實(shí)時監(jiān)測相關(guān)急性早幼粒細(xì)胞白血病患者治療過程中砷劑體內(nèi)代謝的可行性，可根據(jù)其檢測結(jié)果制定或調(diào)整砷劑治療方案。

通過上述案例應(yīng)用，本研究可以檢測6種砷形態(tài)化合物在體內(nèi)的含量，與總砷檢測方法結(jié)合可以檢測樣本中總砷和砷形態(tài)化合物，兩者相互印證為司法鑒定提供可靠、科學(xué)的數(shù)據(jù)支持。

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